Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Au-Interaktion af SLP1 Polymerer og Monolayer fra Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

På grund af den stigende brug af guld til flere applikationer som elektronik, katalysatorer, biosensorer, eller medicinske instrumenter, er efterspørgslen af denne ædle metaller vokset i de seneste få år 6-9. Guld samt mange andre ædel- og tungmetaller frigives i miljøet via industrielt spildevand i fortyndede koncentrationer gennem minedrift, og bortskaffelse 7,8,10, selv om de fleste miljøforurening ved tunge eller ædelmetaller er en løbende proces primært forårsaget af teknologiske aktiviteter. Dette fører til en signifikant interferens af naturlige økosystemer og kan potentielt true menneskers sundhed 9. Kendskab til disse negative resultater fremmer søgningen efter nye teknikker til at fjerne metaller fra forurenede økosystemer og forbedringer i genbrug metaller fra industrispildevand. Veletablerede fysisk-kemiske metoder som udfældning eller ionbytning er ikke så effektive, især i højly fortyndet løsninger 7,8,11. Biosorption, enten med levende eller døde biomasse, er et attraktivt alternativ til spildevandsrensning 10,12. Anvendelsen af ​​sådanne biologiske materialer kan reducere forbruget af giftige kemikalier. Mange mikroorganismer er blevet beskrevet at akkumulere eller immobilisere metaller. For eksempel, celler af Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 har vist høje bindingskapaciteter for ædelmetaller, f.eks, Pd (II), Pt (II), Au (III), og andre giftige metaller som Pb (II) eller U (VI) 4,13, celler af Bacillus megaterium til Cr (VI) 14, celler af Saccharomyces cerevisiae til Pt (II) og Pd (II) 15 og Chlorella vulgære for Au (III) og U (VI) 16 , 17. Bindingen af metaller som tidligere Au (III), Pd (II), og Pt (II) er også blevet rapporteret for Desulfovibrio desulfuricans 18 og for L. sphaericus JG-B53 19,20. Ikke desto mindre, ikke all mikrober binder store mængder af metaller og deres anvendelse som sorptivt materiale er begrænset 12,21. Endvidere metalbindende Kapaciteten afhænger af forskellige parametre, f.eks cellesammensætning, den anvendte bio-komponent eller miljø- og eksperimentelle betingelser (pH, ionstyrke, temperatur etc.). Undersøgelsen af isolerede cellevægsfragmenter 22,23, som membranlipider, peptidoglycan, proteiner eller andre komponenter, hjælper til at forstå den metalbindende processer komplekse konstrueret helceller 8,21.

Cellekomponenterne fokuseret på i denne undersøgelse, er S-lag-proteiner. S-lag-proteiner er dele af den ydre cellekappen af ​​mange bakterier og archaea, og de udgør ca. 15 - 20% af det totale protein masse af disse organismer. Som den første grænseflade til miljøet, disse celle forbindelser stor indflydelse de bakterielle sorptionsegenskaberne 3. S-lag-proteiner med molekylvægte i området fra fyrretil hundredvis af kDa produceres i cellen, men er samlet uden for hvor de er i stand til at danne lag på lipidmembraner eller polymere cellevægsbestanddele. Når isolerede, næsten alle S-lag-proteiner har den iboende egenskab til spontant samle i suspension, ved grænseflader, eller på overflader, der danner plane eller rørlignende strukturer 3. Tykkelsen af proteinet monolag afhænger af bakterier og er inden for en afstand af 5 - 25 nm 24. Generelt kan de dannede S-layer proteinstrukturer har en skrå (p1 eller p2), firkantet (p4) eller sekskantede (P3 eller P6) symmetrisk med gitterkonstanternes på 2,5 til 35 nm 3,24. Gitter formation synes at være i mange tilfælde er afhængige af divalente kationer og hovedsagelig på Ca2 + 25,26, Raff, J. et al. S-lags baserede nanokompositter til industrielle applikationer i protein-baserede Engineered nanostrukturer. (red Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (indsendt)). Ikke desto mindre, den fulde reaktionskaskaden af monomer foldning, monomer-monomer interaktion, dannelsen af et gitter, og den rolle, forskellige metaller, især af divalente kationer, såsom Ca2 + og Mg2 +, er endnu ikke fuldt forstået.

Den grampositive stamme L. sphaericus JG-B53 (omdøbt fra Bacillus sphaericus efter nye fylogenetiske klassifikation) 27 blev isoleret fra uranbrydning affald bunke "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Sachsen, Tyskland) 4,28,29. Dets funktionelle S-lag protein (SLP1) har en kvadratisk gitter, en molekylvægt på 116 kDa 30, og en tykkelse på ≈ 10 nm på levende bakterieceller 31. I tidligere undersøgelser blev det in vitro dannelse af et lukket og stabilt protein lag med en tykkelse på ca. 10 nm opnås på mindre end 10 min 19. Den relaterede stammen L. sphaericus JG-A12, også et isolat fra "Haberland" bunke, har høj metalbindende kapacitet og dets isolerede S-lag protein har vist en høj kemisk og mekanisk stabilitet og god sorption for ædelmetaller som Au (III), Pt (II), og Pd (II) 4,32,33. Denne binding af ædelmetaller er mere eller mindre specifikke for nogle metaller og afhænger af tilgængeligheden af ​​funktionelle grupper på den ydre og den indre overflade protein af polymeren og i dets porer, ionstyrke og pH-værdien. Relevante funktionelle grupper for interaktion metal ved proteinerne COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 - og SO-. I princippet metalbindende kapacitet åbner et bredt spektrum af anvendelser, Raff, J. et al. S-lags baserede nanokompositter til industrielle applikationer i protein-baserede Engineered nanostrukturer. (red Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (indsendt)). fx som biosorptive komponenter til fjernelse eller nyttiggørelseaf opløste giftige eller værdifulde metaller, skabeloner til syntese eller defineret aflejring af regelmæssigt strukturerede metalliske nanopartikler (NPS) for katalyse, og andre bio-manipuleret materialer som bio-sensorisk lag 3,5,18,33. Regelmæssigt arrangeret NP arrays som Au (0) -NPs kunne bruges til større applikationer spænder fra molekylær elektronik og biosensorer, ultrahøje lagringstæthed enheder og katalysatorer for CO-oxidation 34-37. Udviklingen af ​​sådanne applikationer og smart design af disse materialer kræver en dybere forståelse af de underliggende metal bindende mekanismer.

En forudsætning for udviklingen af sådanne biobaserede materialer er pålidelig gennemførelse af et grænsefladelag mellem biomolekylet og tekniske overflade 38,39. For eksempel, polyelektrolytter samlet med lag-på-lag (LbL) teknik 40,41 er blevet anvendt som et grænsefladelag for omkrystallisation af S-lags proteiner 39 19,42, Raff, J. et al. S-lags baserede nanokompositter til industrielle applikationer i protein-baserede Engineered nanostrukturer. (red Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (indsendt)). Imidlertid er kompleks mekanisme af proteinet adsorption og protein-overfladeinteraktion ikke helt forstået. Især oplysninger om kropsbygning, mønster orientering, og coating tætheder mangler stadig.

Kvartskrystalmikrovægt med spredning overvågning (QCM-D) teknik har tiltrukket sig opmærksomhed i de senere år som et redskab til at studere proteinadsorption, belægning kinetik, og interaktion proprocesser på nanometer skala 19,43-45. Denne teknik giver mulighed for detaljeret påvisning af masse adsorption i realtid, og kan anvendes som en indikator for proteinet selvsamlende proces og kobling af funktionelle molekyler på protein gitre 19,20,42,46-48. Desuden QCM-D målinger åbner mulighed for at studere interaktion metal processer med det proteinholdige lag under naturlige biologiske forhold. I en nylig undersøgelse, interaktionen af S-fase-protein med udvalgte metaller som Eu (III), Au (III), Pd (II), og Pt (II) er blevet undersøgt med QCM-D 19,20. Det adsorberede protein lag kan tjene som en forenklet model af en cellevæg grampositive bakterier. Undersøgelsen af ​​denne enkelt komponent kan bidrage til en dybere forståelse af samspillet metal. Men alene QCM-D forsøg, der ikke tillader udsagn om overfladestrukturer og påvirkninger af metaller til protein. Andre teknikker er nødvendige for at indhente disse oplysninger. Én posligheden for billedbehandling bio-nanostrukturer og indhente oplysninger om strukturelle egenskaber er den atomare kraft mikroskopi (AFM).

Formålet med den præsenterede undersøgelse var at undersøge sorptionen af guld (Au (III) og Au (0) -NPs) til S-lag-proteiner, navnlig SLP1 L. sphaericus JG-B53. Eksperimenter blev udført med suspenderede proteiner på batch målestok i et pH-område på 2,0 - 5.0 ved hjælp af ICP-MS og med immobiliserede S-lag ved hjælp af QCM-D. Desuden blev indflydelsen af ​​metalsalt løsning på gitteret stabilitet undersøgt med efterfølgende AFM undersøgelser. Kombinationen af disse teknikker bidrager til en bedre forståelse af in vitro-interaktion metal processer som et redskab til at lære mere om bindende begivenheder på hele bakterieceller vedrørende specifikke metal tilhørsforhold. Denne viden er ikke kun afgørende for udviklingen af ​​gældende filtermaterialer til udvinding af metaller til miljøbeskyttelse og bevarelse af rekilder 49, men også for udviklingen af arrays af stærkt bestilt metalliske NP'er til forskellige tekniske applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mikroorganismen og dyrkningsbetingelser

Bemærk:. Alle forsøg blev udført under sterile forhold L. sphaericus JG-B53 blev opnået fra en cryo-bevarede kultur 29,30.

  1. Transfer kryo-konserverede kultur (1,5 ml) under rent bænken til 300 ml sterilt næringsmedium (NB) media (3 g / l kødekstrakt, 5 g / L pepton, 10 g / l NaCl). Bagefter omrøres opløsningen i mindst 6 timer ved 30 ° C til opnåelse af forkultur til dyrkning.
  2. Dyrke bakterierne under aerobe betingelser i NB medier ved pH = 7,0, 30 ° C i en 70 L skaleret damp-på-stedet bioreaktor. Derfor fylde reaktoren med ≈ 57 L deioniseret vand. Tilføj og opløse fast NB medier direkte i bioreaktor (koncentrationer se ovenfor).
    1. Derudover tilføjer antiskummiddel (30 ul / L NB-medier) til medierne for at undertrykke dannelsen skum under dyrkning, derefter autoklaveres (122 ° C, temperatur holdetid 30 min) medierneinde i reaktoren anlægget.
  3. Køl ned medierne og udføre komplet iltmætning. PH justeres til 7,0 (ved anvendelse af 1 MH 2 SO 4 og 2 M NaOH) og starte den automatiske inokulering af 300 ml forkultur. Start dataregistrering af dyrkningsmetoder parametre ved podning punkt. Log online parametre f.eks opløst ilt niveau (DO 2), syre og base kommer, og pH-værdier inden for dyrkning.
    1. Overvåg bakterievækst online af de ikke-invasive turbiditetsmålinger.
  4. Udføre yderligere prøvetagning efter hver time til dyrkning og bestemme yderligere parameter såsom bio tørvægt (BDW) og offline optiske densitet (OD). Derfor samler 20 ml dyrkning bouillon ved hvert prøvetagningssted under sterile forhold.
    1. Bestem offline OD ved fotometriske målinger af adsorptionen ved 600 nm. Brug sterilt filtreret NB-medium som en tom værdi. AftER nå adsorption> 0,4 ​​fortyndet cellesuspensionen efter linearitet Lambert-Beer.
    2. Til bestemmelse af BDW centrifuge 1 til 5 ml bakteriesuspension (afhængigt af celletæthed) ved 5000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Tør den opnåede cellepellet ved 105 ° C i en varmeovn op til massen stabilitet og måle pellet masse.
  5. Tag mikroskopiske billeder med optisk fase kontrast forskning mikroskop i 400 og 1.000 gange forstørrelse (fase kontrast kondensator 2 og 3) til kontrol af den bakterielle vækst og som en kontrol krydskontaminering.
  6. Efter at have nået den eksponentielle vækstfase detekteres ved online DO2 og online turbiditet, høste biomassen ved gennemstrømning centrifugering ved 15.000 xg, 4 ° C og vask biomassen to gange med standard buffer (50 mM TRIS, 10 mM MgCl2, 3 mM NaN3, pH = 7,5).
    Bemærk: Den opnåede biomasse pellet kan opbevares ved -18 & #176; C indtil videre brug for isolation.

2. S-lag Protein Isolering og oprensning

Bemærk: Der renses SLP1 polymerer ifølge en tilpasset fremgangsmåde som beskrevet tidligere 2,19,30,32,50,51.

  1. Homogenisere vasket og optøet rå biomasse opnået fra dyrkning i standard buffer (1: 1 (w / v)) for at fjerne flageller ved hjælp af en disperser (niveau 3, 10 min) under afkøling i isbåd ved 4 ° C.
  2. Centrifuger suspensionen (8.000 xg, 4 ° C i 20 minutter) og vaskes den opnåede pellet to gange med standard puffer (1: 1 (vægt / volumen)). Efter vask og centrifugering (8.000 x g, 4 ° C i 20 minutter), pellet resuspenderes i standard buffer (1: 1 (vægt / volumen)), tilsættes DNase II og RNase (0,4 enheder / g biomasse) til suspensionen, og disintegrere cellerne ved 1.000 bar med en højtrykshomogenisator. Bagefter centrifugeres suspensionen ved 27.500 xg, 4 ° C i 1 time.
    Bemærk: Kontrol celle suspension med forsknings- microscope. Brud er fuldført, når mindre end 2 - 3 intakte celler er synlige i visningen på mikroskopet i 400 gange forstørrelse.
  3. Vask pelleten to gange med standard puffer (1: 1 (vægt / volumen)) og udfører centrifugering igen. Bagefter pellet resuspenderes i standard buffer (2: 1 (w / v)) blandet med 1% Triton X-100 og inkuberes det for 20 min under successiv rystning (100 rpm) at solubilisere lipidaflejringer.
  4. Centrifuger opløsningen (27.500 xg, 4 ° C i 1 time) og vaskes de opnåede pellet tre gange med standard puffer (1: 1 (vægt / volumen)).
  5. Inkubér pelleten opnået efter yderligere centrifugering (27.500 x g, 4 ° C i 1 time) i 6 timer i standard buffer (1: 1 (w / v)) blandet med 0,2 g / l lysozym, at hydrolysere bindinger i peptidoglycan 50. Derudover tilføje DNase II og RNase (hver 0,4 enheder / g biomasse) til suspensionen.
  6. Efter centrifugering (45.500 x g, 4 ° C, 1 time), resuspender øverste hvide protein fase med en lav volumen than centrifugeringssupernatanten (<30 ml) indeholdende protein-subunits.
  7. Solubilisere den hvide suspension ved at blande 1: 1 med 6 M guanidinhydrochlorid (6 M GuHCI, 50 mM TRIS, pH = 7,2). Løsningen bliver lyse.
  8. Udfør sterilfiltrering (0,2 um) af GuHCl behandlede opløsning efterfulgt af en yderligere højhastighedscentrifugering (45.500 xg, 4 ° C i 1 time).
  9. Overfør supernatanten til dialysemembran rør (MWCO 50.000 Dalton) og dialyseres den mod omkrystallisation buffer (1,5 mM TRIS, 10 mM CaCl2, pH = 8,0) i 48 timer.
  10. Overfør det hvide omkrystalliseret protein polymeropløsning i rør og centrifugeres ved 45.500 xg, 4 ° C i 1 time. Pellet resuspenderes i et lille volumen af ​​ultrarent vand (<30 ml).
  11. Bagefter Suspensionen overføres dialysemembran rør og udføre en dialyse mod ultrarent vand i 24 timer for at fjerne puffer indhold.
    Bemærk: Flere ændringer af buffer eller ultrarent vand dnder dialyse er uundværlige.
  12. Lyofilisere oprenset SLP1 i en frysetørrer.

3. Karakterisering og kvantificering af SLP1 til eksperimenter

Bemærk: SLP1 koncentration for sorption og coating forsøg blev kvantificeret ved UV-VIS spektrofotometri.

  1. Afpipetteres 2 pi af opløst SLP1 prøve direkte på nederste måling piedestal af fotometer. Bestem proteinkoncentrationen ved maksimal adsorption ved en bølgelængde på 280 nm, karakteristisk for proteiner. Brug ekstinktionskoefficienten for 0,61 at bestemme SLP1 koncentration. Brug SLP1 gratis løsning til referencemålinger.
  2. Fortynd proteinet med bufferen (for sorptionsforsøg i batch-mode anvender 0,9% NaCl, pH = 6,0, og for QCM-D eksperimenter bruger omkrystallisation, pH = 8,0) til den ønskede koncentration til eksperimenter (1 g / l og 0,2 g / L henholdsvis).
  3. Analyser SLP1 kvalitet og molekylvægten af ​​standarden bioanalytical fremgangsmåde natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese elektroforese (SDS-PAGE) beskrevet af Laemmli, UK 52.
    1. Udfør SDS-PAGE, før du bruger SLP1 inden eksperimenter og fx efter Au (0) NP inkubation med 10% polyacrylamid adskillelse geler.
    2. For SDS-prøver mix ≈ 10 pi dyrkningen eller proteinprøven med prøvepuffer (1,97 g TRIS, 5 mg bromphenolblåt, 5,8 ml glycerol, 1 g SDS, 2,5 ml β-mercaptoethanol, fyldes med ultrarent vand til 50 ml) i et forhold på 1: 1 (v / v), og der pipetteres blandingen efter 4 minutters inkubering ved 95 ° C i gelen lommer.
    3. Kør SDS-PAGE 30 minutter ved en spænding på 60 V, indtil prøverne passerer indsamling gel og ændre spændingen til 120 V, når passerer adskillelse gel.
    4. Fjern gelerne fra gelen systemet, skyl med ultrarent vand og sted i 1 time i fikseringsopløsning (10% sure syre, 50% absolut ethanol). Bagefter skylles gelerne med ultrarent vand.
    5. Stain gelerved hjælp af en tilpasset uspecifik kolloid Coomassie brilliant blue metode 53,54. Efter affarvning 72,73, tage SDS-PAGE billeder ved gelen dokumentation ifølge producentens protokol.

4. sorption Eksperimenter i batch-mode og Metal Kvantificering

  1. For batch sorptionsforsøg forberede Au (III) stamopløsning fra HAuCl 4 ∙ 3 H2O, fortyndes metalsaltet og bland det med SLP1 / NaCl-opløsning til en startkoncentration metal på 1 mM og sidste SLP1 koncentration på 1 g / l . Udfør eksperimenter i tripletter med en yderligere negativ kontrol uden SLP1. Brug et samlet volumen på 5 ml for sorptionsforsøg.
  2. Ryst suspensionen kontinuerligt ved stuetemperatur ved forskellige forjusterede pH-værdier mellem 2,0 til 5,0 i 24 timer (justering af pH med lavt koncentreret HCI og NaOH-opløsning).
  3. Efter sorption, centrifugeres prøverne ved 15.000 xg, 4 ° C i 20 minutter) til separspiste SLP1 fra supernatanten.
  4. Supernatanten overføres til ultrafiltrering rør (MWCO 50.000 Da) og centrifugeres ved 15.000 dette xg, 4 ° C i 20 minutter til fjernelse af opløste protein monomerer.
  5. Bestemme koncentrationen metal i det resulterende filtrat ved ICP-MS 19,20 og bruge resultaterne for back-beregning af sorberet metal ved SLP1 tørvægt. Måleprincipper, blev muligheder for fremgangsmåden og komponenterne i den brugte ICP-MS beskrevet i litteraturen 55.
    1. Forbered prøver og referencer for ICP-MS målinger under anvendelse af 1% HNO 3 som matrix og rhodium som en intern standard (1 mg / ml).

5. Syntese af Au-NP og Bestemmelse af Particle Size

Bemærk: Citrat stabiliseret Au (0) NP blev syntetiseret ifølge en tilpasset fremgangsmåde tidligere beskrevet af Mühlpfordt, H. et al. (1982) til opnåelse af sfæriske partikler med en diameter på 10 - 15 nm 56,57

  1. Forbered en stabiliseret 25 mM HAuCl 4 ∙ 3 H2O materiel til NP formation.
  2. Fortynd 250 pi af denne stamopløsning i 19,75 ml ultrarent vand og inkuberes disse ved 61 ° C i 15 minutter under omrystning hinanden.
  3. Forbered 5 ml af en anden stamopløsning (12 mM garvesyre, 7 mM natriumcitrat di-hydrat, 0,05 mM K 2 CO 3) og inkuber 2 nd opløsningen adskilt ved 61 ° C i 15 minutter.
  4. Tilføj under konstant omrøring 2. stamopløsning til opløsning én. Omrør reaktionsblandingen i mindst 10 minutter ved 61 ° C. Bagefter afkøle opløsningen og bruge det til NP belægning på SLP1 gitter inden QCM-D eksperimenter.
    Bemærk: Den resulterende Au (0) NP blev karakteriseret med UV-VIS spektroskopi på højst 520 nm, der typisk anvendes til påvisning af dannede Au (0) -NPs 58 absorbans. Opløsningen kan opbevares ved 4 ° C.
  5. Analyse af størrelsen af ​​den dannedeAu (0) NP ved fotonkorrelationsspektroskopi (PCS), der også er kendt som dynamisk lysspredning.
    1. Til bestemmelse af NP størrelse, overføres 1,5 ml syntetiseret Au (0) NP opløsningen i kuvetter under støvfrie forhold i en laminar strømning kasse og analysere den med en størrelse og zeta-potentialet Particle Sizer. En detaljeret beskrivelse af PCS og prøveforberedelse er givet i Schurtenberger, P. et al. (1993) 59 og Jain, R. et al. (2015) 60.

6. QCM-D Eksperimenter - SLP1 Belægning på overflader og Au-NP adsorption på SLP1 Lattice

Bemærk: Målinger blev udført med en QCM-D er udstyret med op til fire flow moduler. Alle QCM-D eksperimenter blev udført med en konstant strømningshastighed på 125 ul / min ved 25 ° C. SLP1 belægning og metal / NP inkubation blev udført på SiO2 piezoelektriske AT-cut kvarts sensorer (Ø 14 mm) med en grundlæggende frekvens på ≈ 5 MHz. Skylning trin og tilføjeition af løsning er markeret med tallene for det repræsentative resultater del. De QCM-D eksperimenter kan beskrives som en trin for trin måde begynder med rensning og overfladebehandling af de anvendte sensorer, efterfulgt af SLP1 omkrystallisering og senere på metallet og metal NP interaktion.

  1. Rengøring Procedure:
    1. Udstyre fluidumceller med sensor dummies. Pumpe mindst 20 ml (hver per modul) af et alkalisk flydende rensemiddel (2% sæbe i ultrarent vand (v / v)) gennem QCM-D og rørsystem. Bagefter pumpe femdobbelte volumen (hver pr modul) ultrarent vand gennem systemet (strømningshastighed på op til 300 pl / min). Udfør rengøring ifølge fabrikantens protokol.
    2. Rengør SiO 2 sensorer uden for flow moduler ved inkubering (mindst 20 min) i 2% SDS-opløsning og skyl sensorerne bagefter flere gange med ultrarent vand 61,62.
    3. Tør krystaller med filtreret compressed luft og placere dem i en ozon rensekammeret i 20 min 63,64.
    4. Gentag rengøringen procedure to gange for at fjerne alle organiske indhold.
    5. For at fjerne bundne metaller fra sensoren overfladen skylles sensorerne med 1 M HNO 3. Bagefter udføre alle skylletrin med ultrarent vand.
  2. Sensor Surface Ændring af polyelektrolyter:
    Bemærk: Overflademodifikation kan ske enten inden (gennemstrømning procedure) eller uden for flow modul (LbL teknik). Inden for disse eksperimenter på følgende måde for at ændre overfladerne blev anvendt.
    1. Ændre sensorerne med 3 g / l vekslende PE lag af polyethylen imin (PEI, MW 25.000) og polystyren sulfonat (PSS, MW 70.000) via dyppecoating hjælp LbL teknik 40,41 beskrevet tidligere for den særlige anvendte system i artiklen af Suhr, M. et al. (2014) 19.
    2. Placer sensorerne inde i passende PE-opløsning i dyb well plader og inkuberes disse i 10 min ved stuetemperatur.
    3. Tag sensorerne ud af PE-løsning, og skyl sensorerne mellem hvert belægning skridt dip intensivt med ultrarent vand.
      Bemærk: Den nye overflademodifikation består af mindst tre lag PE ender med positivt ladede PEI.
    4. Efter denne eksterne modifikation placere sensorerne inden i flow-modulet og tempereres sensorerne ved skylning med ultrarent vand før påbegyndelse af eksperimenterne.
  3. SLP1 Monolayer Omkrystallisation:
    1. Opløs SLP1 i 4 M urinstof til konvertering polymerer til monomerer.
    2. Centrifuger monomerized proteiner ved 15.000 xg, 4 ° C i 1 time for at fjerne større protein agglomerater.
    3. Bland det solubiliserede og centrifugeret SLP1 supernatanten med omkrystallisation puffer til en endelig proteinkoncentration på 0,2 g / L.
      Bemærk: calcium afhængig omkrystallisation af SLP1 (selv-samling) starter ved tilsætning af recrystallization buffer. Derfor pumpe den blandede opløsning med en strømningshastighed på 125 ul / min til sensorerne (placeret inde flow moduler) omgående. Omkrystallisationen sker efter stabile værdier af frekvens og spredning skift blev opdaget inden for QCM-D eksperimenter.
    4. Efter en vellykket protein omkrystallisation oven på PE-modificerede sensorer inde i flow moduler skylles de overtrukne sensorer med omkrystallisation buffer eller ultrarent waterintensively med en strømningshastighed på 125 ul / min, indtil stabile værdier af frekvens og spredning skift blev påvist.
      Bemærk: Den SiO2 overfladebehandling med PE for senere sorptionsforsøg onto SLP1 monolags- og AFM studier visualiseres i figur 1.

Figur 1
Figur 1. Skematisk Design af PE-Surface Ændring og SLP1 MonolayerBelægning; Dette tal er blevet ændret fra Suhr, M. et al. (2015) 19 med tilladelse fra Springer. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Metal og Metal NP Interaktion:
    Bemærk: sorption med Au metalsaltopløsningen (HAuCl 4 ∙ 3 H2O) blev udført i koncentrationer på 1 mM eller 5 mM ved pH = 6,0 i 0,9% NaCI-opløsning. Au-NP adsorption blev udført med ufortyndet au-NP'er i 1,6 mM tri-natrium-citrat buffer ved pH ≈ 5,0.
    1. Efter vellykket SLP1 belægning i flow moduler, skylles det opnåede SLP1 laget intensivt med 0,9% NaCl opløsning, indtil stabile værdier af frekvens og spredning skift blev opdaget.
    2. Pump den fremstillede metal-opløsning (1 mM) og NP løsning på de flow moduler med en strømningshastighed på 125 ul / min og spore massen adsorption til Slp1 lag. Masse adsorption kan påvises direkte ved at spore frekvensskift henviser til Sauerbrey (ligning 1).
    3. Efter at have afsluttet interaktion metallet og metal NP, skylles laget med metal / NP fri buffer til at fjerne svage bundne eller svage vedhæftede metaller eller nanopartikler.
      Bemærk: En illustration af forsøgsopstillingen er vist i figur 2.

Figur 2
Figur 2. Skematisk Design af QCM-D opsætning ved hjælp af Flow Modul QFM 401 * 66. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Data, registrering og vurdering:
    1. Optage skift i frekvens i Hz (Af-n) og spredning (AD n) Inden for QCM-D eksperimenter ved hjælp af QCM-D specifik software.
    2. Anvendelse til vurdering af den adsorberede masse følsomhed (AM) i Sauerbrey ligningen / model (ligning 1) 65 66, der er gældende for tynde og stive film koblet uden friktion til sensoren overflade påføres n th overtone. Udtrykket C (Sauerbrey konstant) for den anvendte 5 MHz ved cut kvarts sensoren er 17,7 ng ∙ Hz -1 ∙ cm -2 68. For stiv, jævnt fordelt, og tilstrækkeligt tynde adsorberede lag bruger ligning 1 som en god tilnærmelse.
      Ligning 1
    3. Udføre yderligere modellering i henhold til Kelvin-Voigt model gældende for viskoelastiske molekyler 68-71 med producenten specifik software og sammenligne resultaterne med den Sauerbrey modellen.
    4. Til beregning af lagtykkelsen og masse adsorption brugså vigtig parameter modellering et lag tæthed af det adsorberede lag af 1,35 g ∙ cm -3 svarende til værdier beskrevet tidligere for S-lag-proteiner 72-75. Anvend den samme værdi til beregning af interaktion metal med det proteinholdige lag.

7. AFM Målinger

  1. Foretage undersøgelser med fuldt ud i stand AFM på en inverteret optisk mikroskop.
    1. Optag AFM billeder i flydende ved hjælp af omkrystallisation buffer eller ultrarent vand direkte på de overtrukne QCM-D sensorer.
    2. Skyl sensorerne med ultrarent vand efter QCM-D eksperimenter og placere dem inde i AFM flydende celle. Derfor anvende et lukket fluid celle med et samlet volumen på ca. 1,5 ml. Holde temperaturen af ​​fluidet cellekonstant ved 30 ° C.
    3. Brug en fritbærende med en resonansfrekvens ≈ 25 kHz i vand og en stivhed på <0,1 N / m. Juster scanningshastighed mellem 2,5 og 10 um / sek.
      4. 76.
      Bemærk: Højde billeder vises med z-skalaen, mens z-værdierne repræsenterer den nøjagtige topografi af overfladen. Amplitude (Pseudo 3D) billeder vises uden z-skala, fordi amplitude z-værdier afhænger scanningsparametre og bære begrænsede oplysninger. Analyse af billeder, blev udført ved hjælp af tre forskellige evaluering softwarens 77.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dyrkning af mikroorganismer og SLP1 Karakterisering

De registrerede data for bakterievækst angiver slutningen af ​​den eksponentielle vækstfase på omkring 5 timer. Tidligere undersøgelser har vist, at SLP1 kan isoleres fra denne høsttidspunktet (4,36 g / l våd biomasse (≈ 1,45 g / L (BDW)) med et maksimalt udbytte 19. Ikke desto mindre, optimering af dyrkning ved hjælp af definerede medier komponenter eller føderalistiske dyrkning parti strategier vil føre til højere biomasse udbytter. Dette er umistelig for brug af høj mængde biomasse til industrielle applikationer. Værdierne fra online og offline indspillede dyrkningsmetoder parametre er opsummeret i figur 3A. Mikroskopisk kontrol (figur 3B) på det tidspunkt høst viser ikke-sporulerede celler L. sphaericus JG-B53.


Figur 3: (A) online og offline målt dyrkningsparametre L. sphaericus JG-B53 og (B) mikroskopisk billede af vitale bakterieceller L. sphaericus JG-B53 på tidspunktet for høst i 400 gange forstørrelse; Dette tal er blevet ændret fra Suhr, M. et al. (2014) 19 med tilladelse fra Springer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Også en yderligere gjort SDS-PAGE proteinprofil (figur 4A) angiver den maksimale mængde SLP1 på tidspunktet for 5 timers dyrkning. Proteinet bånd svarende til SLP1 (≈ 150 kDa) er tykkere, men herfra på et tab i intensitet blev observeret accompanIED af en stigning i proteiner med lavere molekylvægt på grund af mulige proteinfragmentering eller adskillelse af andre proteiner. Båndene af isolerede og oprensede proteiner opnået ved ovennævnte (figur 4B) fremgangsmåde svarer til en molekylvægt på ca. 150 kDa, som er tungere end den beregnede vægt baseret på sekventering af data SLP1 (116 kDa) 30. Dette er sandsynligvis på grund af posttranslationelle modifikationer. Andre årsager til misforholdet mellem teoretisk molekylmasse og den observerede molekylmasse i SDS-geler er muligvis opkræve afhængige artefakter i SDS-gel 30.

Figur 4
Figur 4. proteinprofiler Lavet af SDS-PAGE af (A) opløst bakterieceller opnået fra dyrknings- prøver og (B), renset SLP1 efter vellykket isolering; Denne fifigur er blevet ændret fra Suhr, M. et al. (2014) 19 med tilladelse fra Springer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Batch-sorption Eksperimenter og Bestemmelse af Au med ICP-MS

De maksimale metalbindende kapacitet (q max) for Au (III) ved suspenderes SLP1 er vist i figur 5. Resultaterne viser, at Au (III) blev stabilt bundet af SLP1 under 24 timers inkubation inden det undersøgte pH-interval. Resultater indikerer q max i intervallet omtrent 80-100 mg Au (III) / g SLP1. Summerede værdier (tabel 1) blev sammenlignet med sorption kapacitet på ca. 75 mg Au (III) / g SLP1 tidligere rapporteret af Suhr, M. et al. (2014) stammer fra eksperimenter med selvjusterendepH-værdier ved tilsætning af metalsaltet opløsning (pH ≈ 4,3) 19. For at opsummere, har SLP1 vist evnen til at binde store mængder af oprindeligt har tilføjet Au (III) bevise sin høje bindende kapacitet til dette element.

Figur 5
Figur 5. Diagram over Maximum Metal Bindende Kapacitet (q max) i Au (III) til SLP1 polymerer inden pH-justerede eksperimenter i forhold til sorption resultater ved hjælp af selv-justeret pH-værdier (≈ 4.3) rapporteret af Suhr, M. et al. (2014) 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

De beregnede fjernelse af metal effektivitetsgevinster (VE) i det undersøgte pH-område var mellem 50 - 60% hvilket bekræfter resultaterne fra Suhr, M. et al. (2014), hvor værdier på ca. 40% blev opnået. I tidligere lavet eksperimenter, stærke interaktioner af Au (III) med de funktionelle grupper, f.eks, carboxylic-, hydroxyl- og aminogrupper, er blevet observeret for S-lags proteiner som SLP1 og for den sammenlignende protein SlfB L. sphaericus JG-A12 1,78. Jankowski, U. et al. (2010) påvist spektroskopisk en stærk vekselvirkning mellem Au (III) hovedsagelig carboxylgrupperne i SlfB der kunne også udledes til SLP1 L. sphaericus JG-B53 20,79,80. Også iboende protein egenskaber, der ville reducere Au (III) til Au (0) i fravær af reduktionsmidler kunne være en årsag til den stærke vekselvirkning 79. Desuden er resultaterne af denne undersøgelse viser tendensen af ​​en foretrukken binding af SLP1 ved lavere pH-værdier. På den anden side er en binding ved lavere pH-værdier kunne også føre til en denaturering af SLP1. Undersøgelser til SLP1 været en proteinstabilitet ned til pH =3,0 (upublicerede resultater). Fra desorptionsforsøgene under sure betingelser, ved hjælp af f.eks salpetersyre eller anvender kompleksdannere som EDTA eller citrat (data ikke vist), bekræfter, at guld stabilt var bundet og ikke kunne blive frigjort fra SLP1 polymerer.

Au (III) om SLP1 L. sphaericus JG-B53
c oprindelige (mg / L) 196,97
pH 5 4,5 ≈ 4,3 23 4 3,5 3 2.5 2
værdi
q max 88,3 85.3 74,7 102,5 94,1 81 101,9 96.9
(mg Au (III) / g SLP1)
RE 47.1 47,8 37,9 57.1 54.1 44,8 58,7 56,5
(%)

Tabel 1: Maksimal Metal Bindende Kapacitet (q max) og Metal fjernelsesgrader (RE) Batch-sorption Forsøg med Au (III) og SLP1 Polymers i opløsningen målt ved ICP-MS. Dataene ændret i forhold til tidligere offentliggjorte resultater fra Suhr, M. et al. (2014) 19.

SLP1 Monolayer Omkrystallisation sporet af QCM-D

Den umiddelbare fald i frekvens (△ f 5, △ f 7, △ f 9, △ f 11) tyder på en hurtig adsorption og en høj affinitet af proteinerne til PE modificeret overflade (figur 6A). Svarende til den hurtige ændring i frekvens, spredning (AD 5, AD 7, AD 9, AD 11) øger også det samme. Dette faktum indikerer en adsorption af viskoelastiske molekyler til overfladen på grund af hurtig dæmpning resulterer i stigende dissipation værdier. Den maksimale frekvens skift opnås efter 5 min med en værdi på ≈ 95 Hz og AD på 4,2. På et senere tidspunkt kun rearrangementer af rekrystalliseret SLP1 forekomme. SLP1 adsorption blev thusly udført i løbet af 60 min for at sikre than dannelsen af ​​et næsten fuldt dækket overflade og regelmæssigt bestilt protein gitter. Forsøget viser, at den positivt ladede PE lag er umistelig for at opnå stabile overtræk, negative slutning modifikation fører til en svag adsorption og længere coating kinetik (data ikke vist) 38. Svagt bundet proteiner og agglomerater blev fjernet ved skylning med SLP1-fri omkrystallisation buffer. De små ændringer i delta f n bekræfte lavt proteinindhold desorption og stabil adsorption af SLP1. Trods dette dissipation falder til ≈ 2,8 angiver, at større elastiske molekyler fjernes.

Figur 6
Figur 6. Omkrystallisation af SLP1 på modificeret SiO 2 Sensorer analyseret ved QCM-D; (A) i Af-/ AD plot og (B) overflade tykkelse profile; Dette tal er blevet ændret fra Suhr, M. et al. (2014) 19 med tilladelse fra Springer og Suhr, M. (2015) 20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Overfladen profil beregnet ved hjælp af de ovenfornævnte modeller har en SLP1 monolagtykkelse af ≈ 11,2 nm (Kelvin-Voigt model for elastiske film) og 10,0 nm (Sauerbrey model for stive lag) (figur 6B). Disse værdier er lavere end de rapporteret af Suhr, M. et al. (2014). Forskellene kan forklares ved en anden brugte værdi af protein lag densitet inden for modellering. De aktuelle værdier bør være tættere på realiteter lagtykkelse på S-lag-proteiner på celleoverfladen af levende celler af L. sphaericus JG-B53 31,42. Denne modellering viser, at Sauerbrey forhold is upassende for akustisk tyndt lag proteinholdigt, på grund af en opformering af forskydning akustiske bølge i viskoelastiske væskefilm 81,82, der resulterer i en undervurdering af det adsorberede SLP1 masse og tykkelse. Dette kan forklares ved de elastiske egenskaber af S-lag-proteiner og dens kobling af vandmolekyler under adsorptionsprocessen. Interaktionen af vand med proteiner kan let beskrives ved dannelse af hydrering skaller, væskemodstand eller indfangning i hulrum i det adsorberede lag 83. Dette bevirker en højere lagtykkelse målt ved Kelvin-Voigt model og kan også præcisere forskellene i lagtykkelsen opnået ved de to forskellige modeller. I tidligere AFM studier blev lagtykkelser på SLP1 gitre på ca. 8-12 nm målt. Ved at beregne massen adsorption af SLP1, i stedet for lagtykkelse, alt AM af 1506,6 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt model) blev beregnet. Dataene masse adsorption på surfEsser er opsummeret i tabel 2 og viser en høj masse adsorption ved hjælp af værdierne af Kelvin-Voigt model.

m max AM max tykkelse tykkelse
(ng / cm2) (ng / cm2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
SLP1 efter belægning og skylning 1,505.6 1,351.6 11.2 10

Tabel 2: adsorberede masse af SLP1 på modificeret Polyelectrolyte SiO 2 Krystaller analyseret af QCM-D efter skylning med Omkrystallisation Buffer (pH = 8,0) og Beregnet lagtykkelse.

QCM-D som værktøj til påvisning af metal og metal NP Interaktion med Proteinholdigt SLP1 Monolayer

Vekselvirkningen mellem omkrystalliseret SLP1 monolag med 1 mM og 5 mM opløst Au (III) blev undersøgt. Resultaterne af den samlede adsorberede masse stammer fra beregninger og modellering af de registrerede data af ændringer i hyppighed og spredning er opsummeret i tabel 3. QCM-D studier af Au (III) interaktion med monolag give en dybere forståelse af metal-biomolekyle vekselvirkning. For første gang, bindingskapaciteten, sorptionskinetikken, og hvordan metal påvirker proteinstabilitet blev undersøgt i en nano-området. Efter tilsætningen af ​​metalsaltet løsning på SLP1 monolag frekvensen faldt inden for de første 5 min indikerer en hurtig masse adsorption. Ikke desto mindre blev adsorptionen af Au ikke afsluttet efter 60 min som beskrevet for andre metaller som Pd (II) i tidligere undersøgelser 19. Stigningen masse sker op til 18 timer. Efter dette tidspunkt blev skylletrin udført med metal fri buffer viser, at det adsorberede metal er næsten stabilt bundet til det omkrystalliserede SLP1 lag. Endelig blev en samlede metal absorption af 955.0 ± 2,7 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt model) opnået i tilfælde af 1 mM Au (III) løsning og 4,534.4 ± 5,5 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt model) i tilfælde af 5 mM Au (III). De højere værdier opnået ved 5 mM Au (III) løsninger kan forklares med iboende egenskaber SLP1 reduktion Hvis mindste metallisk Au (0) NP blev dannet ud fra denne opløsning. Disse reducerende ordentligbånd af SLP1 er allerede blevet rapporteret i tidligere studier for Pd (II) og Au (III) 32,33,79,84. Dataene viste også, at interaktionen med guld løsning ikke fører til en destabilisering af protein lag. Dette angiver den specifikke og stabil binding af Au (III) til SLP1, der er også bekræftet ved ICP-MS målinger ved hjælp af protein polymerer.

Dannelsen af ​​Au (0) NP under syntesen kunne visualiseres ved farveændring fra udgangsmaterialet gule opløsning til en rødlig én. Farveændringen skyldes excitation af overfladen plasmon svingninger af metalliske nanopartikler og viser dannelsen af Au (0) -NPs 1,78. Desuden mindre NP'er kan syntetiseres ved variation af koncentrationen af reduktionsmidlet (højere garvesyre koncentration) 85 synlige i en anden farve opløsning og kontrolleret af resultaterne af PCS målinger (data ikke vist). På denanden side øger garvesyre koncentration fører til et tab af NP stabilitet og nationale parlamenter har en tendens til at klumpe 20. Som bevis på princippet, præ-syntetiseret Au (0) -NPs (størrelsesfordeling på 10 - 18 nm målt ved PCS set i figur 7A) blev inkuberet med suspenderet SLP1 i 48 timer og analyseret ved SDS-PAGE. Proteinet profil er vist i figur 7B kontrollerer konklusionen fra QCM-D data, at Au (0) behøver -NPs ikke forstyrrer SLP1 struktur. De observerede protein bånd ved 150 kDa bevise tilstedeværelsen af ​​intakt SLP1.

Figur 7
Figur 7. (A) antalsvægtet størrelsesfordelingen af pre-syntetiserede Au (0) -NPs målt ved PCS og (B) SDS-PAGE protein profil SLP1; Bane 1: 2 ug SLP1 før Au (0) -NPs interaktion og bane 2: 1 ug SLP1 polymerer i suspension efter 48 timer INCUBA tion med præ-syntetiseret Au (0) -NPs. Klik her for at se en større version af dette tal.

Efter NP-syntese og karakterisering blev QCM-D eksperimenter udført. Adsorption af præ-syntetiseret metallisk Au (0) -NPs er eksemplarisk vist for QCM-D eksperimenter i △ f / AD plots (figur 8 A) og som tykkelse og masse profiler (Figur 8B).

Figur 8
Figur 8. Adsorption af Pre-syntetiseret Au (0) -NPs på omkrystalliseret SLP1 Lattice Analyseret QCM-D, (A) i △ f / AD plot og (B) lag overflade og masseprofil.blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Det kunne bekræftes, at QCM-D kan anvendes til at påvise adsorptionen af ​​10 - 18 nm sfæriske Au (0) -NPs. Efter tilsætning af ufortyndet Au-NP-opløsning (A 520 nm = 1) opnået ved fremgangsmåden beskrevet syntese, frekvensen falder, hvilket er en direkte indikator for massen adsorption beskrevet af forudsigelsen af Sauerbrey (ligning 1). Adsorptionen af ​​Au (0) -NPs blev næsten afsluttet inden for mindre end 60 min. Efter denne tid ikke mere NP blev aflejret på toppen af ​​SLP1 gitter, så det kan antages, at alle reaktive steder eller porer blev besat af Au (0) -NPs. Den viste fald i dissipation kan tilknyttet afstivning af SLP1 gitter forårsaget af NP interaktion. Værdierne af den samlede masse adsorption er opsummeret i tabel 3. Selv intensiv skylning med NP-fri citratbuffer fører neither til en desorption af nationale parlamenter eller for en løsrivelse af SLP1 monolag. Derfor kan en stabil og stærk vekselvirkning forudsiges for Au (0) NP interaktion i samme henseende som med Au (III).

Metal c metal AM max AM max tykkelse tykkelse
(ng / cm2) (ng / cm2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
1 mM 955 932,6 --- ---
5 mM 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
NP'er

Tabel 3: adsorberede masse om omkrystalliseret SLP1 Lattice efter Au (III) Interaktion (pH = 6,0) og Au-NP Adsorption (pH = 4,7) Analyseret af QCM-D og Beregning af lagtykkelse efter Au (0) NP Coating. Dataene ændret i forhold til tidligere offentliggjorte resultater fra Suhr, M. et al. (2014) 19.

AFM til visualisering af nanometer Skaleret Structures

I figur 9, proteinet gitter af SLP1 omkrystalliseret om PE modificerede sensorer er vist med sin typiske kvadratisk gitter (p4) som amplitude billeder. Den gitterkonstant kunne bestemmes som 13 - 14 nm, der er sammenlignelig med resultaterne fra tidligere forsøg 30. Lagtykkelsen på 10 nm ± 2,0 nm målt ved AFM verificeret den forudsagte tykkelsen af ​​QCM-D målinger af ≈ 11,2 nm (Kelvin-Voigt modellering) lag. Den lille forskel i overfladen højde kan forklares ved, at calculated QCM-D pasform betragter hele sensor område, mens den høje opløsning AFM undersøgelse viser kun en delvis område. På denne baggrund blev protein agglomerater, der var knyttet til sensoroverfladen indgår i beregningen af ​​adsorberede masse henholdsvis lagtykkelsen og førte til en højere lagtykkelse end bestemt ved AFM.

Figur 9
Figur 9. AFM Amplitude Billede af omkrystalliseret SLP1 gitter af L. sphaericus JG-B53 på QCM-D Krystaller Direkte efter Coating og Skylning med Buffer og forstørrelse på Markant Region; Dette tal er blevet ændret fra Suhr, M. et al. (2014) 19 med tilladelse fra Springer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 10 viser den intakte SLP1 gitter efter inkubation med Au (III) opløsning. Det kan vises, at efter inkubationen proteinet gitter fuldstændig intakt. Dette bekræfter resultaterne fra QCM-D eksperimenter, der forudsagde stabiliteten af ​​overtrækket. I figur 11A og B adsorberede præ-syntetiseret Au (0) -NPs (størrelse varierer fra 10 - 18 nm bestemt ved PCS) på SLP1 gitter er vist. På grund af partikelstørrelse, Au (0) -NPs adsorberes i SLP1 porerne og ikke følger den p4 -symmetry af SLP1. Au (0) -NPs er statistisk fordelt på protein gitter. Ved at måle partikelstørrelserne i AFM højde billeder (data ikke vist) størrelsen af NPS er i området 16 - 23 nm og endnu mindre, nemlig i området fra ca. 10 nm 19,20. Denne verifies det bestemmes NP størrelse målt tidligere af PCS (ses i figur 8).

Figur 10
Figur 10. AFM Amplitude Billede af omkrystalliseret og Intakt SLP1 Lattice på QCM-D Sensor krystaller efter Inkubation af 5 mM Au (III) Løsning og forstørrelse af Markant Region; Dette tal er blevet ændret fra Suhr, M. et al. (2014) 19 med tilladelse fra Springer og Suhr, M. (2015) 20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 11
Figur 11. (A) AFM amplitude billede af adsorberet Au (0) -NPs på omkrystalliseret SLP1 gitter på QCM-D sensor krystaller (venstre) Og (B) 3D rekonstruerede overflade profil (til højre); Dette tal er blevet ændret fra Suhr, M. (2015) 20 med tilladelse fra Springer og Raff, J. et al. (2016) Raff, J. et al. S-lags baserede nanokompositter til industrielle applikationer i protein-baserede Engineered nanostrukturer. (red Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (indsendt)). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbejde studeret binding af Au til S-lag-proteiner blev undersøgt under anvendelse af en kombination af forskellige analysemetoder. Især bindingen af Au er meget attraktiv, ikke kun anvendes til genindvinding af Au fra minedrift farvande eller procesløsninger, men også til konstruktion af materialer, f.eks sensoriske overflader. For undersøgelser af Au interaktion (Au (III) og Au (0) -NPs) med suspenderet og omkrystalliseres monolag af SLP1, havde protein, der skal isoleres. Derfor har denne undersøgelse vist den vellykkede dyrkning af den grampositive bakteriestamme L. sphaericus JG-B53 og isoleringen af overfladelaget protein SLP1. Ikke desto mindre, dyrkning og protein isolation forbliver udfordrende og bør optimeres. En produktion af biomasse og S-layer proteiner i stor skala er en forudsætning for en industriel anvendelse af begge, fx til produktion af metal selektive filtermaterialer. Deres ansøgning potentiale er undoubtedly høj til fjernelse af giftige metaller eller inddrivelse af værdifulde metaller opløst i procesvand, spildevand eller drænvand. Endvidere ansøgningen potentiale for S-lag er endnu større i betragtning af deres yderligere potentiale i andre bio-inspirerede materialer, såsom biosensorer og katalysatorer.

De batch-sorption eksperimenter suspenderede SLP1 polymerer viste en høj og stabil binding af Au (III) inden for det undersøgte pH-interval 2,0-5,0. Derved kunne metaludtagningssystemet virkningsgrader på op til 60% nås. Denne bemærkelsesværdige bindende opførsel kan forklares ved en stærk vekselvirkning mellem Au (III) med SLP1 sandsynligvis induceret ved interaktion af carboxylgrupper og nitrogen bærer grupper, som findes på overfladen af ​​proteinet. Denne argumentation kunne styrke ved FTIR og EXAFS undersøgelse af lignende stammen L. sphaericus JG-A12 32,79. Desuden kan iboende reducerende egenskaber SLP1 forklare det høje RE af Au (III) ved reducing at nanopartikelformige Au (0). Det kan antages, at S-lag, som første grænseflade af bakterier til miljøet, bør først og fremmest involveret i metal binding. Inden det undersøgte pH-område, det højeste metal bindingskapacitet med 102,5 mg Au (III) / g SLP1 blev opnået ved pH 4,0. Denne bindende kapacitet er større end rapporteret for andre bio-komponenter, f.eks, for isolerede cellevæg af Bacillus subtilis (71,5 mg Au (III) / g) 86 eller for biomasse af Chlorella vulgaris (98,5 mg Au (III) / g) 8 .

ICP-MS anvendes til bestemmelse af den bundne metal ved SLP1 polymerer er meget følsom metode, og muliggør påvisningen af ​​små mængder af guld i denne undersøgelse. ICP-MS giver mange fordele til udførelse spormetal bestemmelser, f.eks nem håndtering-system og lave detektionsgrænser; i tilfælde af guld ned til 0,1 - 1 ppt. Dette gør denne metode et alsidigt værktøj til undersøgelse biosorptive processer i lav koncentration rækkeviddes. Imidlertid blev resultaterne i denne undersøgelse gjort med ophængte S-layer polymerer og kan ikke let overføres til S-layer gitre rekrystalliserede på overflader, og vis dermed begrænsningen af ​​ICP-MS. For eksempel kunne ingen direkte forbindelse af isolerede polymerer protein skal foretages i nævnte S-lags strukturer på vitale bakterieceller. Hertil kommer, at de ICP-MS målingerne ikke tillade bestemmelse af kinetiske af metal sorption. Derfor er det nødvendigt at finde metoder mere egnet til undersøgelse af metal binding af tynde immobiliserede protein film.

I den foreliggende undersøgelse blev QCM-D analyser anvendes til påvisning af in situ dannelse af S-lags gitre på overflader samt aflejring af Au på proteinerne. Derfor QCM-D er en robust og reproducerbar metode til anerkendelse af molekyle adsorptionsprocesser og interaktionsprocesser. Derudover QCM-D er en relativt enkel, omkostningseffektiv og ufarligt metode til at overvåge such processer online. Metoden har den fordel at opdage masse forandringer med en totalmasse følsomhed i væsker med ≈ 0,5 ng ∙ cm -2. Dette gør det muligt mulighed for at opdage selv svage vekselvirkning, fx af protein med opløste metaller eller til at måle adsorptioner i lav koncentrationsintervaller. Ulempen ved QCM-D er, at dette ikke er en struktur billeddannelse, der tillader visualisering af f.eks protein gitre. Derfor er der behov andre teknikker.

QCM-D analyser i denne undersøgelse blev efterfulgt af AFM billeddannelse. Kombinationen af ​​disse metoder tillod studiet af sorptionskinetikken og konsekvenserne af Au sorption til coating, hvilket beviser, at de er alsidige værktøjer til undersøgelse af metal samspil af tynde proteinholdige film. Endvidere blev det vist, at en pålidelig omkrystallisation af S-lag-proteiner på tekniske understøtninger er afgørende for efterfølgende protein-interaktion undersøgelser. Derforgrunden, ændringer af overfladerne med adhæsionspromotorer er af interesse. Den beskrevne implementering af polyelektrolytter (slutter med positivt ladede PSE) som mellemlag mellem SiO 2 overflader og protein lag fører til en forbedret metode til en hurtig protein belægning. Den positive effekt af en positivt opkræve polyelektrolytlag er blevet beskrevet tidligere for f.eks immobilisering af vitale bakterieceller L. sphaericus JG-B53 31. Gennemførelsen af ​​de præsenterede PE-lag er de vigtigste og mest kritiske trin for senere vellykket og reproducerbar omkrystallisering af S-lags proteiner.

Det kunne påvises, til undersøgelse af tynde lag af SLP1, QCM-D er en god metode til at vise massen adsorption respektive til proteinet omkrystallisering som monolagfilm i realtid. Dette kunne også tidligere observeret for samling af S-lag protein SBPA L. sphaericus </ em> CCM2177 47. Ved at anvende efterfølgende høj opløsning AFM analyser ændringer i gitterstrukturen af ​​protein selvstændige enheder kan visualiseres. AFM målinger afslørede p4 symmetri SLP1 og bekræft den modellerede lagtykkelse på SLP1 på omkring 10 nm. Også kunne direkte interaktion af opløste metalioner med proteinet lag overvåges ved QCM-D beviser god binding af Au (III) af den underliggende protein lag. Den sandsynlige dannelse af den mindste Au (0) -NPs fra Au (III) opløsningen inden protein porer forårsaget af iboende reducerende egenskaber af SLP1 gitter inden QCM-D målinger kunne ikke påvises ved efterfølgende AFM målinger. Dette kunne være relateret til den opløsning grænse på AFM og den eksperimentelle oprettet i denne undersøgelse. Dette viser begrænsning af denne teknik, og nødvendigheden af ​​høj opløsning billeddannelse til biomolekyler i sub nanometerskala. Imidlertid kunne en høj stabilitet omkrystalliseret SLP1 lag udledes the opnåede QCM-resultater, og blev bekræftet af AFM undersøgelse.

Konkluderende kan det vises, at SLP1 polymerer har høj metalbindende kapacitet til guld i den undersøgte pH-interval. Endvidere undersøgelsen afslører, at SLP1 gitteret er en god matrix metalionbindingsstedet og til immobilisering af metalliske nanopartikler. Det kunne påvises, at hver metode anvendes i denne artikel har mulighed for at opdage selv små metal interaktioner, eller i tilfælde af AFM kan visualisere strukturer i nanoskala rækkevidde. Selv om det kun ved kombinationen af ​​disse viste metoder, der har lov til at forbedre kendskabet til og forståelsen af ​​de undersøgte proteiner på molekylært niveau.

Hovedsageligt, QCM-D og AFM er de foretrukne metoder til valg til fremtidig undersøgelse af protein monolag adsorption og deres samspil med metaller og funktionelle molekyler. Ved at kombinere disse to metoder, påvisning af S-lags protein annoncesorption processer og overflade billedbehandling giver et indblik i molekylære processer, der kan være i stand til at blive overført til øge kendskabet til levende bakterier og samspillet med deres miljø. Denne undersøgelse viste et uddrag af mulige metoder nyttige for at forstå protein og interaktion metal. Andre nyttige teknikker, der kunne øge kendskabet til sådanne processer i detaljer lige fra diverse spektrometriske og kromatografiske metoder til at spektroskopiske undersøgelser af biomolekyler og bør indgå i fremtidige studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Den nuværende arbejde blev delvist finansieret af IGF-projektet "S-Sieve" (490 ZBG / 1) finansieret af BMWi og BMBF-projektet "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Særlig tak til Tobias J. Günther for hans værdifulde hjælp under AFM undersøgelser og til Erik V. Johnstone til aflæsning af manuskriptet som en indfødt engelsktalende. Desuden vil forfatteren af ​​dette papir takke Aline Ritter og Sabrina Gurlit (fra Institute for Resource Økologi om bistand i ICP-MS-målinger), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava og gruppen bioteknologi af Helmholtz-Instituttet Freiberg for Resource Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W. Biosorption of uranium and copper by biocers. Chem. Mat. 15 (1), 240-244 (2003).
  3. Sleytr, U. B., Schuster, B., Egelseer, E. M., Pum, D. S-Layers: Principles and Applications. FEMS Microbiol. Rev. , (2014).
  4. Pollmann, K., Raff, J., Merroun, M., Fahmy, K., Selenska-Pobell, S. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications. Biotechnol. Adv. 24 (1), 58-68 (2006).
  5. Raff, J., Selenska-Pobell, S. Toxic avengers. Nucl. Eng. Int. 51, 34-36 (2006).
  6. Tsuruta, T. Biosorption and recycling of gold using various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 50 (4), 221-228 (2004).
  7. Sathishkumar, M., Mahadevan, A., Vijayaraghavan, K., Pavagadhi, S., Balasubramanian, R. Green Recovery of Gold through Biosorption, Biocrystallization, and Crystallization. Ind. Eng. Chem. Res. 49 (16), 7129-7135 (2010).
  8. Das, N. Recovery of precious metals through biosorption - A review. Hydrometallurgy. 103 (1-4), 180-189 (2010).
  9. Volesky, B. Biosorption and me. Water Res. 41 (18), 4017-4029 (2007).
  10. Vilar, V. J. P., Botelho, C. M. S., Boaventura, R. A. R. Environmental Friendly Technologies for Wastewater Treatment: Biosorption of Heavy Metals Using Low Cost Materials and Solar Photocatalysis. Security of Industrial Water Supply and Management.NATO Science for Peace and Security Series C-Environmental Security. Atimtay, T. A., Sikdar, S. K. , Springer. 159-173 (2010).
  11. Lovley, D. R., Lloyd, J. R. Microbes with a mettle for bioremediation. Nat. Biotechnol. 18 (6), 600-601 (2000).
  12. Schiewer, S., Volesky, B. Environmental Microbe-Metal Interactions. Lovely, D. R. , ASM Press. Washington. 329-362 (2000).
  13. Raff, J., Berger, S., Selenska-Pobell, S. Uranium binding by S-layer carrying isolates of the genus Bacillus. Annual Report 2006 Institute of Radiochemistry. , Forschungszentrum Rossendorf. Dresden. (2006).
  14. Srinath, T., Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria. Chemosphere. 48 (4), 427-435 (2002).
  15. Godlewska-Zylkiewicz, B. Biosorption of platinum and palladium for their separation/preconcentration prior to graphite furnace atomic absorption spectrometric determination. Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr. 58 (8), 1531-1540 (2003).
  16. Hosea, M., et al. Accumulation of elemental gold on the alga Chlorella-vulgaris. Inorg. Chim. A-Bioinor. 123 (3), 161-165 (1986).
  17. Vogel, M., et al. Biosorption of U(VI) by the green algae Chlorella vulgaris. in dependence of pH value and cell activity. Sci. Total Environ. 409 (2), 384-395 (2010).
  18. Creamer, N., Baxter-Plant, V., Henderson, J., Potter, M., Macaskie, L. Palladium and gold removal and recovery from precious metal solutions and electronic scrap leachates by Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol Lett. 28 (18), 1475-1484 (2006).
  19. Suhr, M., et al. Investigation of metal sorption behavior of Slp1 from Lysinibacillus sphaericus. JG-B53 - A combined study using QCM-D, ICP-MS and AFM. Biometals. 27 (6), 1337-1349 (2014).
  20. Suhr, M. Isolierung und Charakterisierung von Zellwandkomponenten der gram-positiven Bakterienstämme Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und JG-B53 und deren Wechselwirkungen mit ausgewählten relevanten Metallen und Metalloiden. , Technische Universität Dresden. (2015).
  21. Spain, A., Alm, E. Implications of Microbial Heavy Metal Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research. 2, Rice University . Houston. 1-6 (2003).
  22. Ledin, M. Accumulation of metals by microorganisms - processes and importance for soil systems. Earth-Sci. Rev. 51 (1-4), 1-31 (2000).
  23. Maruyama, T., et al. Proteins and Protein-Rich Biomass as Environmentally Friendly Adsorbents Selective for Precious Metal Ions. Environ. Sci. Technol. 41 (4), 1359-1364 (2007).
  24. Sara, M., Sleytr, U. B. S-layer proteins. J. Bacteriol. 182 (4), 859-868 (2000).
  25. Baranova, E., et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 487 (7405), 119-122 (2012).
  26. Teixeira, L. M., et al. Entropically Driven Self-Assembly of Lysinibacillus sphaericus S-Layer Proteins Analyzed Under Various Environmental Conditions. Macromol. Biosci. 10 (2), 147-155 (2010).
  27. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (5), 1117-1125 (2007).
  28. Panak, P., et al. Bacteria from uranium mining waste pile: interactions with U(VI). J. Alloy. Compd. 271, 262-266 (1998).
  29. Selenska-Pobell, S., Kampf, G., Flemming, K., Radeva, G., Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie Van Leeuwenhoek. 79 (2), 149-161 (2001).
  30. Lederer, F. L., et al. Identification of multiple putative S-layer genes partly expressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology. 159 ( Pt 6), 1097-1108 (2013).
  31. Günther, T. J., Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids. RSC Advances. 4, 51156-51164 (2014).
  32. Fahmy, K., et al. Secondary Structure and Pd(II) Coordination in S-Layer Proteins from Bacillus sphaericus. Studied by Infrared and X-Ray Absorption Spectroscopy. Biophys. J. 91 (3), 996-1007 (2006).
  33. Pollmann, K., Merroun, M., Raff, J., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. Manufacturing and characterization of Pd nanoparticles formed on immobilized bacterial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (1), 39-45 (2006).
  34. Corti, C., Holliday, R. Gold : science and applications. , CRC Press - Taylor&Francis Group. (2010).
  35. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem. Rev. 104 (1), 293-346 (2004).
  36. Tang, J., et al. Fabrication of Highly Ordered Gold Nanoparticle Arrays Templated by Crystalline Lattices of Bacterial S-Layer Protein. Chem. Phys. Chem. 9 (16), 2317-2320 (2008).
  37. Haruta, M. Size- and support-dependency in the catalysis of gold. Catal. Today. 36 (1), 153-166 (1997).
  38. Habibi, N., et al. Nanoengineered polymeric S-layers based capsules with targeting activity. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 88 (1), 366-372 (2011).
  39. Toca-Herrera, J. L., et al. Recrystallization of Bacterial S-Layers on Flat Polyelectrolyte Surfaces and Hollow Polyelectrolyte Capsules. Small. 1 (3), 339-348 (2005).
  40. Decher, G., Lehr, B., Lowack, K., Lvov, Y., Schmitt, J. New nanocomposite films for biosensors - Layer-by-Layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA. Biosens. Bioelectron. 9 (9-10), 677-684 (1994).
  41. Decher, G., Schmitt, J. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. Progress in Colloid & Polymer Science. 89 Trends in Colloid and Interface Science VI, Dr Dietrich Steinkopff Verlag. (1992).
  42. Günther, T. J. S-Layer als Technologieplattform - Selbstorganisierende Proteine zur Herstellung funktionaler Beschichtungen. , Technische Universität Dresden. (2015).
  43. Delcea, M., et al. Thermal stability, mechanical properties and water content of bacterial protein layers recrystallized on polyelectrolyte multilayers. Soft Matter. 4 (7), 1414-1421 (2008).
  44. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of Protein Adsorption: Surface-Induced Conformational Changes. J. Am. Chem. Soc. 127 (22), 8168-8173 (2005).
  45. Zeng, R., Zhang, Y., Tu, M., Zhou, C. R., et al. Protein Adsorption Behaviors on PLLA Surface Studied by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). Materials Science Forum. 610-613, 1219-1223 (2009).
  46. Bonroy, K., et al. Realization and Characterization of Porous Gold for Increased Protein Coverage on Acoustic Sensors. Anal. Chem. 76 (15), 4299-4306 (2004).
  47. Pum, D., Toca-Herrera, J. L., Sleytr, U. B. S-layer protein self-assembly. Int. J. Mol. Sci. 14 (2), 2484-2501 (2013).
  48. Weinert, U., et al. S-layer proteins as an immobilization matrix for aptamers on different sensor surfaces. Eng. Life Sci. , (2015).
  49. Umeda, H., et al. Recovery and Concentration of Precious Metals from Strong Acidic Wastewater. Mater. Trans. 52 (7), 1462-1470 (2011).
  50. Engelhardt, H., Saxton, W. O., Baumeister, W. 3-Dimensional structure of the tetragonal surface-layer of Sporosarcina-urea. J. Bacteriol. 168 (1), 309-317 (1986).
  51. Sprott, G. D., Koval, S. F., Schnaitman, C. A. Methods for general and molecular bacteriology. , American Society for Microbiology. 72-103 (1994).
  52. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  53. Stoscheck, C. [6] Quantitation of protein. Methods in Enzymology. Deutscher, M. P. 182, Academic Press. 50-68 (1990).
  54. Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D. Analysis of Crystalline Bacterial Surface-Layers by Freeze-Etching Metal Shadowing, Negative Staining and Ultra-Thin Sectioning. Method Microbiol. 20, 29-60 (1988).
  55. PerkinElmer. ICP Mass Spectrometry - The 30-Min to ICP-MS. , PerkinElmer. USA. (2001).
  56. Mühlpfordt, H. The preparation of colloidal Gold Nanoparticles using tannic-acid as an additional reducing agent. Experientia. 38 (9), 1127-1128 (1982).
  57. Hayat, M. A. Colloidal Gold - Principles, Methods and Applications. , Academic Press. (1989).
  58. Amendola, V., Meneghetti, M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 113 (11), 4277-4285 (2009).
  59. Schurtenberger, P., Newman, M. E. Characterization of biological and environmental particles using static and dynamic light scattering in Environmental Particles. Buffle, J., van Leeuwen, H. P. 2, Lewis Publishers. 37-115 (1993).
  60. Jain, R., et al. Extracellular Polymeric Substances Govern the Surface Charge of Biogenic Elemental Selenium Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 49 (3), 1713-1720 (2015).
  61. Harewood, K., Wolff, J. S. Rapid electrophoretic procedure for detection of SDS-released oncorna-viral RNA using polyacrylamide-agarose gels. Anal. Biochem. 55 (2), 573-581 (1973).
  62. Penfold, J., Staples, E., Tucker, I., Thomas, R. K. Adsorption of mixed anionic and nonionic surfactants at the hydrophilic silicon surface. Langmuir. 18 (15), 5755-5760 (2002).
  63. Krozer, A., Rodahl, M. X-ray photoemission spectroscopy study of UV/ozone oxidation of Au under ultrahigh vacuum conditions. J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films. 15 (3), 1704-1709 (1997).
  64. Vig, J. R. UV ozone cleaning of surfaces. J. Vac. Sci. Technol. 3 (3), 1027-1034 (1985).
  65. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift Fur Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  66. Q-Sense - Biolin Scientific. Introduction and QCM-D Theory - Q-Sense Basic Training. , (2006).
  67. Edvardsson, M., Rodahl, M., Kasemo, B., Höök, F. A dual-frequency QCM-D setup operating at elevated oscillation amplitudes. Anal. Chem. 77 (15), 4918-4926 (2005).
  68. Hovgaard, M. B., Dong, M. D., Otzen, D. E., Besenbacher, F. Quartz crystal microbalance studies of multilayer glucagon fibrillation at the solid-liquid interface. Biophys. J. 93 (6), 2162-2169 (2007).
  69. Liu, S. X., Kim, J. T. Application of Kelvin-Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Jala. 14 (4), 213-220 (2009).
  70. Reviakine, I., Rossetti, F. F., Morozov, A. N., Textor, M. Investigating the properties of supported vesicular layers on titanium dioxide by quartz crystal microbalance with dissipation measurements. J. Chem. Phys. 122 (20), (2005).
  71. Voinova, M. V., Rodahl, M., Jonson, M., Kasemo, B. Viscoelastic acoustic response of layered polymer films at fluid-solid interfaces: Continuum mechanics approach. Phys. Scr. 59 (5), 391-396 (1999).
  72. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13 (10), 2825-2828 (2004).
  73. Schuster, B., Pum, D., Sleytr, U. B. S-layer stabilized lipid membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), FA3-FA11 (2008).
  74. Malmström, J., Agheli, H., Kingshott, P., Sutherland, D. S. Viscoelastic Modeling of Highly Hydrated Laminin Layers at Homogeneous and Nanostructured Surfaces: Quantification of Protein Layer Properties Using QCM-D and SPR. Langmuir. 23 (19), 9760-9768 (2007).
  75. Vörös, J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers. Biophys. J. 87 (1), 553-561 (2004).
  76. Hillier, A. C., Bard, A. J. ac-mode atomic force microscope imaging in air and solutions with a thermally driven bimetallic cantilever probe. Rev. Sci. Instrum. 68 (5), 2082-2090 (1997).
  77. Horcas, I., et al. WSXM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev. Sci. Instrum. 78 (1), 013705 (2007).
  78. Merroun, M. L., Rossberg, A., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. XAS characterization of gold nanoclusters formed by cells and S-layer sheets of B. sphaericus JG-A12. Annual Report Forschungszentrum Rossendorf - Institute for Radiochemistry. , (2005).
  79. Jankowski, U., Merroun, M. L., Selenska-Pobell, S., Fahmy, K. S-Layer protein from Lysinibacillus sphaericus. JG-A12 as matrix for Au III sorption and Au-nanoparticle formation. Spectroscopy. 24 (1), 177-181 (2010).
  80. Selenska-Pobell, S., et al. Magnetic Au nanoparticles on archaeal S-Layer ghosts as templates. Nanomater. nanotechnol. 1 (2), 8-16 (2011).
  81. Caruso, F., Furlong, D. N., Kingshott, P. Characterization of ferritin adsorption onto gold. J. Colloid Interface Sci. 186 (1), 129-140 (1997).
  82. Ward, M. D., Buttry, D. A. In situ interfacial mass detection with piezoelectric transducers. Science. 249 (4972), 1000-1007 (1990).
  83. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: A quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73 (24), 5796-5804 (2001).
  84. Wahl, R. Reguläre bakterielle Zellhüllenproteine als biomolekulares Templat. , Technische Universität Dresden. (2003).
  85. Jennings, T., Strouse, G. Past, present, and future of gold nanoparticles in Bio-Applications of Nanoparticles. , Springer. 34-47 (2007).
  86. Beveridge, T., Fyfe, W. Metal fixation by bacterial cell walls. Can. J. Earth Sci. 22 (12), 1893-1898 (1985).

Tags

Kemi Biosorption metaller S-layer bakterier nanopartikler QCM-D AFM ICP-MS guld
Au-Interaktion af SLP1 Polymerer og Monolayer fra<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS og AFM som Værktøjer til biomolekyle-metal Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K.… More

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies. J. Vis. Exp. (107), e53572, doi:10.3791/53572 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter