Method Article

SALVI 및으로 ToF-SIMS에 의해 물에 수화 된 단백질의 제자리의 특성에

DOI:

10.3791/53708

⸱

February 15th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Fundamental & Computational Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

In This Article

Summary

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이 작업은 수용액 중의 단백질의 생체 시츄 비행 시간 형 2 차 이온 질량 분석기 분석을위한 마이크로 액체 취급 및 샘플 도입을위한 프로토콜을 나타낸다.

Abstract

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이 작업은 액체 진공 인터페이스 (SALVI) 및 TOF (-SIMS), 비행 시간 형 이차 이온 질량 분석법으로 분석 시스템을 사용하여 수용액의 단백질의 생체 시츄 특성화 보여준다. 피브로넥틴 단백질 막을 SALVI 감지 영역을 형성하는 상기 실리콘 질화물 (SIN) 막 상에 고정화 하였다. 으로 ToF-SIMS 분석에서, 분석의 세 개의 모드는 높은 공간 분해능 질량 분석법, 2 차원 영상 및 깊이 프로파일 링을 포함하여 수행 하였다. 질량 스펙트럼을 양성 및 음성 모드를 모두 취득 하였다. 탈 이온수는 기준 샘플로서 분석 하였다. 우리의 결과는 물에 피브로넥틴 영화는 혼자 물에 비해 더 독특하고 강한 물 클러스터 피크를 가지고 있음을 보여준다. 아미노산 단편의 특징적인 피크는 단백질 수화으로 ToF-SIMS 스펙트럼에서 관찰 가능하다. 이러한 결과는 표면에 단백질 분자의 흡착 dynamica을 연구 할 수있는 예시에서야 처음으로 액체 환경에서 SALVI 및으로 ToF-SIMS를 사용하여.

Introduction

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수화 구조, 형태 1, 2 단백질의 생물학적 활성을 3 중요하다. 그들을 둘러싼 물 분자가없는 단백질은 실행 가능한 생물학적 활성이없는 것입니다. 특히, 물 분자가 표면 단백질의 내부 구조와 상호 작용 단백질의 상이한 수화 상태는 별개 이러한 상호 작용을 만든다. (4) 고체 표면과 단백질의 상호 작용은 나노, 바이오 물질 및 조직 공학 프로세스의 의미와 기본적인 현상이다. 연구는 긴 단백질이 표면에 발생으로 구조적인 변화가 발생할 수 있음을 지적했다. 으로 ToF-SIMS는 단백질 - 고체 계면을 연구 할 수있는 잠재력을 가지고 기술로서 구상되었다. 5-7 이는 잠재적으로 그 구조의기구의 기본적인 이해를 제공 고체 표면에 단백질의 수화를 이해하는 것이 중요 형태 및 생물학적등 활동.

그러나, 주 표면 분석 기술은 주로 진공 기반 휘발성 액체 연구 직접 애플리케이션 인해 진공 분위기 하에서 휘발성 액체의 신속한 증발하기 어렵다. 우리는 액체 표면과 액체 - 고체 상호 TOF (-SIMS), 비행 시간 형 이차 이온 질량 분석기를 사용하여 직접 관찰을 가능하게하는 액체 진공 인터페이스 (SALVI)에서 분석 호환 미세 인터페이스 시스템에 진공을....

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Protocol

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SALVI 마이크로 채널 1. 청소 및 살균

  1. SALVI의 마이크로 채널의 살균
    1. 주사기 70 % 에탄올 수용액 2 ㎖를 그리 SALVI의 입구 단부와 주사기를 연결하고 천천히 10 분에 액 1 ㎖을 주입. 사출의 끝에서 주사기를 제거한다. 다음으로, 폴리 에테르 에테르 케톤 (PEEK) 조합을 사용하여 SALVI의 입구와 출구를 연결합니다. 대안 적으로, 동일한 절차를 수행하기 위해 주사기 펌프를 사용한다. 예를 들어, 100 μL / 분으로 유동 속도를 설정한다.
    2. 4 시간 동안 실온에서 70 % 에탄올 용액으로 채워진 마이크로 채널 SALVI 유지.
  2. SALVI에 탈 (DI) 물을 소개
    1. 주사기로 멸균 DI 물 2 ㎖를 그리 SALVI의 입구와 주사기를 연결하고 천천히 10 분에 액 1 ㎖을 주입. 주사기를 제거하고, PEEK 조합을 사용하여 SALVI의 입구와 출구를 연결합니다. 에서 언급 한 바와 같이 교대로 시린지 펌프를 사용하여1.1.1.

SALVI에서 단백질 2 막의 고정화

  1. SALVI에서 단백질 막을 고정화
    1. 주사기로 (인산염 완충 염수 중 10 ㎍ / ㎖, PBS) ....

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Results

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대표적인 결과의 커플은 제안 된 프로토콜의 장점을 보여주기 위해 제공됩니다. SALVI 미세 인터페이스를 사용하여, 기본 이온빔 (BI + 3)가 직접 DI 물에서 수화 피브로넥틴 필름 포격있다. 따라서 액체 표면의 분자 화학 매핑 성공적 얻을 수있다.

도 1a 각각 수화 피브로넥틴 막 및 DI 물의 양으로 ToF-SIMS 질량 스펙트럼을 표시 1B. 물 클러스터를 포함하여 관심의 피크 (즉, m / z 19, 37, 55, 73, 91, 109) 및 아미노산 조각 (즉, m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, 98) 빨간색 화살표로 표시됩니다. 널리 건조 단백질 시료를 사용하여보고 된 아미노산 단편의 특징적인 피크.......

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Discussion

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SALVI 등으로 ToF-SIMS 및 주사 전자 현미경 (SEM)과 같은 진공 기반기구에 의해 동적 액면과 액체 - 고체 계면 분석을 허용 미세 인터페이스이다. 작은 구멍의 사용은 직접 진공 액체에 노출하기 때문에, SALVI은 수정없이 많은 미세하게 초점을 맞춘 분광기 및 이미징 기술에 적합한 22 이동성과 미세 유체의 다양성이 진정한 멀티 모달 이미징 플랫폼입니다. 별개의 기능 및 기존의 기술에 비해 SALVI의 중요성이 최근 여러 후기에 요약되어있다. SALVI 기술의 개발로 22-25 우리 그룹 적극적 동적 액체 표면과 고액 인터페이스를 포함하는 다양한 연구에 적용되어 . 새로운 애플리케이션의 예로는 포유 동물 세포막 세균 생물막 부착 수성 표면 산화 반응의 결과로 15, 16 또는 나노 입자의 형성을 포함한다. 이 포장 된당, 우리는 죄의 표면에 흡착 수화 단백질 박막의 초기 액체으로 ToF-SIMS 결과를 제시한다.

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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PNNL(Pacific Northwest National Laboratory) CII-LDRD(Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development) 및 MS3(Materials Synthesis and Simulation across Scales) 이니셔티브 LDRD 기금의 지원에 감사드립니다. 기기 액세스는 WR Wiley EMSL(Environmental Molecular Sciences Laboratory) 과학 테마 제안서를 통해 제공되었습니다. EMSL은 PNNL의 생물 및 환경 연구국(BER)이 후원하는 국가 과학 사용자 시설입니다. 저자들은 원고를 읽어주고 유용한 피드백을 제공해 준 Xiao Sui, Yuanzhao Ding, Juan Yao 씨에게 감사를 표합니다. PNNL은 DE-AC05-76RL01830 계약에 따라 DOE를 위해 Battelle이 운영합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ToF-SIMSIONTOFTOF. SIMS 5해상도 : >10,000 m/&델타; 질량 분해능의 경우 m; >4,000m/&델타; 높은 공간 해상도를 위한 m 
SALVI(Liquid Vacuum Interface)의 분석 시스템Pacific Northwest National LaboratoryN/ASALVI는 ToF-SIMS(Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)와 같은 진공 기반 과학 기기가 분자 수준에서 자연 상태의 액체 표면을 분석할 수 있도록 하는 고유한 독립형 휴대용 분석 도구입니다.
의 입구와 출구를 연결하기 위한PEEK UnionValcoZU1TPK
IONTOFN/AStage는 ToF-SIMS
Barnstead Nanopure 정수 시스템에Thermo Fisher ScientificD11921ROpure LP 역삼투 여과 모듈(D2716)
주사기BD3096591ml
피펫Thermo Fisher Scientific21-377-821범위: 100 - 1,000 ml
피펫 팁Neptune2112.96.BS1,000 &마이크로; l
원심분리기 튜브코닝43079115 ml
피브로넥틴시그마-알드리치F11411 mg/ml
에탄올열 피셔 사이언티픽S25310A95% 변성
Gibco PBS써모 피셔 사이언티픽10010-023pH 7.4
SALVI 5축 샘플 스테이지 SALVI를 장착하기 위해 자체 제작한

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M.

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SALVIToF SIMSIn Situ CharacterizationHydrated ProteinsFibronectin FilmLiquid Vacuum InterfaceTime of Flight Secondary Ion Mass SpectrometrySpatial Resolution Mass SpectrometryTwo Dimensional ImagingDepth Profiling

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