Убыт- и Gain-оф-функции подход к расследованию Early Cell Судьба определителям предимплантационной эмбрионов мыши

Summary

Цель этого протокола заключается в описании убыт- и амплитудно-метода функции, который применим для идентификации neogenin в качестве рецептора стадиеспецифический, что приводит к трофэктодерме и массовая дифференциация внутренней клеточной у эмбрионов предимплантационной мыши.

Abstract

Методы подавления и сверхэкспрессии генов играют важную роль в идентификации генов, участвующих в эмбриональном развитии. Прямая модификация генов-мишеней в преимплантационных эмбрионах дает возможность изучить основные механизмы генов, участвующих, например, в клеточной дифференцировке в трофэктодерму (TE) и внутреннюю клеточную массу (ICM). В данной статье мы описываем протокол, в котором рассматривается роль неогенина в качестве аутентичного рецептора для первоначального определения клеточной судьбы в преимплантационных эмбрионах мышей. Во-первых, мы обсуждаем экспериментальные манипуляции, которые использовались для получения усиления и потери функции неогенина путем микроинъекций кДНК и шРНК неогенина; эффективность этого подхода была подтверждена сильной корреляцией между попарными уровнями экспрессии красного флуоресцентного белка (RFP) или зеленого флуоресцентного белка (GFP) и иммуноцитохимическим количественном определением экспрессии неогенина. Во-вторых, чрезмерная экспрессия неогенина в преимплантационных эмбрионах мышей приводит к нормальному развитию ВКМ, в то время как нокдаун неогенина вызывает аномальное развитие ВКМ, подразумевая, что неогенин может быть рецептором, который передает внеклеточные сигналы, приводящие бластомеры к ранней клеточной судьбе. Учитывая успех этого подробного протокола в исследовании функции нового рецептора, специфичного для стадии эмбрионального развития, мы предполагаем, что он может помочь в исследовании и идентификации других генов, специфичных для стадий, во время эмбриогенеза.

Introduction

Преимплантационная эмбриональное развитие можно разделить на несколько различных стадий, от стадии одной клетки к морулы и бластоцисты. Многое данные свидетельствуют о том, что полярность и позиционные сигналы играют роль в раннем определении судьбы клеток в трофэктодерме (TE) и массы внутренней клетки (ИВМ). Тем не менее, характер репликами, как они преобразованных в клеточные сигналы, а также физиологические условия, в которых такие сигналы способны инициировать клеточной линии дифференцировки не известны. Эти дифференцированные клетки затем проходят специализацию, начинает приобретать характерные структуры и функции , необходимые для правильного формирования эмбри....

Protocol

Примечание: Все процедуры для животноводства и заботами были проведены в соответствии с правилами IACUC из Sahmyook университета, Сеул, Южная Корея.

1. суперовуляции, Селекция и Яйцевод Изоляция

1. Поддерживать инбредных мышей C57BL / 6 при следующих условиях: 22 ± 3 ° C, ~ 60% влажности, 12 ч цикл свет / темнота, и вода и пища вволю.
2. Побудить суперовуляцию из 3-5-недельных самок мышей путем внутрибрюшинной инъекции 5 МЕ беременной кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG) в количестве 0,1 мл / голову с последующим 48 ч позже внутрибрюшинной инъекции 5 МЕ человеческого хорионического гонадотропина (ХГ) в количестве 0,1 мл /глава.
3. Сразу....

Results

Мы обнаружили , что neogenin временно экспрессируется на ранних стадиях развития эмбрионов предимплантационной мыши, появляются уже на стадии 2-клеточного и прочного до начала морулы , но становится дефицитом на поздней морулы и бластоцисты этапов (рис 2А). Кроме того, пространственное распределение neogenin было ограничено, главным образом, за пределами клетки. Результаты анализа ОТ-ПЦР согласовывались с ранней и переходной природы neogenin выражения, достигая максимума.......

Discussion

В настоящем протоколе, мы демонстрируем новые способы микроинъекции генетических материалов, либо кДНК или shRNA, в эмбрионах 2-ПН мыши, чтобы исследовать роль neogenin в ранней дифференцировки клеток во время эмбриогенеза мыши. Генетическая модификация предимплантационной эмбрионов является мощным средством в раскрытии ключевой информации о базовых молекулярных механизмов, например, первого определения клеточных клонов. Генетическая модификация является одним из наиболее часто используемых методов для выяснения функции.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
M16	средний,Gibco BRL (Гранд-Айленд, Нью-Йорк)	M7292 LOT# 11A832
Сыворотка для козы,	Dako (Glostrup, Дания)	X0907
PMSG	Folligon, Intervet, Holland	G4877-1000IU LOT#SLBD0719V
Минеральное масло	Sigma Aldrich	CG5-1VL LOT# SLBC6783V
хорионического гонадотропина человека и гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы	(Intervet, Голландия)	(invitrogen , 15596-026)
SuperScript® III Обратная транскриптаза	lifetechnologies	18080-044
ПЦР предварительная смесь	( Bioneer, Daejon, S. Korea)	GenDEPOT, A0224-050
Agarose (молекулярный класс)	BioRad	161-3101
Раствор параформальдегида, 4% в PBS	Affymetrix США	19943
поликлональное антитело кролика против неогенина	Santa Cruz Biotechnology, US	SC-15337
Alexa fluor 488 меченые анти-кроличьи антитела	Молекулярные зонды (Invitrogen, США)	A-11094
Alexa fluor 555 меченые молекулярные зонды против антител к кроликам	(Invitrogen, США)	A-21428
Alexa Fluor® 555 молекулярные зонды фаллоидина	(Invitrogen, США)	A34055
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид	Invitrogen, США	D1306
Рекомбинантный человеческий RGM-C/Гемоджувелин	R&;D системы	3720-RG
все плазмидные конструкции	Профессор Вэнь Чэн Сюн в Университете медицинских наук Джорджии (Агуста, Джорджия).		Для настоящего исследования были любезно предоставлены
Неон®   Трансфекционная система	lifetech	MPK10096
Стерео Microscrope
Микромэнпуляция с Nikon		Nikon Narishige ONM-1
Микроинжектор	Nikon Narishige	GASTIGHT #1750
Держатель	Nikon Narishige	IM 16
Microfuge	Nikon Narishige	Кофемолка Narishige MF-900
Пуллер	Narishige	EG400
Puller	Sutter Instrumnet компании	P-97
CO2 инкубатор	Thermo Scientific Forma	EW-39320-16
Veriti® 384-луночный термоамплификатор	Технологии жизни	4388444