Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay

8.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53750

⸱

18 maart 2016

 ,  , 
1Aab Cardiovascular Research Institute, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Department of Medicine, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we methoden voor het isoleren van primaire muis epicardiale cellen door middel van een uitgroei-kweektest en het beoordelen van de functionele migratie van epicardiale-afgeleide cellen (EPDC) met behulp van een ex vivo hartkweeksysteem. Deze protocollen zijn geschikt voor het identificeren van genetische en chemische modulatoren van epicardiale epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) en mobiliteit.

Samenvatting

Een enkele laag van epicardiale cellijnen het hart, waardoor paracriene factoren die cardiomyocyt proliferatie stimuleren en rechtstreeks bij cardiovasculaire progenitoren tijdens ontwikkeling en ziekte. Hoewel een aantal factoren zijn betrokken bij cel-epicard afgeleide (EPDC) mobiliseren, zijn de mechanismen die de latere migratie en differentiatie slecht begrepen. Hier presenteren we in vitro en ex vivo strategieën EPDC motiliteit en differentiatie te bestuderen. Ten eerste beschrijven we een methode voor het verkrijgen primaire epicardiale cellen door uitgroei Cultuur van de embryonale muis hart. We introduceren ook een gedetailleerd protocol om driedimensionale migratie van gelabelde EPDC beoordelen in een orgaan kweeksysteem. Wij leveren het bewijs met behulp van deze technieken die genetische deletie van-myocardin gerelateerde transcriptiefactoren in het epicard verzwakt EPDC migratie. Deze aanpak dient als een platform om de kandidaat-modifiers van EPDC evaluerenbiologie en kunnen worden gebruikt om genetische of chemische screens voor nieuwe regulatoren van EPDC mobilisatie die nuttig zijn voor cardiale regeneratie kan zijn kaart te brengen.

Inleiding

Het epicard is een enkele laag van mesotheelcellen lijnen die het hart en effecten cardiale ontwikkeling, rijping en reparatie. Via een sterk gecoördineerde uitwisseling van paracriene signalen, de intieme dialoog tussen het myocardium en epicardium onontbeerlijk cardiale groei en de vorming van niet-cardiale myocyten lineages 1. -Epicardiale afgeleide cellen (EPDC) komen uit een subset van epicardiale cellen door een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) 2, binnenvallen subepicardiale ruimte en onderliggende myocardium en differentiëren grotendeels in hart- mural cellen en fibroblasten, en een mindere mate, endotheelcellen en cardiomyocyten 3-9.

De mechanismen reguleren epicardiale EMT en EPDC invasie werden toegeschreven aan de gecoördineerde actie van verschillende moleculen, waaronder uitgescheiden liganden 10-13, celoppervlak receptoren en adhesiemoleculen 14,15, reguLators van apicale-basale polariteit 16,17, kleine GTPases 18,19 en transcriptiefactoren 2,20,21. Hoewel veel van de moleculaire effectoren van EPDC migratie zijn gedefinieerd, een beter begrip van de fysiologische signalen die EPDC mobilisatie stimuleren het embryo kan de ontwikkeling van strategieën versnellen dit proces te manipuleren in de volwassen verbeterde cardiale regeneratie.

Studies gericht op het identificeren van nieuwe regulatoren van EPDC mobilisatie een beroep doen op de zuivering van deze cel populatie of het opsporen van de migratie van individuele epicardiale cellen. Een of meer markergenen, waaronder WT1, Tcf21, Tbx18 en / of Aldh1a2, wordt vaak gebruikt om de foetale epicard 1 te identificeren. Het gebruik van deze merkers te sporen migratie EPDC niet optimaal expressie van epicardiale merkers afneemt in de loop van de ontwikkeling van het hart en wordt vaak verloren als epicardiale cellen transdif ondergaanferentiatie in mesenchymale cellen.

De toepassing van de Cre / loxP-systeem, in combinatie met-lineage tracing verslaggevers, is nuttig geweest in permanent het labelen van de epicard en de nakomelingen tijdens de ontwikkeling van het hart en de volgende ischemische schade in de volwassen 7,22,23. Verschillende-epicardiale beperkt Cre lijnen zijn gegenereerd en worden op grote schaal gebruikt om EPDC labelen en voor conditionele gen deletie strategieën 1. Deze studies hebben geleid tot de identificatie van verschillende epicardiale lijnen en de identificatie van kritische mediatoren van EPDC motiliteit en differentiatie. Echter, de opslag bewijs suggereert ook het epicard is een heterogene populatie van voorlopercellen 4,24,25. Derhalve zal slechts een deel van epicardiale cellen worden gericht met een bepaalde Cre driver.

Om de gehele epicard ongeacht Cre specificiteit label, hebben een aantal laboratoria uitgroei cul benuttuur systemen of ex vivo orgaan kweekmethoden trouw isoleren of het etiket epicardiale cellen zonder afhankelijk van de expressie van een genetische markers lijn 26-28. Voor ex vivo migratie studies, zijn embryonale harten die voorafgaand aan epicardiale EMT en gekweekt in medium, aangevuld met een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Deze benadering maakt een efficiënte labeling van de gehele epicard plaats van een subset van cellen door Cre gemedieerde recombinatie. Hart culturen worden vervolgens blootgesteld aan bekende inductoren van EMT om de mobilisatie van EPDC 28,29 stimuleren. Ex vivo en in vivo analyses worden aangevuld door in vitro epicardiale explantatie culturen, die een bijzonder nuttige benadering voor het verkennen van gedetailleerde mechanismen achter EPDC migratie.

We beschrijven werkwijzen voor het isoleren primaire epicardiale cellen in vitro studies epicardial EMT, alsmede een orgaan kweeksysteem voor ex vivo analyses van EPDC motiliteit. We hebben onlangs aangetoond dat het nut en de robuustheid van deze methode door genetisch moduleren van de myocardin-gerelateerde transcriptiefactor (MRTF) / serum response factor (SRF) signalering as-actine gebaseerde migratie van EPDC 9 manipuleren. Terwijl onze bevindingen benadrukken een signaalroute die nodig zijn voor het regelen EPDC migratie, deze werkwijzen zijn geschikt voor het ontrafelen van de mechanismen die gezamenlijk orkestreren EPDC migratie en differentiatie. Bovendien zou het explantaat en ex vivo kweeksystemen in functionele screens worden uitgevoerd om nieuwe regulatoren van EPDC mobilisatie te identificeren voor therapeutische toepassingen in cardiale regeneratie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Alle experimenten met muizen werden goedgekeurd door de Universiteit Commissie Animal Resources aan de Universiteit van Rochester.

1. Epicardiale uitgroei Cultuur Assay (Figuur 1A)

  1. voorbereidingen
    1. Bereid 5 ml medium A voor primaire epicardiale celisolatie aanvulling Medium 199 (M199) met 5% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (Pen / Strep).
    2. Voorverwarmen medium A en 100 ml Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) in een 37 ° C waterbad.
    3. Sta-collageen beklede objectglaasjes kamer opwarmen tot kamertemperatuur gedurende 30 min.
    4. Voeg 100 ul medium A aan elk putje van de kamer glijbaan en voorzichtig zwenken gelijkmatig bekleden het collageen oppervlak. Herhaal dit voor 8-12 putten. Verwijder media na coating kamers.
    5. Aliquot voorverwarmde HBSS in twee 10 cm2 platen die 50 ml van HBSS.
  2. Isoleer Embryonale Harten van Zwangere Dam op 11.5 Days bericht coïtum (DPC).30
    1. Verdoven muis met 0,5 ml 13 mg / ml ketamine / 0,88 mg / ml xylazine cocktail in 1 x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) via intraperitoneale injectie. Bevestig de juiste verdoving met behulp van een teen pinch-test. Een zachte pinch volstaat om te bepalen of de muis reageert. Elke beweging of poot te trekken geeft het dier onvoldoende verdoofd om een ​​operatie te doen. Euthanaseren door cervicale dislocatie.
    2. Leg de muis gericht ventrale zijde naar boven en spuit de buik met 70% ethanol om verontreiniging met haar te verminderen.
    3. Knijp de huid met een tang en snijd een laterale incisie in de buik met chirurgische schaar. Houd de huid stevig vast en trek uit elkaar in tegengestelde richtingen in de richting van de kop en de staart.
    4. Knijp het buikvlies met een pincet en snijd met een schaar om de buikholte bloot te leggen.
    5. Verwijder de decidua voorzichtig door te snijden langs de mesometrium. Breng de ontleed decidua aan voorverwarmde HBSS in de eerste10 cm 2 plaat.
    6. Scheid de decidua door te snijden tussen embryo's.
    7. Transfer een embryo tot de tweede 10 cm 2 plaat met voorverwarmde HBSS onder een dissectie microscoop. Verwijder de extra-embryonale weefsel en dooierzak, daarna onthoofden het embryo.
    8. Knijp de thoracale wand met een pincet en scheur het weefsel uit elkaar op de middellijn, waardoor de borstholte.
    9. Plaats de tang achter het hart. Pak de uitstroom-darmkanaal en trek het hart van het embryo. Scheid de luchtwegen en de longen uit het hart, als er nog aan.
  3. Transfer het hart om een enkel putje van de met collageen beklede glijbaan en plaats het dorsale zijde naar beneden (Figuur 1B). Herhaal stap 1.2.7-1.3 voor elk embryo.
  4. Zodra alle harten werden overgebracht naar afzonderlijke putjes Incubeer de kamer glijbaan voor 30 min bij 37 ° C, 5% CO 2 voldoende hechting aan de collageenmatrix mogelijk.
  5. voeg voorzichtig20-50 ul voorverwarmde explantatie medium A rond elk hart. Belangrijk: het medium niet te snel of op een niveau boven het hart toe te voegen, anders harten los te maken van het collageen substraat.
  6. Cultuur het hart bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende ongeveer 24 uur tot epicardiale uitgroei mogelijk. Opmerking: uitwassen kan worden waargenomen zo vroeg 3-4 uur van de cultuur (figuur 1C) en voornamelijk bestaat uit mesotheelcelsuppletie weergeven van geplaveide morfologie, met een minimale mesenchymale cel contaminatie (figuren 1D, E). Representatieve resultaten werden verkregen onder toepassing van een dissectie microscoop uitgerust met een camera.

2. Genetische Ablation en inductie van EMT in Epicardial uitwassen

Let op: Behandel adenovirussen met zorg volgens de goedgekeurde richtlijnen bioveiligheid.

  1. Bereid 15 ml medium B (M199 aangevuld met 1% FBS en 1% Pen / Strep) en voorverwarmen tot 37 ° C in een waterbad.
  2. Voor excisie vanfloxed allelen, voor te bereiden explantatie medium B, aangevuld met 2,5 x 10 4 pfu / ml adenovirus uitdrukken Cre recombinase (Ad / Cre) of de controle virus.
    Opmerking: Adenovirale gemedieerde overexpressie van kandidaatgenen kan ook worden uitgevoerd om overexpressie-fenotypen evalueren. Virale titers worden bepaald door de eindgebruiker.
  3. Trek-epicard uitgeputte harten van uitgroei culturen behulp van een tang. Overdracht harten 1,5 ml buizen met 800 ul Trizol en bewaar bij -80 ° C voor latere RNA-isolatie en genexpressie analyse.
  4. Was elk putje DPBS met bloedcellen en overmatige celresten te verwijderen.
  5. Voeg 500 ul explantaat medium gesupplementeerd met B adenovirus (n) bij elke uitgroei cultuur en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
  6. Voor EMT inductie, verwijder de media en aan te vullen met 37 ° C explantatie medium B, aangevuld met recombinant transformerende groeifactor (TGF) -β1 [10 ng / ml] of voertuig (4 mm hydrochloric zuur (HCl) bevattende 1 mg / ml runderserumalbumine (BSA)). Explantaten cultuur nog eens 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Ga verder met gen / eiwit expressie analyses of immunocytochemie zoals beschreven in de daaropvolgende protocollen.
    Noot: Inductie van epicardiale EMT werd gestimuleerd met diverse concentraties van TGF-β1 variërend van 0,5 ng / ml - 10 ng / ml 26,31-33. Hogere concentraties van ligand kan leiden tot niet-specifieke binding aan alle TGF-β receptoren. De concentratie van TGF-β1 moet de specifieke experimentele doelen weerspiegelen.

3. genexpressie analyse van Epicardial uitwassen

  1. Dooi-epicard uitgeputte harten eerder opgeslagen in Trizol (2.2).
  2. Aspireren media van EPDC culturen en twee keer wassen met DPBS.
  3. Voeg 800 ul kamertemperatuur Trizol culturen explantatie.
  4. Incubeer-epicard verarmd harten en EPDC culturen in Trizol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur tempera opnieuw. Pipet op en neer tien keer aan de gelyseerde monster homogeniseren.
    Opmerking: Hearts kan verder pipetteren nodig om volledig te homogeniseren.
  5. Transfer lysaten naar 1,5 ml buisjes en vult totaal RNA geïsoleerd volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 10 pg glycogeen vóór precipitatie van RNA opbrengst te verhogen. Een gegeven explantaat wordt ongeveer 0,5-1,0 ug RNA werd verkregen.
  6. Verwijder verontreinigend DNA met DNase I en reverse transcriberen 0,5 ug mRNA instructies van de fabrikant.
  7. Valideer de zuiverheid van epicardiale explantaten en / of inductie van EMT kwantitatieve reverse transcriptie (qRT) -PCR 34 middels SYBR groen en de in Tabel 1 beschreven. Normaliseren mRNA niveaus glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) markers en bereken relatieve expressie middels de 2 - methode ΔΔCt 35. Typische resultaten worden getoond in Figuur 2A.
title "> 4. Protein Analyse van Epicardial uitwassen

  1. Aspireren media van EPDC culturen en twee keer wassen met DPBS.
  2. Voeg 10 ul ijskoude eiwit lysisbuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM natriumchloride, 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur pH 8,0, 1% Triton X-100, 1x proteaseremmer cocktail) naar elke kamer goed en plaats de kamer dia ijs. Snijd ongeveer ¼ van de bodem op een P200 pipet tip en het gebruik van de resterende stuk naar de cellen af ​​te schrapen van de dia. Pipet op en neer om Lyse epicardiale cellen en transfer naar een 1,5 ml buis.
  3. Ultrasone trillingen gelyseerde explantaten op laag (160 W) gedurende 5 minuten in een ijswaterbad met 30 sec ON en OFF cycli.
  4. Centrifuge lysaten gedurende 10 min bij 10.000 xg, 4 ° C. Transfer supernatant naar een nieuwe buis en bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een proteïne assay 36.
    Opmerking: Een gegeven explantatie tot 1,5 ug totaal eiwit werd verkregen. We hebben ontdekt dat het bundelen van explantaten uit twee harten eend laden 2 ug eiwit per putje is voldoende om gladde spier α-actine (ACTA2) en GAPDH 9 detecteren. De detectie van andere doeleiwitten nodig bundeling meerdere explantatie monsters zoals bepaald door de eindgebruiker.

5. Immunocytochemie van Epicardial uitwassen

  1. Verwijder het afdrukmateriaal uit Explantatie culturen en twee keer wassen met DPBS.
  2. Voorzichtig voeg 500 pl 4% (v / v) paraformaldehyde of ijskoude methanol aan elk putje en vast explantaten gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur of 10 minuten bij -20 ° C, respectievelijk. Fix volgens antilichaam specificaties zoals aanbevolen door de fabrikant.
  3. Verwijder fixatief en spoel elk putje DPBS met driemaal gedurende 5 minuten.
  4. Permeabilize de cellen met 500 pl 0,1% (v / v) Triton X-100 in DPBS gedurende 5 min.
  5. Verwijderen permeabilisatie oplossing en spoelen met DPBS driemaal gedurende 5 minuten.
  6. Blokkeer de cellen met 10% serum in DPBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur temperaopnieuw.
  7. Doorgaan met primair antilichaam kleuring volgens de aanbevelingen van de fabrikant en optimale condities zoals bepaald door de eindgebruiker.
  8. Verwijderen antilichaamoplossing en spoelen met DPBS driemaal gedurende 5 minuten.
  9. Solliciteer secundair antilichaam volgens de instructies en tegenkleuring van de fabrikant met een geschikte nucleaire kleurstof.
  10. Verwijderen antilichaamoplossing en spoelen met DPBS driemaal gedurende 5 minuten.
  11. Verwijder kamer glijwanden instructies van de fabrikant en deze direct in waterig montage medium aan de cellen. Plaats een dekglaasje over de cellen en de afdichting met nagellak. Typische resultaten worden getoond in Figuur 2B - 2D middels omgekeerde confocale scanning microscopie.

6. Ex Vivo Cultuur Assay (figuur 3A)

  1. voorbereidingen
    1. Bereid 12 ml ex vivo kweekmedium met een (1: 1) mengsel van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): M199 aangevuld met 10%FBS en 1% Pen / Strep.
    2. In een 37 ° C waterbad, pre-warm ex vivo kweekmedium en 100 ml HBSS.
    3. Aliquot 1 ml voorverwarmd medium in 8-12 putjes van een plaat met 24 putjes.
    4. Overdracht voorverwarmd HBSS twee 10 cm 2 platen gemaakt met 50 ml elk.
  2. Isoleer muis embryonale harten in HBSS (zoals beschreven in 1.2) van zwangere dammen op 12,5 dpc.
  3. Transfer elk hart om een enkel putje van de plaat met 24 putjes met ex vivo kweekmedium. Incubeer de plaat bij 37 ° C, 5% CO 2 onder zacht schommelen handmatig of met behulp van een schudapparaat om hechting te voorkomen. Onmiddellijk ga dan naar stap 7.1.

7. Epicardiale Labeling en EMT inductie in Ex Vivo Cultures

  1. Om de epicard labelen, voor te bereiden 12 ml van 37 ° C ex vivo kweekmedium aangevuld met 3,0 x 10 6 pfu / ml van Ad / GFP. Voor gerichte ablatie van floxed allelen, overdracht 6 ml Ad / GFP aangevuld kweekmedium om een ​​nieuwe 15 ml conische buis. Voeg Ad / Cre of adenovirus regelen tot een uiteindelijke concentratie van 1,5 x 10 6 pfu / ml.
    Noot: overexpressie-analyses kunnen worden uitgevoerd met geschikte adenovirale gemedieerde genafgifte uitgevoerd.
  2. Verwijder voorzichtig het kweekmedium uit elk putje van de plaat met 24 putjes met behulp van een P1,000 pipet tip.
  3. Voorzichtig voeg kweekmedium aangevuld met adenovirus (n) aan elk putje.
  4. Incubeer de plaat bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur onder voorzichtig schommelen.
  5. Voor EMT inductie bereiden 12 ml van 37 ° C ex vivo kweekmedium dat 10 ng / ml TGF-β1 en 20 ng / ml van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) -BB of drager (4 mM HCl dat 1 mg / ml BSA ).
  6. Haal kweekmedium uit elk putje van de plaat met 24 putjes met behulp van een P1,000 pipet tip. Voorzichtig spoel de harten met 1 ml DPBS.
  7. Verwijder de DPBS en vul harten met ex vivo cultuur medium met TGF-β1 en PDGF-BB of voertuig.
  8. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C, 5% CO 2 onder voorzichtig schommelen.

8. Cryopreservatie en Immunohistochemie van ex vivo culturen

  1. Bereid de Harten voor Cryopreservatie.
    1. Verwijder het kweekmedium en was harten tweemaal met ijskoud DPBS.
    2. Voeg 1 ml van 4% (v / v) paraformaldehyde elk hart en vaststellen voor 2 uur bij 4 ° C onder voorzichtig schommelen.
    3. Verwijder het fixeermiddel en was tweemaal met DPBS harten. Breng de harten verse putjes met 1 ml 10% (w / v) sucrose bereid in DPBS. Incubeer de plaat overnacht bij 4 ° C met zachte wiegen.
    4. Zorgvuldig overdragen harten nieuwe putjes met 18% (w / v) sucrose bereid in DPBS. Incubeer de plaat overnacht bij 4 ° C met zachte wiegen.
    5. Transfer elk hart een cryomold die weefsel bevriezen medium. Onmiddellijk te bevriezen blokken met behulp van vloeibare stikstof en bewaar bij -80 & #176; C.
  2. Sectie harten op 5 micrometer met behulp van een cryostaat en plaats weefselcoupes op positief geladen objectglaasjes. WINKEL glijdt bij -80 ° C tot kleuring.
  3. Voer immunohistochemie op de afdelingen voor de detectie van de sub-epicardiale basaal membraan.
    1. Slides ontdooien gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Hydrateren de secties door twee keer wassen in DPBS gedurende 5 min met zachte wiegen.
    3. Doorlaatbaar gedeelte met 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Was de dia's twee keer in DPBS gedurende 5 min met zachte wiegen.
    5. Dep het overtollige DPBS en definieer de kleuring regio met een hydrofobe etikettering pen. Blokdelen met 10% serum in DPBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Verwijder blok en gelden collageen type IV antilichaam (ColIV, 1: 200) verdund in blok. Incubeer overnacht bij 4 ° C in een vochtigheid geregelde kamer.
    7. Was de glaasjes drie keer in DPBS voor5 min met zachte wiegen.
    8. Verdunnen fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam (1: 500) en DAPI (1: 5000) in DPBS en gelden voor de glijbanen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Kies een geschikte secundair antilichaam met een emissiegolflengte en excitatie onderscheiden van GFP.
    9. Was de dia's drie keer in PBS gedurende 5 minuten met zachte wiegen. Mount dia's met montage medium.

9. Imaging en kwantificering van ex vivo culturen

  1. Hebben afbeelding een geblindeerde gebruiker en kwantificeren gekleurde coupes. Van minimaal vijf niet-opeenvolgende weefselcoupes van een bepaald hart in 4-5 willekeurige plaatsen langs het epicard (rand van het hart) met een fluorescerende of confocale microscoop bij een vergroting van 40x. Typische resultaten worden getoond in figuur 3B middels omgekeerde confocale scanning microscopie.
  2. Handmatig tellen het aantal GFP-positieve cellen in dezelfde afbeelding. Identificeer migreren EPDC als GFP positive cellen die zich binnen of buiten de ColIV subepicardiale basaal membraan. Bepaal het percentage GFP migrerende cellen als het aantal migrerende GFP positieve cellen over het aantal GFP-positieve cellen in dezelfde afbeelding. Typische resultaten worden getoond in figuur 3C-D middels omgekeerde confocale scanning microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De epicard kan efficiënt worden geïsoleerd met behulp van een uitloper cultuur assay door gebruik te maken van het exterieur locatie en het benutten van de ontwikkelingsplasticiteit en intrinsieke migratiegedrag van EPDC. Muriene embryonale harten zijn geïsoleerd aan E11.5 voorafgaand aan epicardiale EMT en beschaafde dorsale zijde naar beneden op de collageen-gecoate kamer dia's 26 (figuur 1 A, B). Geëxplanteerde harten zal blijven krimpen; Toch zal de ep...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier schetsen we gedetailleerde methoden om primaire epicardiale cellen te isoleren door uitgroei en volgen EPDC migratie in ex vivo hart culturen. Voor uitgroei culturen, het juiste moment om de epicard uitgeputte hart te verwijderen verschilt enigszins tussen de experimenten. Periodieke controle van de explantaten na een nacht incubatie wordt aanbevolen om te peilen naar de omvang van de epicardiale uitgroei en het hart uit te pakken voordat fibroblasten verschijnen. Om de zuiverheid te garanderen, moet harte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

EMS werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) [licentienummer R01HL120919]; de American Heart Association [subsidie ​​aantal 10SDG4350046]; University of Rochester CTSA onderscheiding van de NIH [toekenningsnummer UL1 TR000042]; en inbedrijfstelling fondsen van de Aab CVRI. MAT werd mede ondersteund door een subsidie ​​van de Universiteit van Rochester School of Medicine en Tandheelkunde van het Howard Hughes Medical Institute Med-Into-Grad Initiative; en een Institutioneel Ruth L. Kirschstein National Research Service Award van de NIH [toekenningsnummer GM068411].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle MediumHyclone SH3002201DMEM
Hanks' Balanced Salt SolutionHycloneSH3003102HBSS
Medium 199HycloneSH3025301M199
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline HycloneSH3002802DPBS
Fetal Bovine Serum Gemini 100-106FBS
Penicillin/Streptomycin SolutionHycloneSV30010
Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture SlidesCorning354557
Multiwell 24-well platesFalcon08-772-1
Dissecting microscopeLeicaM50Uitgerust met Leica KL300 LED-bron
Confocal miscroscopeOlympus1X81Uitgerust met multi-argonlaser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser en kwiklamp
BioruptorDiagenode UCD-200
Transforming growth factor beta 1R&D Systems100-B-001TGF-β1
Platelet-derived growth factor BBR&D Systems220-BB-010PDGF-BB
Trizol ReagentApplied Biosystems15596-026Let op, gevaarlijk materiaal
TURBO DNA-free KitLife TechnologiesAM1907DNaseI
iScript cDNA Synthesis KitBioRad1708891
UltraPure GlycogenLife Technologies10814-010
SYBR GreenBioRad170-8880
Protease inhibtor cocktail tabletsRoche11836170001
Alexa Goat-anti-rabbit 488Life TechnologiesA11008Secundaire antilichaam
Alexa Goat anti-rabbit 594Life TechnologiesA-11012Secundaire antilichaam
Alexa Goat anti-mouse 594Life TechnologiesA-11005Secundaire antilichaam
Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated Sigma-AldrichC6198monocloonaal antilichaam, clone 1A4
Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1)Life TechnologiesMA1-46028monocloonaal antilichaam, clone 6F-H2
Rabbit anti-ZO1Life Technologies40-2200polycloonaal antilichaam
Rabbit anti-Collagen Type 4MilliporeAB756Ppolycloonaal antilichaam
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride Life TechnologiesD1306DAPI
Fluorescent mounting medium DAKOS3023
16% Paraformaldehyde solutionElectron Microscopy Sciences15710PFA verdund tot 4% in DPBS. Let op, gevaarlijk materiaal
SucroseSigma-AldrichS0389
Tissue Freezing MediumTriangle Biomedical SciencesTFM-B
Pap penDAKOS2002
Disposable mictrotome blades Sakura Finetek4689
Microscope slidesGlobe Scientific1358Wpositief geladen, 25 mm x 75 mm x 1 mm
Cryostat LeicaCM1950
ForcepsFine Science Tools11295-00
Surgical ScissorsFine Science Tools91460-11
Disposable base moldsFisher Scientific22-363-553
KetamineHospiraNDC 0409-2051-05
XylazineAkornNADA 139-236

Referenties

  1. von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
  2. Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
  3. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
  4. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
  5. Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
  6. Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
  7. Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
  8. Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
  9. Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
  10. Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
  11. von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
  12. Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
  13. Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
  14. Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
  15. Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
  16. Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
  17. Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
  18. Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
  19. Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
  20. Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
  21. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
  22. Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
  23. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
  24. Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
  25. Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
  26. Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
  27. Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
  28. Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
  29. Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
  30. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
  31. Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
  32. Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
  33. Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829(2013).
  34. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
  35. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
  36. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  37. Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
  38. Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
  39. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
  40. Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
  41. Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694(2013).
  42. Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
  43. Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
  44. Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
  45. Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
  46. Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Epicardiale cellenEPDC-migratieex vivo assayembryonaal hartcelisolatieadenoviruslabelingTGF-beta-behandelingepitheliale-mesenchymale transitiemyocardine-gerelateerde transcriptiefactor
Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.