Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

Cortney C. Winkle; Christopher C. Hanlin; Stephanie L. Gupton

doi:10.3791/53743

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Article de méthode

Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

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DOI :

10.3791/53743

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16 mars 2016

Cortney C. Winkle¹ , Christopher C. Hanlin² , Stephanie L. Gupton¹^,²

¹Curriculum in Neurobiology, The University of North Carolina at Chapel Hill, ²Department of Cell Biology and Physiology, The University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

Les techniques de microscopie optique couplées à des dosages biochimiques élucident l’implication de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification axonale dépendante de la nétrine. Cette combinaison de techniques permet d’identifier les mécanismes moléculaires contrôlant la ramification des axones et le changement de forme des cellules.

Résumé

Au cours du développement neuronal, les axones en croissance s’étendent à plusieurs partenaires synaptiques en élaborant des branches axonales. La ramification axonale est favorisée par des signaux de guidage extracellulaires comme la nétrine-1 et entraîne une augmentation spectaculaire de la surface de la membrane plasmique axonale. La ramification axonale dépendante de la nétrine 1 implique probablement un contrôle temporel et spatial de l’expansion de la membrane plasmique, dont les composants sont fournis par la fusion des vésicules exocytaires. Ces événements de fusion sont précédés par la formation de complexes SNARE, comprenant un v-SNARE, tel que VAMP2 (vésicule associée à la protéine membranaire 2), et les t-SNARE de membrane plasmique, la syntaxine-1 et SNAP25 (protéine associée au synaptosomal 25). Vous trouverez ci-dessous une approche à plusieurs volets utilisée pour examiner le rôle de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification des axones. La force de l’approche combinée réside dans l’acquisition de données à une gamme de résolutions spatiales et temporelles, allant de la dynamique des événements de fusion de vésicules uniques dans des neurones individuels à la formation de complexes SNARE et à la ramification axonale dans des populations de neurones en culture. Ce protocole tire parti des approches biochimiques établies pour doser les niveaux de complexes SNARE endogènes et de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) des neurones corticaux exprimant VAMP2 marqués avec une GFP sensible au pH (VAMP2-pHlourin) afin d’identifier les changements dépendants de la nétrine-1 dans l’activité exocytaire dans les neurones individuels. Pour élucider le moment de la ramification dépendante de la nétrine-1, la microscopie à contraste interférentiel différentiel (CID) time-lapse de neurones uniques sur un ordre d’heures est utilisée. L’immunofluorescence à cellules fixes associée à des neurotoxines botuliques qui clivent la machinerie SNARE et bloquent l’exocytose démontre que la ramification axonale dépendante de la nétrine-1 nécessite une activité exocytaire médiée par SNARE.

Introduction

Des estimations récentes suggèrent que le cerveau humain contient 10¹¹ neurones avec 10¹⁴ connexions synaptiques¹, soulignant l’importance de la ramification axonale in vivo. Les signaux de guidage axonal extracellulaires tels que la nétrine-1 guident les axones vers les partenaires synaptiques appropriés et stimulent la ramification axonale, augmentant ainsi la capacité synaptique^2-5. L’arborisation axonale dépendante de la nétrine 1 implique une expansion substantielle de la membrane plasmique⁶, ce qui, selon nous, nécessite la livraison de composants membranaires supplémentaires via la fusion des vésic....