Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Introduction

Ca2 ⁺ is een belangrijk ion in overvloed in elke cel in het lichaam. Het heeft een belangrijke rol in verschillende cellulaire functies, waaronder groei, proliferatie, migratie en apoptose ^1-4. Het staat vast dat Ca ²⁺ deze processen kunnen beïnvloeden door middel van zowel directe als indirecte acties, en daarom wijzigingen in de normale intracellulaire concentraties van deze ionen kan gemakkelijk leiden tot negatieve gevolgen voor de getroffen cellen. De SR wordt beschouwd als de grootste intracellulaire Ca2 ⁺ opslag binnen de cel ^5. Steady state niveaus van Ca ²⁺ in zowel de SR en cytoplasma worden normaal gehandhaafd door voortdurend in beweging in en uit de Ca ²⁺ transporterend kanalen van dit organel. De stressvolle omstandigheden opgelegd cellen als gevolg van enige vorm van letsel of ziekte zijn vaak geassocieerd met significante veranderingen in de SR Ca ²⁺ dat naar de langdurige effecten op het hebben hijalth van de cel. In de meest ernstige gevallen, het onvermogen van een gestresste cel om te herstellen en te onderhouden steady state SR Ca ²⁺ niveaus kunnen zelfs in de dood resulteren door apoptose ^6-8.

Lopend onderzoek naar cellulaire Ca ²⁺ dynamiek wordt beperkt door het feit dat er maar weinig studies testen organel Ca ²⁺ winkel inhoud direct ^9-11. De meest gangbare praktijk houdt in plaats meting van cytoplasmatische Ca ²⁺ levels als indirecte metingen van de veranderingen in de SR Ca ²⁺ gehalte ^12-14. In deze experimenten wordt Ca2 ⁺ gewoonlijk geïnduceerd uit de SR worden vrijgegeven door middel van farmacologische agentia die depletie van de organellen (bijvoorbeeld thapsigargine). Conclusies worden vervolgens met betrekking tot de wijzigingen in de SR Ca ²⁺ op basis van schommelingen in de cytoplasmatische Ca ²⁺ concentraties opgesteld. Ondanks de mogelijkheid resteert voor onderzoekers om dergelijke conclusies in een rotonde ma trekkennner deze wijze van SR Ca ²⁺ meting is duidelijk een indirecte manier om dergelijke informatie, met veel beperkingen met betrekking tot de interpretatie van de verzamelde gegevens verzamelt. Om deze duidelijke beperking omzeilen, is het noodzakelijk om de hoeveelheid Ca2 ⁺ direct in de SR luminale netwerk gevonden meten.

Vitaal belang voor het uiteindelijke resultaat van de mogelijkheid om intraluminale SR Ca ²⁺ niveaus rechtstreeks opnemen zijn de celkweek instrumenten en de Ca ²⁺ indicator gebruikt. Voor referentie tot de huidige manuscript data, is het belangrijk op te merken dat VSMC gebruikt kwam uit een bevroren cellijn. De cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) + 10% serum van pasgeboren kalveren (NCS) in passages 22-26 voor de beschreven experimenten, geïncubeerd bij een constante 37 ° C met 5% CO ₂ toevoer. Met de huidige werkwijze, bijvoorbeeld cellen zijn zeer succesvol gekweekt op een eiwitmengsel dat het extracellulaire simuleertmilieu van vele verschillende soorten weefsel ^15. Belangrijk voor succes langs de ader van SR Ca ²⁺ activiteit is het type eiwitmengsel gebruikt; in dit geval, een lage groeifactor verscheidenheid moest componenten van dit instrument voorkomen beïnvloedt de normale Ca2 ⁺ signalering en verplaatsingen voortdurend optreedt binnen de onderzochte cellen. Na succesvolle groei van testcellen, de Ca2 ⁺ indicator moet effectief worden ingevoerd om deze gekweekte cellen. Dit is mogelijk geworden door een adenovirale vector die de Ca2 ⁺ SR wonende indicator D1SR draagt. Om een ​​hoge transfectie efficiëntie moeten cellen worden geïncubeerd met virale vectoren voor ten minste 36-48 uur voorafgaand aan beeldvorming. Deze voorbereiding zorgt voor een betrouwbaar hulpmiddel om Ca ^{2 +} transiënten in het SR lumen met een hoge nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te meten.

D1SR indicator gebruikt in dit protocol is een gemodificeerde variant van de D1ER Ca ²⁺ indicator die oorspronkelijk werd gemaakt door het laboratorium van Dr. Roger Y. Tsien's aan de University of California, San Diego, USA ^9,16. De originele D1ER behoort tot een tweede generatie van genetisch gecodeerde Ca2 ⁺ indicatoren genoemd kameleons dat Ca2 ⁺ gevoeligheden over een veel breder bereik (0,5-160 uM) weergegeven in vergelijking met eerdere Ca2 ⁺ indicatoren ^9,16. De nieuwe variant D1SR, een vriendelijke gift van Dr. Wayne Chen (University of Alberta, Canada), echter, draagt ​​een mutant calsequestrin sequentie (in plaats van een calreticuline sequentie zoals in de oorspronkelijke D1ER). De mutant calsequestrin heeft een verminderde binding aan Ca ²⁺ dat de kwestie van te concurreren met endogene calsequestrin in binding aan Ca ²⁺ in het SR lumen ¹¹ elimineert. De D1SR indicator heeft een afgeknotte verbeterde cyaan fluorescerend eiwit (CFP) en geel fluorescerend eiwit (YFP) die binden door een linker die gemodificeerde eiwit calmoduline (CaM) en M13 (thij 26-residu peptide van myosine lichte keten kinase dat bindt aan CAM) sequenties. De CaM-M13 sequentie is gemodificeerd voorkomen M13 binden aan endogene calmoduline. Ook naar SR behoud te verzekeren, een calsequestrin reeks is toegevoegd aan het 5'einde van de ^GVB-11. Wanneer gebonden aan Ca2 ^+, de CaM-M13 domein gaat door conformationele veranderingen die resulteren in een verhoging van de energieoverdracht tussen de flankerende CFP en YFP, die wordt geregistreerd als een toename van de FRET signaalintensiteit. Anderzijds, wanneer de concentratie van SR luminale Ca2 ⁺ daalt, de CaM-M13 domein gaat door reverse conformationele veranderingen, resulterend in een afname van de energieoverdracht tussen de flankerende CFP en YFP en een aanzienlijke daling van FRET signaalintensiteit .

Protocol

Ethiek statement: Alle experimenten en procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Laboratory Biosafety richtlijnen van de Universiteit van British Columbia, Vancouver, Canada.

1. Bereiding van 35 mm Glass-bottom Cultuur Gerechten voor FRET-gebaseerde confocale microscopie

1. Bereid platen met de volgende procedure 36-48 h voorafgaand aan experimenten.
2. Ophalen gekozen gelatineuze eiwitmengsel en 0,25% trypsine-EDTA van -20 ° C opslag en bewaar ze in de mobiele ijsbad tot gebruik.
   OPMERKING: De coating eiwitmengsel mag alleen bloot tot kamertemperatuur gedurende een korte tijd om te voorkomen dat het mengsel stollen vóór gebruik. Trypsineoplossing ook gekoeld worden totdat nodig; alternatief kan trypsine worden opgehaald van -20 ° C bewaren na voltooiing van stap 1,5.
3. Bereid een 1:25 verdunning van eiwitmengsel: DMEM (geen toegevoegde serum, gekoeld). Transfer juiste hoeveelheid eiwit mengsel / DMEM aan elke plaat wordt voorbereid. Voor 35 mm glazen bodem platen, voeg ongeveer 200 ul volledig bedekken innerlijke glazen cirkel op de onderkant van de plaat.
4. Laat de plaatjes zitten voor ten minste 30 min in de veiligheidskast en bij kamertemperatuur. Warme DMEM met 10% NCS tot 37 ° C in een waterbad gedurende deze periode.
5. Warm trypsine in een waterbad tot 37 ° C onmiddellijk voorafgaand aan de volgende stappen.
6. Verwijderen DMEM dat momenteel in kolf met een glazen pipet en afzuiging. Was de vloer van de kolf met warme steriele PBS om de resterende DMEM resten te verwijderen.
7. Verjagen eerder gekweekte gladde spiercellen van fles bottom:
   OPMERKING: Fles opgericht dagen deze stap om gewenste cellen confluentie (ongeveer 80%) te bereiken voor bord voorbereiding. Cellen werden oorspronkelijk gesuspendeerd in de kolf van 20 ml DMEM met 10% NCS en geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO ₂ voorziening van 24 uur, waarna DMEM supply adem en cellen werden teruggebracht naar incubator. DMEM werd vernieuwd vooravondry 48 uur na deze eerste stappen tot cellen bereikt samenvloeiing.
   1. Was de kolf snel met 1 ml trypsine en verwijder vervolgens 1 ml trypsine met behulp van zuigkracht.
   2. Voeg in een 1 ml trypsine en laat gedurende langere tijd (ongeveer 30-60 seconden), zwiepen kolf zorgen enzym contact maakt met de gehele bodem van de kolf.
   3. Observeer hoeveel cellen onder een microscoop hebben losgemaakt totdat tevreden met de scheiding van kolf. Alternate zwiepende trypsine-oplossing en het controleren van mobiele onthechting tot tevreden aandeel van de cellen gescheiden van kolf.
      OPMERKING: De fles kan worden teruggebracht naar de incubator gedurende ongeveer 30-60 seconden te versnellen dit proces bij 37 ° C.
   4. Zodra cellen zijn verdreven met behulp van trypsine, voeg verse DMEM met 10% NCS naar de kolf met het trypsine reactie te stoppen (voldoende volume zodat trypsine vormt 1/8 ^e van het totale volume in de fles).
      OPMERKING: Bijvoorbeeld, bij gebruik van een 250 ml kolf, zou ditzijn 7 ml DMEM toegevoegd aan 1 ml trypsine resulteert in 8 ml celoplossing.
8. Transfer resulterende cel oplossing uit de kolf met een schone (label) 50 ml conische buis.
9. Voeg 1 ml vers DMEM plus 10% NCS aan elke plaat wordt voorbereid (voldoende middellange tot 24 uur duren).
10. Voorzichtig omkeren buis met mobiele oplossing meerdere keren te breken elke korrel die zich kunnen hebben gevormd.
11. Pipet het gewenste volume van zacht gemengde cel oplossing in elke plaat.
    LET OP: De aanbevolen SMC aantal plated voor dit protocol is 0,5-0,8 x 10 ⁶ per 35 mm cultuur gerechten. Deze aantallen kunnen variëren afhankelijk van het celtype en moet worden getest en gemodificeerd door elk laboratorium.
12. Swirl elke plaat grondig met de klok mee / tegen de klok in om gelijke verdeling van cellen over glazen bodem te garanderen.

2. transiënte transfectie met adenovirale vector die D1SR Ca ²⁺ Indicator

1. Na toevoeging van medium en celoplossing aan elke plaat, laat platen geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO ₂ voorziening van ten minste 1 uur om cellen goed hechten aan glas op bodem van gerechten. De lamellen onder een microscoop op 15 min afstanden totdat cellen duidelijk zijn bevestigd.
2. Ophalen adenovirus-D1SR hoeveelheid van -80 ° C opslag en in mobiele ijsbad houden vervoerd te worden naar biologische veiligheid kabinet.
3. Pipet gewenste dosis (multipliciteit van infectie van 100) gekoeld D1SR aan elke plaat.
   OPMERKING: De berekening van het volume van adenovirale oplossing bestaan ​​per plaat afhankelijk van de virustiter in de oorspronkelijke voorraadoplossing, die wordt gepresenteerd als plaquevormende eenheid (PFU). Op basis van onze ervaring, adviseren wij een veelvoud van infectie (MOI) van 100, die wordt geïnterpreteerd als het aantal of de virusdeeltjes die nodig is om een ​​gladde spiercellen (SMC) in de cultuur plaat infecteren.
4. Incubeer de geïnfecteerde cellen bij 37 ° C met 5% CO ₂ toevoer O / N.
5. De volgende dag vullen cellen met 1 ml vers DMEM plus 10% NCS.
6. Incubeer de platen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C in 5% CO ₂ O / N.

3. Meting van SR Luminal Ca ²⁺ Met behulp van FRET gebaseerde confocale Imaging

1. Na O / N incubatie, verwijder het kweekmedium van de plaat.
2. Was de kweekplaat met 1 ml warm fysiologische HEPES-buffer met PSS (in mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glucose 10, KCl 5, 5 HEPES, 1,5 _CaCl2 en 1 _MgCl2 (pH 7,4) driemaal.
3. Voeg 1 ml verse warme HEPES-PSS buffer onmiddellijk voorafgaand aan het begin van de opname.
4. Voer de initiële beeldvorming met behulp van de FRET SE (gesensibiliseerde Emission) applicatie (of soortgelijke functie) op de confocale microscoop bijbehorende software.
   1. Zodra de toepassing is geopend, klikt u op het tabblad "Setup" om de instellingen aan te passen om de gewenste experimentele omstandigheden te bereiken.
   <li> handmatig kanaal instellingen te wijzigen, zodat de cellen zijn verheugd in de juiste volgorde bij 440 nm (voor de donor en FRET-kanalen) en 513 nm (voor de acceptor kanaal). Verzamel de emissie golflengten bij 488 nm (voor donor) en 535 nm (FRET en acceptor).
   2. Stel de lichtintensiteit bij 15% transmissie met 150 ms excitatie belichtingstijd van cellen (opnametijd voor drie opeenvolgende GVB donor, FRET en YFP acceptor kanalen) en 10 sec interval tussen belichtingen.
5. Stabiliseren plaat op de microscoop podium.
6. Gebruik de "Live" knop om de beeldresolutie te controleren. Tweak instellingen verder tot de gewenste resolutie wordt bereikt.
7. Nog steeds onder de tab "Setup", neem een ​​beeld van het monster met behulp van de "image Capture" knop.
8. Verhuizen naar het tabblad "Evaluation", kiest u de juiste methode voor de berekening van de FRET-efficiëntie voor de experimenten gedaan. Methode 3, met het Ratiometrische Calculation _[L (i) = B / A], Wordt aanbevolen voor experimenten met kameleons zoals de D1SR indicator.
9. Schakel over naar het tabblad "Graph" te kunnen waarnemen van de intensiteit waarden worden opgenomen in grafiek vorm tijdens het experiment.
10. Teken een ROI in de image viewer om de corresponderende gemiddelde intensiteit van dit gebied van de rente op de grafiek als het experiment opbrengst observeren.
    LET OP: Investigator kunnen er ook voor kiezen om meerdere ROI te trekken en hebben overeenkomstige intensiteiten worden vastgelegd en tegelijkertijd weergegeven op de grafiek. Als alternatief kan de onderzoekers een ROI voor de eerste opname te schetsen, en ga verder met meerdere ROI's op een later tijdstip te schetsen door het openen van het experiment bestand op een data-analyse-georiënteerde versie van de software.
    LET OP: Verdere details over de stappen die nodig zijn voor het opzetten van FRET-gebaseerde experimenten kan worden gevonden in FRET toepassing tovenaar handleidingen. Als de microscoop niet is uitgerust met de FRET Wizard, kan het volgende protocol worden gebruikt voor het opzetten van de parameters voor deopname handmatig.
11. Opname starten en laat gegevensverzameling ten minste 3 minuten om een ​​constante basale opname van het signaal zorgen vóór het inbrengen van het middel plaats.
12. Introduceren Ca2 ⁺ -moving middel (bijvoorbeeld 2 uM thapsigargin; 100 nm endotheline-1) als instrument voor afbreken SR Ca ^2+, door handmatig de voorafbepaalde dosis direct pipetteren in de plaat op een plek zo dicht bij het ​​interessegebied wezen opgenomen mogelijk. Continue opname voor een gewenst tijdstip na de behandeling.
13. Capture ratiometrische FRET seriële beelden (512 x 512 pixels) met een 63x olie-immersie objectief van de confocale omgekeerde microscoop met behulp van de FRET SE applicatie.
14. Verzamel gegevens als gevolg van beeldvorming uit een cluster van 5-10 SMC in elke regio van belang (ROI) en vervolgens te formatteren en te analyseren met behulp van statistieken op basis van software.
    1. Als u gegevens opslaan voor later gebruik, met de rechtermuisknop op op het opgenomen spoor en kies de optie "Exporteren" naar save de spreadsheet met opgenomen gemiddelde signaal intensiteiten op de gekozen schijf van de onderzoeker.
    2. Normaliseren van de gegevens van elke individuele experiment door het verdelen van elk gegevenspunt door het starten van de intensiteit waarde waargenomen op tijdstip 0 sec.
    3. Import genormaliseerde gegevens van spreadsheets in een statistisch programma project bestand handmatig kopiëren en plakken relevante gegevens rijen van hun oorspronkelijke spreadsheet / sec.
    4. Automatisch genereren grafieken corresponderend met de gegevensverzamelingen geplakt in het programma.
       LET OP: De standaardinstellingen van de programma's te genereren lijn grafieken van geïmporteerde data. Type grafiek weergegeven kan worden gewijzigd door te klikken op de "Kies een ander soort graph" knop onder de "Change" rubriek te vinden in de belangrijkste werkbalk.
    5. Pool data die meerdere onafhankelijke onderzoeken binnen een grotere groep van identieke experimenten in een enkele data sheet op een gemiddelde trace voor de specifieke test uitgevoerd te produceren.
4. Bereiding van de cytoplasmatische Ca2 ⁺ Indicator
1. Los op 0,0125 g Pluronic Acid (PA) in 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO) in een zwarte microcentrifugebuis (Het kan zijn dat de buis te verwarmen in mobiele waterbad te helpen bij het oplossen PA).
2. Haal een buis (50 ug) van het cytoplasmatische Ca2 ⁺ indicatorkleurstof (Fluo-04:00) vanaf -20 ° C bewaren.
3. Wikkel de buis van kleurstof in folie om het zoveel mogelijk te beschermen tegen contact met licht.
4. Pipetteer 45 ul van de DMSO + PA oplossing in de buis met de kleurstof. Wikkel DMSO + PA-oplossing in folie en bewaar bij kamertemperatuur.
5. Meng de inhoud van de buis grondig door pipetteren oplossing op en neer meerdere keren. Als alternatief, ultrasone trillingen de kleurstof buis gedurende 10 minuten.
   OPMERKING: Beide methoden grondig te verdelen de kleurstof gehele DMSO + PA oplossing voldoende is; het is gewoon een kwestie van de voorkeur van de onderzoeker. Als onderzoeker kiest voor oplossing ultrasone trillingen, is hetmoet worden gedaan in een afgelegen gebied / ruimte waar anderen zullen worden beïnvloed door het lawaai. Onderzoeker moet ook zware dempers gebruiken om de oren te beschermen.
   1. Als sonicating oplossing, steek-folie verpakte buis met de kleurstof in een schuim buishouder en plaats binnen de 2/3 (met dH ₂ O) sonicator bad.
   2. Plaats ultrasoonapparaat bad in afgelegen gebied / kamer en macht machine op (zorg beschermende hoofddeksels is op zijn plaats voorafgaand aan het initiëren van sonicatie proces). Laat ruimte en laat de machine lopen voor 10 minuten voordat het wordt het af en ophalen van de buis (houden gewikkeld in folie ter bescherming tegen licht voor zo lang mogelijk).
6. Aliquot de inmiddels grondig gemengde oplossing in donkere microcentrifugebuizen (5 ul per buis, moet in staat zijn tot en met 10 tubes in totaal te maken).
7. Wikkel elk monster buis in folie. Label buizen en op te slaan in droogmiddel bij -20 ° C voorwaarden tot gebruik.

5. Meting van cytoplasmatische Ca ²⁺

1. Volg de stappen in 1,1-1,12 cultuur platen van de rat aorta SMC's te bereiden.
2. Verwijder het kweekmedium van de plaat op 48 uur na de cultuur.
3. Verwijder de eerder bereide monster van cytoplasmatisch Ca2 ⁺ indicator (5 ui) van -20 ° C opslag en handhaven mobiele ijsbad tot gebruik.
4. Was de kweekplaat met 1 ml warm fysiologische HEPES-buffer met PSS (in mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glucose 10, KCl 5, 5 HEPES, 1,5 _CaCl2 en 1 _MgCl2 (pH 7,4) driemaal.
5. Meng de indicator met 1 ml warm HEPES-PSS en te laden op de cultuur plaat.
6. Incubeer SMC met de indicator voor 1 uur bij kamertemperatuur (24 ° C).
7. Verwijder de indicator van de cultuur plaat en wassen met 1 ml warm fysiologische HEPES-PSS buffer drie keer.
8. Voeg 1 ml verse warme HEPES-PSS buffer onmiddellijk voorafgaand aan het begin van de opname.
9. Capture seriële beelden (512 x 512 pixels) met een 63x oil-immersie objectief van de confocale omgekeerde microscoop.
   1. Handmatig te wijzigen instellingen, zodat de cellen zijn enthousiast bij 488 nm en de emissie golflengtes worden verzameld bij 555 nm met een scansnelheid van 700 Hz.
   2. Stel de lichtintensiteit bij 15% transmissie met 150 msec blootstelling excitatie moment van cellen (de hoeveelheid tijd die cellen worden blootgesteld aan licht op aangewezen tijdstippen tijdens de opname) en 5 sec interval tussen belichtingen.
10. Stabiliseren plaat op de microscoop podium en start de opname.
11. Neem gedurende minimaal 3 minuten om een ​​constante basale opname van het signaal zorgen vóór het inbrengen van het middel plaats.
12. Introduceer Ca ²⁺ -moving middel (bijvoorbeeld 2 uM thapsigargin) als een instrument voor het afbreken SR Ca ²⁺ (zoals beschreven in stap 3.16) en blijven opnemen voor de gewenste hoeveelheid tijd na de behandeling.
13. Record intensiteit van het signaal met behulp van microscoop-specifieke software door het gemiddelde van fluorescentie signals (F / F ₀₎ uit een cluster van 5-10 SMC in elke regio van belang (ROI). Verzamel, formaat, en gegevens die voortvloeien uit beeldvorming met behulp van data-analyse software te analyseren. Zie Steps 3.18.1-3.18.5 voor de beschrijving van het verzamelen van gegevens en analyse met behulp van deze software.

Representative Results

Deze sectie geeft voorbeelden van de resultaten die kunnen worden verkregen volgens de werkwijze die werd beschreven SR luminale Ca2 ⁺ -concentratie data vastleggen, vergeleken met de gewoonlijk gebruikte wijze van indirect meten van veranderingen in Ca2 ⁺ concentraties organel opslag door het observeren schommelingen in cytoplasmatische Ca2 ⁺ .

Figuur 1A toont een momentopname van een van belang (ROI) van de SMC kweek getransfecteerd met adenovirus D1SR in de YFP kanaal (514 nm excitatie / 535 nm emissie). Zoals getoond, alhoewel SMC positief zijn voor D1SR expressie, is het duidelijk dat de expressieniveaus van D1SR indicator variëren tussen verschillende cellen in dezelfde ROI. Figuur 1B toont een 2-D projectie een fluorescentiebeeld van een SMC of getransfecteerd met de D1SR adenovirus (YFP kanaal), die een duidelijk beeld van Ca ²⁺ distributie presenteertbinnen het uitgestrekte SR luminale netwerk. Figuur 1C toont D1SR indicator distributie in de SMC met behulp van GVB (440/488 nm), FRET (440/535 nm) en YFP (514/535 nm) band-pass filters.

We tonen ook voorbeelden van de Ca2 ⁺ signaal sporen verkregen uit het monitoren van de beweging van deze gerichte ionen in de SR, met de duidelijke test van acute blootstelling van cellen aan een SR legen middel thapsigargin (2 pM) (Figuur 2). Zoals getoond in figuur 2A en 2B, thapsigargin induceert een daling van SR Ca ²⁺ gehalte ([Ca2 ^+] _SR).

In figuur 3A, hebben we aangetoond representatieve beelden van gekweekte SMC geladen met de cytoplasmatische Ca2 ⁺ indicator behandeld met de SR legen middel thapsigargin (2 uM). De waargenomen kortstondige piek in opgenomen Ca ²⁺ signaal ( + afgifte in het cytoplasma van de SMC, hoewel de bron van de Ca2 ⁺ transiënten niet uitdrukkelijk worden geïdentificeerd.

Figuur 4A toont representatieve momentopnamen van gekweekte gladde spiercellen tot expressie SR calciumindicator D1SR en behandeld met 100 nm van endotheline-1. Zoals getoond in zowel figuren 4A en 4B, endotheline-1 induceert een langzame maar gestage daling SR calciumgehalte zoals gemeten door een afname van D1SR FRET signaal. Zoals blijkt, de ratiometrische FRET protocol maakt belangrijker studie Ca2 ⁺ bewegingen direct gerelateerd aan de werking van het middel toegepast. Direct meten beweging van dit ion in / uit de grootste Ca2 ⁺ opslag in de cel op deze wijze is behulpzaam bij het ​​verstrekken ²⁺ dynamiek rechtstreeks betrekking hebben op de acties van de SR of door verandering resulteert representatief Ca s in SR lumen omgeving.

Figuur 1. Verdeling van de SR Ca ²⁺ indicator D1SR in rat aorta SMC. (A) image Vertegenwoordiger beeltenis SMC cultuur getransfecteerd met D1SR andenoviral vector op 48 uur na infectie. (B) 2-D projectie een fluorescentie beeld van D1SR distributie in een beschaafde SMC met behulp van YFP kanaal (514 nm excitatie / 535 nm emissie) van. (C) Vertegenwoordiger momentopname van een SMC getransfecteerd met D1SR indicator met behulp van GVB (440/488 nm), FRET (440/535 nm) en YFP (514/535 nm) band-pass filters. Schaal bars = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

/files/ftp_upload/53912/53912fig2.jpg "/>
Figuur 2. Thapsigargin veroorzaakt een aanzienlijke daling van [Ca ^2,] _SR. (A) Realtime pseudocolor snapshots (FRET kanaal) van gekweekte rat aorta gladde spiercellen getransfecteerd met D1SR en behandeld met 2 uM thapsigargin tonen een afname in signaalintensiteit aangeeft een aanzienlijke daling van SR Ca ²⁺ gehalte te wijten aan-thapsigargin geïnduceerde Ca ²⁺ release. (B) Representatieve trace voor F / F ₀ waarde in gekweekte SMC's behandeld met 2 uM thapsigargin bevestiging van een aanzienlijke daling van de [Ca ^2+] _SR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Thapsigargin veroorzaakt een aanzienlijke verhoging van cytoplasmatische Ca2 ⁺ ([Ca2 ^+] _i). (A) Representatieve snapshots van gekweekte rat aorta SMC geladen cytoplasmatisch Ca2 ⁺ indicator, en behandeld met 2 uM thapsigargine. Zoals getoond thapsigargin veroorzaakt een aanzienlijke verhoging van de signaalintensiteit in het cytoplasma als gevolg van de afgifte van Ca2 ⁺ uit de SR. (B) Representatieve trace voor F / F ₀ waarde in gekweekte SMC's behandeld met 2 uM thapsigargin. De afgebeelde toename van Ca ²⁺ signaal wordt beschouwd als evenredig met de hoeveelheid van de Ca ²⁺ vrijgelaten uit de SR te zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Endotheline-1 veroorzaakt een aanzienlijke daling van [Ca ^2,] _SR. (A) Realtime pseudocolor snapshots (FRET kanaal) van gekweekte rat aorta gladde spiercellen getransfecteerd met D1SR en behandeld met 100 nm endotheline-1 met een langzame maar gestage afname van de intensiteit van het signaal wat wijst op een aanzienlijke daling van de SR Ca ²⁺ gehalte als gevolg van door endotheline geïnduceerde Ca ²⁺ release voor de SR. (B) Representatieve trace voor F / F ₀ waarde in gekweekte SMC's behandeld met 100 nm van endotheline-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit protocol beschrijft de transfectie van VSMCs de D1SR adenovirus Ca2 ⁺ concentraties bestuderen binnen het lumen van de SR. Deze werkwijze maakt het direct meten van Ca2 ⁺ in het organel en zijn beweging naar / uit de SR als gevolg van de toepassing van verschillende calcium bewegende middelen. Deze methode heeft veel voordelen voor onderzoekers werken aan een beter begrip van hoe veranderingen in SR en cytoplasmatische Ca ²⁺ niveaus invloed op de algehele gezondheid van de cellen en hoe deze veranderingen zijn met elkaar verbonden. Traditionele waarneming van intracellulair Ca2 ⁺ beweging omvat het volgen van veranderingen slechts cytoplasmatische Ca2 ⁺ niveaus. Een belangrijk voordeel dat voortvloeit uit het gebruik van de D1SR of soortgelijke constructen, dus de mogelijkheid om bewegingen van deze ionen met een specifieke organel controleren zoals SR, in plaats van vage conclusies over het effect van agonisten op de SR doorindirect waarnemen van veranderingen in cytoplasmatische Ca2 ⁺ niveaus geïnduceerd door dergelijke manipulatie. Langs dezelfde geest, agenten die dienen om invloed SR Ca ^{2 +} specifiek kan worden efficiënter gebruikt om hun effecten op zowel organel en mobiele-breed cellulair Ca ²⁺ concentratie en de algehele gezondheid te beoordelen. Het is vanwege deze voordelen dat transfectie van gekweekte cellen met D1SR een meer directe, evenals gratis methode om metingen te intraluminale SR Ca2 ⁺ niveaus. Van belang is dat dit model een werktuig voor het meten van veranderingen in Ca2 ⁺ -concentratie in de SR netwerk in reactie op fysiologische of farmacologische middelen waarvan bekend is dat cellulaire stress of specifieke functionele responsen induceren. Dit is mogelijk door het genereren van een kalibratiecurve voor D1SR indicator in een cel van belang. Calciumconcentratie binnen de ER / SR kan dan worden berekend door het kalibreren van genormaliseerde D1SR ratio (F / F ₀) Tegen de standaard kalibratiekromme eerder ^{10, 11} beschreven.

Een beperking van de hier geschetste protocol is het gebrek aan informatie over het gebruik van de D1SR construct in andere celtypen. Deze werkwijze heeft tot nu toe succesvol rat SMC's blijkt in onze studies meerdere keren ^13-15, maar het gebruik ervan met andere celtypen tot dusver beperkt. Voor het succes van deze werkwijze is het essentieel dat alle voorzorgsmaatregelen zijn genomen om de gezonde progressie van de celkweek stappen garanderen. Het is daarom belangrijk om een ​​geschikt materiaal zodat celgroei op platen, zoals de vele eiwit gebaseerde gelatineachtige stoffen verkrijgbaar die bewezen voldoende groei van de rat aorta gladde spiercellen op glazen bodem microscopie platen bevorderen gebruiken. Variabiliteit in het succes van transfectie met D1SR en daaropvolgende beeldvorming kan worden waargenomen wanneer de cellen niet in hun optimale passages en bij hoge confluentie bereid. Wijzigingen in phenotype inherent aan langdurig gebruik van dezelfde cellijn kan resulteren in een suboptimale transfectie en zwak signaal wordt verkregen tijdens de beeldvorming podium. De beperkingen betrokken bij het gebruik van deze werkwijze zijn ook vooral die gemaakt onvermijdelijke de vereiste celkweek werken, zoals experimenten met de D1SR construct worden bereid ten minste 36-48 uur vóór de uitvoering tot confluentie cellen zorgen voor beeldvorming en voldoende tijd voor de incubatie van groeiende cellen met het adenovirus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.