Introduction
As plantas são amplamente utilizados para produzir produtos alimentares, tais como sucos de frutas, mas eles também podem ser desenvolvidos como plataformas para a fabricação de maior valor produtos biofarmacêuticos 1-3. Em ambos os casos, o processamento a jusante (DSP) geralmente começa com a extracção de líquidos a partir de tecidos, tais como folhas ou frutos, seguida pela clarificação dos extractos de partículas carregadas de 4,5. Para a fabricação de produtos biofarmacêuticos, os custos de DSP podem ser responsáveis por até 80% dos custos globais de produção 6,7 e isso em parte reflete a alta de partículas carga presente em extratos preparados por métodos perturbadores, como a homogeneização baseada em lâmina 8,9 . Embora a selecção racional de camadas de filtro para igualar a distribuição de tamanho de partícula no extracto pode aumentar a capacidade do filtro e reduzir os custos de 10,11, a melhoria nunca poderá exceder o limite máximo da capacidade absoluta definida pelo número de partículas que deve ser retida porunidade de área de filtro para obter esclarecimentos.
O limite pode ser levantada, se menos partículas alcançam a superfície dos filtros mais finos no trem de filtração, e isto pode ser conseguido se partículas dispersas são misturados com polímeros conhecidos como floculantes que promovem agregação para formar flocos grandes 12. Tais flocos pode ser retido mais a montante pelos filtros grossos e menos caros saco, reduzindo a carga de partículas de alcançar o mais finos e filtros de profundidade mais caros. Os polímeros devem ter perfis de segurança adequadas para as suas aplicações, por exemplo, para biofármacos eles devem estar em conformidade com as boas práticas de fabricação (BPF), e, normalmente, eles devem ter uma massa molar> 100 kDa e pode ser neutro ou carregado 13. Considerando floculantes neutros actuam geralmente através de ligação cruzada partículas dispersas causando a sua agregação e a formação de flocos com diâmetros> 1mm 11, polímeros carregados neutralizar a carga de dispersed partículas, reduzindo a sua solubilidade e assim causando a precipitação 14.
A f loculação pode ser melhorado ajustando os parâmetros tais como pH ou a condutividade, e o tipo de polímero ou concentração, para combinar as propriedades do extracto 15,16. Para extractos de tabaco pré-tratados com 0,5-5,0 g L-1 de polietilenimina (PEI), um aumento superior a duas vezes na capacidade do filtro de profundidade foi relatado num processo à escala piloto 100-G. O custo deste polímero é inferior a € 10 kg -1 pelo que a sua introdução no processo resultou em economia de custos de cerca de € 6.000 para filtros e consumíveis por lote de 16 ou ainda mais quando combinado com ajudas filtração de base celulósica 17. Mesmo assim, modelos preditivos são necessários para avaliar os benefícios económicos a priori de floculantes porque a sua inclusão pode exigir etapas de espera de 15-30 min 16,18, resultando em mais custos de investimento para o armazenamentotanques. No entanto, não existem actualmente modelos mecanicistas disponíveis que podem prever o resultado de tais experiências, devido à natureza complexa de floculação. Portanto, uma abordagem de concepção de experiências-mais adequadas (DOE) 19 foi desenvolvido como descrito neste artigo. Um protocolo para o procedimento geral DoE foi recentemente publicada 20.
Dispositivos de pequena escala estão agora disponíveis para o rastreio de alto rendimento de condições de floculação 21. No entanto, estes dispositivos podem não realista simular as condições durante a floculação de extractos de plantas, porque as dimensões do vaso de reacção (~ 7 mm para os poços de uma placa de 96 poços) e as partículas ou flocos pode ser menor do que uma ordem de magnitude de intervalo. Isso pode afetar misturar padrões e, portanto, o poder preditivo do modelo. Além disso, pode ser difícil de reduzir os processos que envolvem precipitação devido às mudanças não lineares no comportamento de mistura e STA precipitadodade 22. Portanto, este artigo descreve um sistema de triagem-top-escala de bancada com um rendimento de 50-75 amostras por dia, produzindo resultados que são escaláveis do volume de reacção de 20 ml inicial para um processo em escala piloto 100 L 16. Quando combinado com uma abordagem DoE, isso permite que os modelos de previsão a ser usado para otimização de processos e documentação como parte de um conceito de qualidade-by-design.
O método descrito abaixo também pode ser adaptado para biofármacos produzidos em processos baseados em cultura de células, onde floculantes também estão sendo considerados como uma ferramenta de redução de custos 23. Ele também pode ser usado para modelar a precipitação de proteínas-alvo a partir de um extracto bruto, como parte de uma estratégia de purificação, como foi demonstrado para β-glucuronidase produzidas em canola, milho e soja 24,25. Uma descrição detalhada das propriedades floculantes podem ser encontrados em outros lugares 16,26 e é importante para assegurar que o polímero concentrções são ou não-tóxico ou abaixo dos níveis prejudiciais no produto final 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Desenvolver uma estratégia experimental adequado
- Identificar os parâmetros ambientais e de processo que são relevantes para o processo de floculação a ser estabelecida ou otimizado, ou seja, quais os factores que têm o efeito mais forte sobre floculação. Tipicamente, existem várias de tais parâmetros para uma abordagem recentemente descrita como corça de 20 é necessária devido à falta de modelos mecanísticos.
- Selecione os parâmetros (fatores) com base em dados da literatura 12, prévio conhecimento e experiência com o sistema. Factores típicos incluem pH, condutividade tampão, tempo de incubação e temperatura, bem como o tipo de polímero e a concentração 15,16,27.
- Use as mesmas referências (ver 1.1) para definir intervalos significativos para cada fator numérico e os níveis de fatores categóricos.
- Definir os resultados experimentais (respostas) a ser monitorizado e utilizado para avaliar a eficiência de floculação. Dependendo do sistema, estepode ser turvação do filtrado ou sobrenadante, velocidade de sedimentação, o tamanho global ou a capacidade de um filtro posterior 16,23,28-30.
- Assegurar os ensaios utilizados para medir as respostas são quantitativas, robusta e repetível / reproduzível para que os dados de alta qualidade resultante pode ser aumentada com experiências realizadas depois ou por outro operador.
- Escolha um tipo DoE adequando o número de fatores a serem investigados e o grau de conhecimento já acumulado sobre o sistema. Use literatura disponível para identificar um tipo DoE adequado 20.
- Escolha um design de triagem, se há pouca informação sobre o sistema de floculação a ser investigado, um grande número de parâmetros devem ser rastreados ou pouco se sabe sobre faixas significativas para os parâmetros. projetos de triagem típicos são projetos completos e fracionário. Incluir pontos centrais na concepção, se espera-se que os parâmetros a ter um impacto não-linear, por exemplo, 19.
- Selecione uma metodologia de superfície de resposta (RSM), por exemplo, centro de design composto (CCD) 31 ou óptima 32,33, se apenas alguns fatores com faixas bem conhecidas precisam ser caracterizados com precisão.
- Configure o DoE com software apropriado, garantindo um critério de qualidade a priori, como a fração de espaço de projeto são atendidas 20.
2. Prepare as experiências de floculação
Figura 1: Extrato vegetal floculação fluxo de trabalho: escala de processo (esquerda) e escala de bancada (direita). Após a extracção de proteína com tampões aquosos, partículas dispersas de detritos celulares são agregados por adição de floculantes. Os agregados são então removidos por uma cascata de saco e a profundidade de filtragem e a capacidade de estesfiltros, juntamente com os turbidez do filtrado pode ser utilizado directamente para medir a eficiência de floculação.
- Desenvolver um Experimental fluxo geral de trabalho (Figura 1).
- Usar um dispositivo de extracção que resulte na mesma distribuição de tamanho de partícula que o esperado (ou já observada) na escala de aplicação final, por exemplo, um homogeneizador especializado. Se possível, conceber um modelo em escala reduzida do extractor, como descrito para a homogeneização de folhas de tabaco 10.
- Definir os volumes de extracto utilizado durante as experiências de floculação (aqui 20 mL). Seleccionar um volume que permite que um número representativo de partículas estar presente no vaso de reacção, por exemplo, experiências de floculação em alíquotas de 20 ml produziram resultados reprodutíveis e escalável para extractos de tabaco contendo ~ 7% [W / V] sólidos 34 e os tamanhos de partículas de ~ 0,5 um a três milímetros ~ 16.
- Projetar todas as operações de controlo e de pós-floculação para que they são representativas da escala de aplicação final, por exemplo, selecionar filtros com o mesmo comportamento de retenção de partículas como os usados na produção em escala.
- Cultivar as plantas de que os extratos serão derivadas.
- Usar a mesma linha planta, aqui Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, e condições de cultura que serão utilizadas durante a produção, conforme anteriormente descrito 33.
- Se outras unidades populacionais de alimentação serão processados, preparar estes stocks de alimentação de modo que sejam representativas da escala de aplicação final, por exemplo, usar tampões autênticos, ter em conta quaisquer passos de diluição durante o processo e manter o pH antecipada e condutividade, aqui pH 7,5 e condutividade 30 ms cm -1.
- Prepare filtração Utilities, dispositivos de controlo da turvação e Vasos de amostragem.
- Corte os materiais de filtro para, os tamanhos necessários aqui 15 x 15 cm 2, se eles não estão prontos para nóse módulos. Certifique-se de todos os dispositivos de monitoramento e análise são funcionais e rotular todos os tubos de amostra.
- Mesmo que estes são tarefas simples, preparar esses itens em tempo para garantir que eles não vão causar interrupções durante os experimentos de floculação reais. Evitar atrasos porque pode interferir com os resultados dados que floculação é um processo dependente do tempo.
- Preparar soluções floculante de Stock. CUIDADO: Use equipamentos de proteção individual adequados ao manusear floculantes, por exemplo luvas. Os materiais podem ser perigosas (etiquetas de perigo de acordo com a Europa UE 67/548 / CEE, 1999/45 / CE incluem N, Xi ou Xn). Evitar a poeira e consulte as folhas de dados de segurança. Trabalhar sob uma coifa.
- Escolha uma concentração de ações para cada floculante, aqui 80,0 g L -1 para os dois floculantes PEI que foram usados. Seleccione concentrações tão altas quanto possível para evitar a diluição da amostra ao adicionar o floculante, o que reduziria a Concentra partículação e, portanto, afetam a eficiência da floculação.
- Conta para qualquer pré-diluição que reflete formulação do fabricante do polímero, por exemplo, se o polímero já é fornecido como um aquoso a 50% [w / v] solução. soluções de floculante de 4-8% [W / v] foram encontrados para ser o mais adequado, até agora.
- Tendo em mente os pontos discutidos acima, certifique-se a concentração de floculante não gera uma solução altamente viscosa que inibe pipetagem, potencialmente causando erros porque a concentração de floculante final não está ajustado corretamente.
- Utilizar a mesma concentração de estoque para todos os floculantes se possível, porque isto irá facilitar a instalação de um esquema de pipetagem (2,5), reduzindo assim a probabilidade de erros.
- Ajustar o pH e a condutividade de cada solução de estoque floculante para coincidir com as condições de os extractos, aqui pH 4-10 e 15-55 condutividade mS cm @ 1. Prepare ações individuais para um único floculante se mais de um conjunto de condições de pH e / ou a condutividade é testado para esse polímero.
- Preparar soluções de floculantes recentemente, não mais do que 48 horas antes do uso. Embora a floculação pode ser induzida com estoques de polímero armazenados durante mais de 4 semanas, a eficiência pode diminuir devido à hidrólise do polímero de a valores de pH alto ou baixo. Consulte a documentação do fabricante para obter mais detalhes.
- Certifique-se de que os parâmetros seleccionados para o Departamento de Energia pode ser ajustada com precisão para cada amostra durante a experiência, por exemplo, assegurar que não banhos de aquecimento / arrefecimento disponíveis para ajustar as temperaturas de incubação, aqui 4 ° C, 20 ° C e 37 ° C. Se a mistura durante a floculação faz parte do experimento, garantir que o dispositivo de mistura é representativa da escala de aplicação final, em termos de parâmetros críticos, tais como entrada de energia.
- Converter o Horário DoE em um esquema de pipetagem.
- Convertem-se as diferentes concentrações de floculação ser TESted em volumes da solução de reserva que serão adicionados às amostras de extracto: dividir as concentrações finais floculante pela concentração de ações e multiplicar pelo volume de amostra utilizada nos experimentos de floculação. Identificar o maior volume final resultante, por exemplo, se 20 ml da amostra é misturada com um máximo de 2 ml de solução floculante esta será de 22 ml.
- Calcular volumes de tampão necessário para manter o mesmo volume final em todas as alíquotas de floculação com base no maior volume de estoque floculante ser adicionado, por exemplo, se 0,75 ml de estoque floculante deve ser adicionada a uma amostra, em seguida, 1,25 ml de tampão é necessário para manter o volume final de amostra de 22 ml (2.5.1).
- Soma-se os volumes da solução de floculante para cada condição de polímero e floculação para calcular os volumes absolutos de solução estoque que são necessários para o Departamento de Energia.
- Folhas da colheita de tabaco e preparar o extracto.
- Remova os seis top leaves (ou como muitos como indicado por nas instruções de processo) a partir de plantas de tabaco de uma idade apropriada, por exemplo, 6 semanas de idade, e transferir para um dispositivo de extracção adequado, tal como um homogeneizador ou parafuso de imprensa.
- Adicionar três volumes de tampão de extracção por grama de biomassa, por exemplo, 300 ml por 100 g, e misturar durante 8 minutos.
- Prepare extratos individuais com os amortecedores adequados se o pH e / ou condutividade diferentes estão sendo testados. Aqui, trata-se homogeneizar o material vegetal para 3 x 30 segundos em um liquidificador ou um espremedor 34.
- Em alternativa, preparar o extracto de um modo que é representativa do processo sob investigação.
- Alíquota da Extract e adicionar o buffer.
- Manualmente e agitar completamente o extracto durante todo o processo para assegurar que as amostras são homogénea com uma distribuição uniforme de partículas.
- Precisamente distribuir o extracto de entre os tubos de reacção pré-marcadas por decantação,aqui 20 ml em cada navio. Autónomo tubos de 50 ml simplificar a manipulação e são ideais para amostras de 20 ml.
- Adicionar o volume de cada tampão de extracção necessária para manter o volume final fixo para cada tubo de reacção individuais, usando uma pipeta apropriada.
3. flocular a extratos de plantas com diferentes Polymers
- Pipetar o volume necessário de solução de floculante, aqui 0,1-2,0 ml, para as amostras sequencialmente, como indicado pela ordem de execução aleatória do DoE. Misturar bem cada amostra imediatamente depois da adição do floculante por intensa agitação manual, precisamente por 20 seg.
- Se necessário, ajustar o tempo de agitação para outras unidades populacionais de alimentação para assegurar uma mistura completa, mas estritamente garantir tempos de mistura consistentes para todas as amostras. Tenha em mente que prolongada de mistura pode causar o rompimento irreversível de flocos e de forma inconsistente força aplicada durante a agitação pode distorcer os resultados de floculação.
- Opcional: Modificar o procedimento descrito acima para a aplicação simultânea de dois ou mais floculantes.
- Opção 1: Em vez de um único polímero adicionar uma mistura de dois ou mais floculantes, aqui PEI e quitosano. Use as combinações de floculante definidos no DoE. Incorporar a proporção e as concentrações absolutas dos polímeros como parâmetros individuais durante a configuração Doe (1.1).
- Opção 2: Adicionar dois ou mais polímeros sequencialmente ao extracto.
- Use as concentrações individuais de polímeros, o seu tipo, e o tempo de incubação entre cada adição ao extrato, como factores adicionais durante a instalação do DoE.
- Também usar esta abordagem para testar se a adição repetida de um único polímero pode melhorar a floculação. Utilize uma adição por passos para simular a adição lenta de um floculante, por exemplo, quatro passos, cada adição de 0,25 ml de 80 g da L -1 floculante para um volume de 20 ml durante 4 min pode imitar a adição de floculante comuma taxa de fluxo de 0,25 ml min -1.
- Em todos os casos, identificar um novo volume máximo da amostra final para esta configuração, adicionando o volume máximo de todos os floculantes para o volume da amostra, aqui ainda 22 ml, e recalcular as quantidades necessárias de soluções-mãe de floculação e tampões para o ajuste de volume, se necessário.
- Incubar as amostras durante os tempos definidos na gama, tipicamente 3-30 min, para permitir a formação de flocos. Certifique-se de todas as outras condições de incubação, temperatura, por exemplo, são definidas de acordo com o DoE.
- Observe e formação de flocos documento. Registar a evolução da formação de flocos, conforme necessário, por exemplo, como mm de flocos sedimentação por min medindo a altura dos sólidos sedimentados. Se necessário, prolongar a floculação por um período de tempo prolongado tal como durante a noite.
- Filtrar o extracto floculada.
- Use os materiais de filtro preparado anteriormente (2,3) para esclarecer o extrato floculada após a adequadatempo de incubação por decantação as amostras floculadas através do material de filtro e para dentro de um tubo ou recipiente de reacção limpo.
- Não re-suspender os flocos resolvida antes de filtração e aplicar o extracto com a uma taxa de ~ 300 ml min -1 para o filtro, correspondente a 4/3 seg para uma amostra de 20 ml.
- Confirmar o desempenho do passo de filtração, se um material diferente é utilizado nas experiências de bancada em comparação com o processo final em termos de retenção de partículas, por exemplo por medição da distribuição do tamanho de partícula em ambos os tipos de amostras 11.
- Analise-se o filtrado em termos de turbidez e / ou distribuição do tamanho de partículas usando dispositivos apropriados como necessários, por exemplo, um turbidímetro.
- Opcional: repetir a análise depois de tempos de incubação prolongados, por exemplo, 12-24 horas, para investigar a formação ou reforma dos flocos instáveis.
- Use os materiais de filtro preparado anteriormente (2,3) para esclarecer o extrato floculada após a adequadatempo de incubação por decantação as amostras floculadas através do material de filtro e para dentro de um tubo ou recipiente de reacção limpo.
- Analisar as amostras em termos do PrRespostas definida-e (1.1.3).
- Retirar amostras a partir dos filtrados e analisá-los para os parâmetros adicionais de resposta, por exemplo, as concentrações de diferentes proteínas alvo ou produtos valiosos.
- Opcional: Analisar o retido (principalmente de sólidos) para os mesmos parâmetros para fechar o balanço de massa do processo. Em particular, quantificar o efeito de floculantes sobre a recuperação do líquido, comparando os sólidos remanescentes depois de massa amostras são tratadas ou não tratadas com floculante.
- Confirmar a qualidade dos dados e transferir os resultados para o software DoE.
- Procure por valores extremos nos dados de resposta coletados, por exemplo, valores inesperadamente elevados.
- Assegurar que todos os dados de resposta estão corretamente alinhados com as suas condições experimentais correspondentes.
- Transferir os resultados para o software DoE e certifique-se as ordens de execução padrão e randomizados não são misturados.
4. Avaliaro DoE
- Use as ferramentas de análise de dados built-in do software DoE para desenvolver um modelo preditivo, como descrito anteriormente 20.
- Selecione um modo de transformação de dados adequada, se necessário para facilitar a construção de modelos, aqui log 10. Uma proporção maior do que 10 para maior vs menor valor de resposta indica que uma transformação de dados pode ser necessária. Identificar a transformação mais adequado utilizando as ferramentas estatísticas adequadas, por exemplo, uma trama Box-Cox 35.
- Escolheu um modelo básico que (i) se encaixa com o DoE seleccionado (1,2) e (ii) concorda com conhecimento prévio sobre o sistema sob investigação com base na análise de variância (ANOVA) ferramentas do software DoE, por exemplo, um polinômio de segunda ordem muitas vezes se encaixa melhor para o efeito observado do tempo de incubação do que um polinômio de primeira ordem.
- Retirar fatores insignificantes modelo, por exemplo p> 0,05, ou interações de fator de forma iterativa, desmarcando-los, oreby reduzindo a complexidade do modelo e aumentando seu poder preditivo.
- Confirmar a qualidade do modelo, comparando R 2, R 2 ajustado e previu R 2 juntamente com o gráfico de probabilidade normal dos resíduos studentized, os resíduos-vs-run, previu-vs-real e Box-Cox parcelas 36. Todos os valores de R 2 deve estar dentro de uma gama de 0,2.
- Certifique-se de que o modelo final está de acordo com os pressupostos básicos da física e da termodinâmica, por exemplo, não há concentrações negativas estão previstas.
- Use o modelo para prever as condições mais favoráveis para o sistema sob investigação, aqui uma baixa turbidez.
- Selecione as respostas mais importantes e seus estados preferenciais, por exemplo, turbidez mínima. Combine estas selecções, maximizando a função de preferência ou ferramentas similares, que são built-in características de vários pacotes de software DoE 36.
- Consoante a aplicação a que se destina of o modelo, selecione confirmação é executado para verificar as condições óptimas e / ou o poder preditivo do modelo, em geral, por exemplo, se as condições prevista para ser mais favorável não faziam parte do DoE inicial selecioná-los como experimentos de acompanhamento.
5. melhorar o modelo e verificar o poder preditivo
- Limitar o espaço de design inicial para as condições de operação mais desejáveis, por exemplo, baixa turbidez na faixa de 0-1,000 unidades de turbidez nefelom�tricas (NTU), com base nas previsões do modelo (4.2).
- Configurar uma nova DoE dentro destas gamas, incluindo apenas os fatores que foram identificados como significativo ou relevante (4.1.2)).
NOTA: Um factor pode ser significativa em termos de análise de modelo, mas irrelevante para um processo, isto é o seu efeito sobre uma resposta é <1% comparado com o de outros factores. - Repita os passos 1-5,2 até que a qualidade das previsões do modelo coincide com os requiremenTS, por exemplo, o desvio padrão do modelo, tal como indicado pelo software é suficiente para a aplicação pretendida. Modificar a estratégia experimental, se necessário para estas iterações, por exemplo, usar apenas um floculante no refinamento.
- Transferir e confirmar os resultados do modelo de escala até a escala piloto ou escala de produção final.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A floculação do extracto de tabaco com diferentes polímeros
O método descrito acima foi utilizado com sucesso para desenvolver um processo para a floculação de extractos de tabaco durante o fabrico de um anticorpo monoclonal (o anticorpo de HIV-neutralizante 2G12) e uma proteína fluorescente (DsRed) (Figura 1) 16, e uma vez que tenha sido transferida a outras proteínas incluindo lectinas, candidatos a vacinas contra a malária e proteínas de fusão (dados não publicados). Tipicamente, a aplicação de floculantes reduzido a turbidez do extracto vegetal filtrou-saco de ~ 6000 NTU (10.000 NTU, após extracção) a ~ 1000 NTU. Em um experimento triagem inicial, um projeto de 91-run IV-óptima foi usado para testar 18 diferentes polímeros em três concentrações diferentes (porque este fator afeta a eficiência de floculação 13,27) e observada floculação sobre um hr perio incubação ~ 12d (Figura 2A e B). O longo período de incubação pode ser importante para identificar os intervalos de tempo significativos para o processo de floculação. Também valores de pH de 4-8 foram testados porque estes podem ser relevantes em futuros processos, devido às propriedades das proteínas-alvo específicos 13,25,27,37. Entre os 18 polímeros testados, seis foram encontrados para reduzir extracto de turbidez após a filtração em saco extractos típicos com uma condutividade de 25 mS cm @ 1.
O modelo foi refinado por exclusão de todos os polímeros ineficazes em duas iterações e, em seguida, incluindo os parâmetros de processo adicionais, tais como a condutividade nas 15-45 mS cm-1 gama, um tempo de incubação de 5-75 min e temperaturas de 4-30 ° C, para gerar modelos adequados para uma vasta gama de condições de processo. A capacidade de previsão do modelo aumentou depois de cada iteração, resultando em um modelo altamente fiável (Figura 3A). >
Depois de quatro iterações, o catiónico altamente carregada e polímero ramificado PEI foi encontrado para ser o mais eficiente para a agregação das partículas dispersas em extractos de tabaco. No entanto, a eficácia deste polímero diminuiu com o aumento da condutividade extracto. As propriedades de tamanho molécula, de carga, de estrutura (ramificado ou linear), densidade de carga e grau de substituição amina (primária, secundária, terciária ou quaternária) foram testados como fatores em um DoE e os dois últimos parâmetros teve o maior efeito. Os detalhes foram relatados em outros lugares 16. Com base neste conhecimento de propriedades do polímero a partir dos resultados Doe, cinco outros polímeros foram seleccionados com características moleculares semelhantes a PEI (densidade de carga> meq g -1 e amina quaternária). Uma dessas cinco polímeros demonstrou maior eficiência de floculação em condutividades mais elevadas (Figura 3B) 11.
nt. "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Como parte da abordagem DoE, confirmou-se que nenhum dos PIE afetados recuperação do produto em qualquer uma das condições testadas Na verdade, a capacidade dos filtros de profundidade usado posteriormente para remover restante sólidos dispersos aumento por um factor de 3,2-5,7, atingindo ~ 110 L m-2, dependendo do tipo de filtro. Estes resultados foram também confirmados num processo à escala piloto 100 L, em que para a aplicação de floculantes reduzida a clarificação os custos de produção relacionados com por> 50% e os custos totais de produção de ~ 20%.
Figura 2: Eficiência de diferentes floculantes sob diversas condições do processo (A). amostras de extrato diretamente após floculação e filtração saco ainda pode aparecer turva. (B) Depois de se estabelecer, durante várias horas, a turbidez domesmas amostras pode ser reduzida significativamente. No entanto, valores de turbidez obtidos imediatamente após a filtração são muitas vezes preferível, porque o tempo de espera prolongadas pode não ser possível em processos de fabricação em larga escala. (C) A f loculação é também eficaz quando aplicado a extractos de plantas geradas com uma prensa de parafuso, em vez de um misturador, tal como indicado pelo líquido vermelho claro na parte inferior dos tubos de 50 ml (a cor vermelha é devido à presença da proteína fluorescente DsRed ). (D) Misturas de diferentes floculantes também pode induzir floculação.
Figura 3:. Modelando floculação usando uma abordagem Doe (A) A precisão do modelo de previsões aumentou à medida que o número de polímeros em que o modelo foi reduzido de rastreio inicial a refinamento mesmo que o número de parâmetros de processo aumentou de two para cinco. (B) Ativação do tipo de polímero (aqui de um PEI para outro) como consequência de uma mudança de parâmetros do processo (aqui condutividade) mantém a floculação de partículas eficiente e baixa turbidez filtrado correspondente em relação ao extracto de controlo não-tratadas (linha vermelha sólida). As barras de erro em A e B indicam os desvios-padrão de previsões do modelo. Linhas vermelhas tracejadas indicam os desvios-padrão do extrato não tratado (n = 10). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Floculação do tabaco extratos preparados com uma prensa de parafuso
Os resultados de floculação também foram transferidos a partir de extractos de tabaco preparados com um homogeneizador com as preparadas com uma prensa de parafuso, o que gerou menos partículas dispersas na gama de tamanho mm, mas maispartículas na gama de tamanhos uM. Em uma 29-IV-run concepção óptima, foi demonstrado que a PEI é também eficaz para este tipo de extracto numa gama de concentrações semelhante e que a recuperação de proteínas-alvo não é afectada (Figura 2C). Isto demonstra que (i) as condições de floculação identificados para um tipo de material de alimentação pode ser, em certa medida transferidos para outros stocks de alimentação, economia de tempo durante o desenvolvimento do processo, e (ii) que a estratégia DOE pode ser utilizado para confirmar esta transferência não só para condições de processo individuais, mas ao longo de todo o espaço de design.
experimentos de floculação com misturas de floculantes
Combinações de floculantes podem ser mais eficazes do que os polímeros individuais, por exemplo, devido a ponte mais reforçada entre as partículas 12. Portanto, o método descrito acima foi adaptado para acomodar a adição de dois polímeros (3.2) 26. Três polímeros não sintéticos foram testados sozinhos, em combinação uns com os outros ou em combinação com a PEI. A floculação mais eficaz de extractos de tabaco foi conseguida com PEI por si só, mas uma combinação de PEI e quitosano ou polifosfatos pode reduzir a concentração de PEI necessária. Além disso, a abordagem DoE nos permitiu identificar as combinações de polímeros mais eficazes quando omitindo PEI (com ou sem quitosana e polifosfatos), ajudando assim a definir as condições de floculação ideais em processos em que PEI é incompatível com a proteína alvo, por exemplo, devido à precipitação, como relatado para βglucuronidase 24,25. Além disso, o Departamento de Energia foi capaz de caracterizar um espaço de desenho complexo para o qual nenhum modelo mecanicista foi disponíveis (Figura 2D). Usando as ferramentas ANOVA do software DoE, foi possível distinguir entre modelos preditivos confiáveis e contrapartidas mal-avaliados (Figura 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O aspecto mais importante a considerar ao configurar um DoE para caracterizar a floculação de partículas é que o projeto deve, em princípio, ser capaz de detectar e descrever os efeitos esperados ou possíveis 36,38, por exemplo, a influência do pH, tipo de polímero e concentração de polímero 16. Portanto, é importante para avaliar a fracção do espaço de concepção (FDS) antes de iniciar as experiências reais. O FDS é a fracção do espaço experimental multidimensional (coberto pelos factores de projecto, por exemplo, de pH) dentro dos quais é possível detectar diferenças pré-definidas entre dois resultados experimentais dados um sistema de variabilidade conhecida, por exemplo, detecção de uma diferença na turbidez de 250 NTU dada uma variabilidade de 125 NTU. O FDS pode ser aumentada aumentando o projeto com tiragens adicionais e deve ser ≥0.95 para projetos destinados a orientar o controle do processo 36. Além disso, se o número de execuções não permite tele toda a experiência ser realizada num único dia, os blocos devem ser pré-definidos no DOE para dar conta de lote para lote e a variabilidade do dia-a-dia. Quando se trabalha com material de plantas, a inclusão de referência é executado em cada bloco (por exemplo, controlos não tratados) ajuda a compensar a variabilidade, permitindo a comparação dos dados a partir de várias corridas cada normalizados para a sua série de referência correspondente. Neste contexto, o aumento do número de pistas em replicado no DOE também é útil.
Quando um grande número de polímeros são peneirados, é aconselhável utilizar as propriedades individuais do floculantes, por exemplo, densidade de carga e massa molecular, como factores numéricos discretos em vez dos próprios polímeros, como fatores categóricas. Isso reduz o número de experimentos porque os projetos experimentais precisam muitas vezes de ser replicado para fatores categóricas, enquanto que níveis adicionais de factores numéricos só precisa de um pequeno número de execuções extra. O con informaçõestenda da experiência também aumenta e permite a identificação de propriedades de polímeros que melhoram a floculação, por exemplo, uma elevada densidade de carga que se encontra nas experiências aqui descritas. Projetos CCD e RSM experimental são úteis para estabelecer modelos com alto poder preditivo, permitindo a identificação de condições de processamento robustos (por exemplo, para orientar o controle do processo) e são normalmente utilizados para acompanhar projetos de triagem. Se o número de fatores e fatores de níveis menores de resultados da investigação em DoE com mais de 400 experiências individuais, pode ser aconselhável para reduzir o número de níveis de fator ou mudar para outros tipos de design porque o número de amostras que podem ser facilmente manipulados com a técnica aqui apresentado está limitado a ~ 100 por dia.
Do ponto de vista experimental, os polímeros devem permanecer estáveis sob as condições experimentais seleccionadas, por exemplo, que não deve despolimerizar a pH baixo. A preparação cuidadosa do floculanteações em termos de concentração também é necessário obter resultados reproduzíveis e modelos de alta qualidade. Neste contexto, o floculante pode necessitar de ser pré-tratados, por exemplo, tempos de ajuste de pH ou inchaço por quitina, para assegurar a solubilização completa e, assim, para se obter uma solução homogénea. Altamente existências viscosos devem ser evitados porque isso pode causar erros de pipetagem ao transferir o polímero para o extracto. Muitos polímeros podem ter um efeito tampão forte e os estoques têm valores de pH extremos, por exemplo pH ~ 9,5 para 8% [w / v] PEI. Isto pode afectar o pH do extracto, se as existências não são pré-ajustadas e irá distorcer os resultados experimentais. Por exemplo, se a floculação é mais eficaz a um pH elevado e um não-pH ajustado da PEI é utilizado, em seguida, uma EOD poderia sugerir que as concentrações elevadas de PEI são mais eficazes. No entanto, este efeito irá ser causado pelo maior pH causado pelo maior volume de estoque que foi adicionada, não pelo aumento da concentração de polímero PEr SE. As concentrações de ações utilizado deve também se assemelham aos usados em aplicações de grande escala para evitar diferentes efeitos de diluição entre as escalas que podem afetar a concentração de partículas e, assim, floculação. Alguns floculantes à base de argila, tais como caulino contêm um grande número de partículas em si finas, que podem mascarar o efeito de floculação, por exemplo, redução de turbidez após a filtração inicial, e outras respostas devem ser seleccionados para avaliar a eficácia destas substâncias, por exemplo, capacidade de filtro a jusante.
Para análise dos dados é importante para avaliar os resultados obtidos em termos de valores extremos, desalinhamentos e consistência geral, por exemplo, valores extremos pode indicar um erro de copiar e colar, uma mudança na casa decimal ou um mau funcionamento dos dispositivos analíticos equipamento /. Uma análise completa irá garantir que apenas dados de alta qualidade são usados para a construção de modelos. Durante a construção do modelo é importante para avaliar constantemente the amplo conjunto de indicadores de qualidade fornecidos pelo software DoE. Os critérios mais básicos são os R 2 R 2, ajustado e previu R 2 valores, mas os resíduos normais, resíduos-VS-run e real-vs-preditos parcelas (Figura 4) são ainda mais importantes porque fornecem informações sobre cada execução no uma experiência, em vez de um parâmetro de soma. Além disso, a coerência do modelo final e as suas previsões com os mecanismos conhecidos de floculação deve sempre ser investigada. Grandes discrepâncias entre previsões e expectativas científicas pode ocorrer porque os modelos DoE são apenas descritivos e não mecanicista, por exemplo, modelos podem prever valores extremos nas bordas de um espaço de design que reflecte o uso de algoritmos de ajuste polinomial.
Figura 4:. Os indicadores de qualidade de modelos DoE A nãoplot rmal dos resíduos studentized deve se parecer com uma linha reta, tanto quanto possível (A), com apenas pequenos desvios (setas verdes) aceitáveis para os modelos de alta qualidade. A aparência curvada (C) com desvios fortes (setas vermelhas) a partir da linha ideal (vermelho) indica um modelo pobre, por exemplo, devido à falta de fatores significativos. Em última análise, o previsto e os valores experimentais (reais) deve coincidir com (B) e novamente siga uma linha reta. Desvios da linha ideal (círculo vermelho e uma linha tracejada) indicam previsões do modelo pobres (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A abordagem DoE pode ajudar a caracterizar floculação em ações complexas de alimentação, tais como extratos vegetais, mesmo se não houver dados existentes. A floculação de extratos de tabaco foi otimizado com uma carga de trabalho de 2 nósEKS e consumíveis custos de ~ € 500. Isto reduziu o número de filtros de profundidade necessários para um único lote em escala piloto envolvendo ~ 800 L de extracto de planta em 60%, que alcançou uma redução correspondente dos custos de consumíveis.
Os floculantes também foram aplicados a diferentes extractos de plantas e de homogenatos de cultura de células. Embora o mesmo floculante foi eficaz para todos estes estoques de alimentação, a concentração do polímero teve de ser ajustada de forma a acomodar as diferentes concentrações de partículas dispersas. Além disso, uma vez que um polímero eficaz tiver sido identificada, pode necessitar de ser ajustado para igualar a distribuição de tamanho de partícula diferente 11, os passos de filtração e / ou centrifugação.
O método descrito aqui pode ser facilmente adaptada para outras ações de alimentação e por isso é também relevante para os cientistas e engenheiros de desenvolvimento de estratégias de esclarecimento para culturas de células de mamíferos e processos de produção de alimentos / rações. Especially processos à base de plantas se beneficiarão dos volumes de amostras intermediárias sugeridas aqui porque extratos vegetais pode conter partículas de até 1 mm de diâmetro, que são incompatíveis com os formatos de microplacas 21, por exemplo, porque a dinâmica de mistura diferir devido a um diâmetro de partícula à relação da embarcação diâmetro que não é representativo da escala de processo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
O autor não tem conflitos de interesse para divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
References
- Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
- Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
- Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
- De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
- Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
- Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
- Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
- Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
- Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
- Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
- Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
- Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
- Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
- Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).
