Summary
Cet article présente une méthode pratique et rapide pour la visualisation de différentes populations de cellules neuronales dans le système nerveux central d'embryons de xénope utilisant immunofluorescence sur des coupes.
Introduction
Chez les vertébrés, le développement du système nerveux central comprend plusieurs étapes distinctes consécutives encore. La première étape est l'induction neurale, lorsque les cellules ectodermiques naïves sont spécifiés vers un destin neuronal à un destin plutôt que épidermique. Plusieurs mécanismes de régulation interconnectés sont impliqués au cours de cette étape dans d' autres systèmes modèles 1,2 Xenopus et. Ce processus est principalement coordonné par des facteurs sécrétés produits par le mésoderme sous - jacent, comme chordin, caboche et follistatine 3-7. Après l'induction neurale, un sous-ensemble de cellules progénitrices neurales quitter le cycle cellulaire et commencent à se différencier en un processus appelé neurogenèse primaire. Pas tous les précurseurs neuronaux se différencient en ce moment. Les cellules précurseurs neurales restantes continuent à proliférer, maintenant ainsi le pool de cellules souches nécessaires à la croissance continue du système nerveux central au cours du développement et à l'âge adulte.
Ces proliferating cellules précurseurs neurales sont caractérisées par leur expression de la SRY (sex région déterminant Y) -box 3 (SOX3) gène 8-11. L'autre population de cellules, qui sortent du cycle cellulaire et engager à un destin différencié, sont identifiés par l'expression des marqueurs de gènes de différenciation, la tubuline, bêta 2B classe IIb (tubb2b, N-baignoire) et la myéline facteur de transcription 1 (Myt1) 12-14. De telles cellules neuronales différenciées donnent finalement naissance à différentes catégories de neurones , y compris, mais sans s'y limiter, le moteur, inter et les neurones sensoriels positionnés dans des zones distinctes à l' intérieur du tube neural 15-17.
Bien que des efforts importants ont été consacrés à la découverte des mécanismes réglementaires qui régissent la structuration et le destin de déterminer les événements dans la neurectoderme antérieure, moins d'attention a été faite sur enquête sur les événements qui se produisent neurogène après laétape initiale de mise en forme. En effet, la transduction du signal, les règlements de transcription, ainsi que des modifications post-traductionnelles sont tous impliqués dans cette étape plus tard, contrôlant à la fois la spécification de synchronisation et de la lignée pendant la neurogenèse 18-20. D'autres enquêtes sur ces mécanismes nécessitent une méthode fiable pour visualiser facilement et distinguer les différentes populations de cellules neuronales. La N-baignoire marqueurs neuronaux, y compris, SOX3, Myt1 mentionné ci-dessus, et, peut fournir un moyen pour identifier ces populations de cellules différentes, fournissant ainsi les bases nécessaires pour révéler les mécanismes sous - jacents de la différenciation neuronale 21-23.
Bien que l' étiquetage différentiel des populations de cellules neuronales ont été démontrées dans d' autres organismes modèles, relativement peu d' études ont exploité le système Xenopus à son maximum à cet égard. Ceci est principalement dû à un manque d'anticorps compatibles qui permettent d'identifier de manière fiable les différents neurpopulations cellulaires onnelle dans le tube neural. Ici, nous décrivons une méthode pour visualiser la différenciation neuronale dans les premiers embryons de xénope via immunocoloration, qui fournit une approche robuste et pratique pour étudier la neurogenèse primaire dans Xenopus. Ce protocole devrait donner des indications suffisantes pour les chercheurs intéressés par le développement précoce du système nerveux central Xenopus entre l' étape 26 et l' étape 45.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés à l'Université de Manchester Centre du bien-être des animaux et ont été couverts par une licence UK Home Office Project.
1. Collecte et fixation de Xenopus Embryons
- Préparer Réactifs et matériels pour les expériences.
- Préparer 10x Modified Ringers de Marc (MMR) en dissolvant 56,5 g de NaCl dans environ 800 ml d' eau ultra - pure et en ajoutant des solutions mères de KCl 1 M, 1 M MgSO4 1 M CaCl2 et 1 M de HEPES , pH 7,4 pour obtenir une concentration finale de 20 mM de KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl2, 50 mM de HEPES. Ajuster le pH à 7,4 par NaOH 10 M et ensuite ajuster le volume final à 1 L.
- Stériliser la solution 10x MMR par autoclavage à 121 ° C pendant 20 min sur un cycle liquide. Lors de l' utilisation, on dilue avec ddH 2 O à 0,1 x la concentration finale et ajoute 20 mg / l de gentamycine pour inhiber la croissance microbienne.
- Faire 10x solution TBS en mélangeant 24 g de Tris-HCl, 5,6 g de Tris-base, 88 g de NaCl et on dissout dans environ 900 ml d'eau ultrapure. La solution finale aura une valeur de pH d'environ 7,6. Ajuster avec soit 10 M de NaOH ou de HCl concentré pour obtenir un pH final de 7,6 et le volume final à 1 L.
- Lors de l'utilisation, assurez-TBS 1x en diluant 1 partie de 10x solution TBS avec 9 parties d'eau ultrapure.
- Faire 10x MEM sel en dissolvant 209,2 g MOPS dans environ 800 ml d' eau ultra - pure et en ajoutant des solutions mères de 0,5 M et 1 M , EGTA MgSO4 pour obtenir une concentration finale de 20 mM d' EGTA, 10 mM MgSO4. Ajuster le pH à 7,4 par NaOH 10 M et ensuite ajuster le volume final à 1 L.
- Stériliser la solution de sel MEM par autoclavage à 121 ° C pendant 20 min sur un cycle liquide (la solution peut jaunir par quelques mois de stockage à température ambiante ou après avoir été passé à l'autoclave, mais ce changement de couleur ne modifie pas son utilisation ). Cependant, ne pas utiliser la solution après un stockage prolongé (plus de 6 mois).
- Faire 1x MEMsolution FA en diluant 1 partie de MEM Sels, 1 partie de 37% de formaldéhyde avec 8 parties d'eau ultrapure (v / v, stable à 4 ° C pendant au moins 1-2 semaines).
- Préparer 4% de paraformaldehyde dans TBS (pour la coloration subséquente impliquant phalloïdine) en dissolvant 4 g de poudre de paraformaldehyde dans 100 ml de solution 1x TBS Chauffer la solution à 60 ° C et ajouter quelques gouttes de NaOH 10 M pour aider à dissoudre. Aliquoter dans 5-10 ml de volume et de gel de -20 ° C. Ne pas recongeler une fois décongelé.
ATTENTION: paraformaldéhyde en poudre est un irritant et est toxique en cas d'inhalation, ainsi l'étape de pesée doit être effectuée dans une hotte. - Etiqueter autant de flacons de verre de 4 ml avec bouchons à vis avant le prélèvement des échantillons.
- Préparer 15% de gélatine / 15% de saccharose en versant 20 ml de 40% de gélatine de poisson (pré-chauffage dans un bain d'eau à 50 ° C) dans un tube de centrifugation de 50 ml. Ajouter 8 g de saccharose et de remplir le tube à la ligne de 50 ml avec 1x TBS.
- Placer le tube de gélatine sur un mélangeur rotatif ou lit roulantpour mélanger une nuit à température ambiante. Cette solution de gélatine est stable à 4 ° C pendant 1 semaine. Ne pas utiliser la solution périmée et ne gel-dégel.
- Préparer et réparer X. laevis ou X. tropicalis Embryons Cultured aux stades souhaités.
- Culture du X. fécondé laevis ou X. tropicalis embryons dans 0,1x MMR avec gentamicine jusqu'à ce que les étapes souhaitées.
NOTE: En règle générale, la collecte d'embryons entre les stades 23 et 40. Plus tard collecte d'embryons après l'étape 40 est possible, en particulier lorsque l'on observe la croissance axonale à partir de la moelle épinière, mais gardez à l'esprit que plus le temps de pénétration de la gélatine peut être nécessaire. Les embryons peuvent être de type sauvage, transgénique, mutant, inhibiteur traité, morpholino (MO) -injected, ou électroporation 23,24. - Recueillir 20-50 embryons dans chaque flacon de 4 ml en verre, enlever le plus moyen que possible et le remplacer par MEMFA.
NOTE: Si une coloration ultérieure implique phalloïdine, utilisez paraformaldéhyde 4%au lieu de MEMFA puisque les solutions de formaldéhyde fourni du commerce contiennent habituellement jusqu'à 10% de methanol en tant que stabilisant qui va interférer avec la phalloïdine coloration. - Fixer une nuit à 4 ° C ou, si, dans une urgence, à la température ambiante pendant 2 heures sur un mélangeur rotatif. Les embryons seront stables en solution de fixation pendant au moins 1 semaine à 4 ° C.
- Après fixation, laver les embryons 3 fois pendant 20 minutes en utilisant 1x TBS avec 0,05% de Triton X-100. Après le lavage final, enlever autant TBS-Triton que possible et ajouter 3 ml de 15% de gélatine / 15% de saccharose dans chaque flacon.
- Placer les flacons sur un rouleau lit une nuit à température ambiante. Pour les embryons âgés de plus de 40 étapes, utiliser au moins 24 heures de temps de pénétration. Après la pénétration, procéder immédiatement à la section 2.2, le lendemain.
- Culture du X. fécondé laevis ou X. tropicalis embryons dans 0,1x MMR avec gentamicine jusqu'à ce que les étapes souhaitées.
2. Montage et Cryosectioning de Xenopus Embryons
- Préparer Réactifs et matériels pour les expériences.
- Prenez une boîte de charg positiveed glisse, idéalement ouvert.
NOTE: Si ouvert, conserver les lames dans un état sec (comme une boîte sèche) et utiliser moins de 1 mois pour assurer la charge statique sur les lames est maintenue. Ne pas utiliser des diapositives expirés depuis échantillons vont tomber pendant immunocoloration. - Pré-refroidir la chambre de cryostat à -30 ° C. Définissez les paramètres de l'appareil que -35 ° C pour microtome et 12 épaisseur de coupe um. Installez la plaque de verre de couverture épaisse sur la scène et de laisser le cryostat stabiliser au moins 30 minutes avant l'article commence.
- Préparer pinceaux pour déplacer la section des bandes, garder à l'intérieur de la chambre de cryostat.
- Préparer des crayons pour écrire sur des diapositives, mettez-les à température ambiante.
- Porter des gants lors de cryosection. Ne pas utiliser les mains nues.
- Prenez une boîte de charg positiveed glisse, idéalement ouvert.
- Montage Xenopus Embryons
- aspirer soigneusement 5-10 embryons sur le flacon en verre en utilisant une matière plastique ou d'une pipette en verre sans introduire de bulles d'air. Transférer les embryonsà la chambre de montage et d'observer sous un stéréoscope. Remplir la chambre de montage avec une solution de gélatine pour assurer la rigidité du bloc de coupe.
- Disposer les embryons selon la figure 1 en utilisant une paire de pinces à pointe fine. Marquer l'orientation de la tête en tirant une flèche sur le bord de la chambre en utilisant un marqueur cryogénique compatible. Pour plusieurs groupes d'embryons, notez la description de chaque groupe sur le rebord de la chambre correspondante ainsi.
- Placez délicatement la chambre horizontalement dans une boîte de mousse à demi rempli de glace sèche et fermer le couvercle. Observer le gel de la chambre de montage en 5-10 min. Traiter chaque chambre en série (ie placer la chambre précédente sur de la glace sèche avant de passer à la suivante) , car cela laissera suffisamment de temps pour chaque chambre pour geler et empêcher la boîte de glace sèche pour devenir surpeuplées.
REMARQUE: les chambres de montage congelés ne doivent pas se tenir horizontalement et peuvent être empilés à l'intérieur de la boîte. - Procéder à cryosectioning ou, si nécessaire, garder les échantillons congelés à -80 ° C pendant au moins 1-2 semaines sans perdre immunogénicité.
- Cryosection de Embryons Xenopus Mounted
- Supprimer un bloc d'échantillons congelés de la chambre en appuyant sur le fond de la chambre à l'aide d'un bâton pointu (comme un crayon).
- Ajouter quelques gouttes de milieu de congélation de tissu, un alcool ( un milieu contenant du polyéthylène glycol et de vinyle) sur le disque de retenue d'échantillon et de monter le bloc d'échantillon avec l'extrémité antérieure de l'embryon pointe vers le haut (figure 2). Laisser le bloc mounted- reposer dans la chambre de cryostat pendant environ 1 min ou jusqu'à ce que le milieu de tissu-gel devient opaque.
- installer immédiatement le disque de retenue d'échantillon sur le microtome avec la face inférieure du bloc à échantillons vers le haut. Coupez une partie du bloc d'échantillons à l'aide d'une lame lorsque le bloc d'échantillon est encore relativement «soft» pour réduire la longueur de chaque section(si on le désire). Laisser le disque de retenue d'échantillon sur le microtome pendant au moins 5 minutes pour permettre à sa température d'atteindre l'équilibre.
- Peu à peu, couper le bloc d'échantillons jusqu'à ce que les têtes de têtards sont visibles à travers la gélatine translucide. Pour augmenter la vitesse de coupe, appliquer un (plus épais) réglage plus élevé de l'épaisseur de coupe (par exemple 20-25 uM) à ce stade (telles que l' activation de l'option "trim") mais pas trop épais , car le bloc d'échantillon peut tomber à partir du disque de maintien de l' échantillon . Observer les performances du cryostat, telles que la netteté et de l'angle de la lame, à ce stade pour assurer la production d'une longue bande de sections qui suivent.
- Une fois que les têtes de têtards deviennent visibles, réglez les paramètres du cryostat retour à la normale (par exemple 10-12 uM) et nettoyez le microtome et le stade à l' aide d' un pinceau. faire doucement 2-3 sections comme un essai en utilisant le réglage de la roue à la main (ne pas utiliser le réglage motorisé) pour vous assurer que les tranches finies peuvent former strips, ne se chevauchent pas ou de coller à la lame.
- Continuer la coupe jusqu'à ce que les têtes de têtards sont presque exposés (ce qui peut avoir une certaine expérience, mais réalisable). Brossez les sections restantes sur la scène et la collecte des sections de l'échantillon commencera.
- Faire environ 10-15 sections et les laisser former une longue bande.
- Retournez sur la plaque de verre épaisse couverture sur le côté et retirez délicatement la bande de la lame à l'aide d'un pinceau fin de la pointe et l'organiser sur la scène avec axe long parallèle à la lame.
- Choisissez une diapositive chargée positivement à la température ambiante, l'étiquette avec un crayon (qui ne sera pas lavé au cours des traitements de coloration ultérieures), appuyez rapidement mais fermement sur la bande avec le côté de l'étiquette vers le bas et retirer la lame de la chambre de cryostat. Si cela est fait correctement, la bande doit immédiatement coller à la lame chargée positivement (figure 3A).
- Répétez cette étape pour avoir 20-30 tranches sur chaque glissée et disposés en parallèle (figure 3B). Cela est suffisant pour couvrir la région du cerveau entier de X. embryons tropicalis et la plupart des prosencéphale et mésencéphale régions de X. laevis embryons.
- Air-sécher les lames pendant 10 minutes, procéder immédiatement ou, stocker les lames dans une boîte de diapositives à -80 ° C pendant au moins 3-6 mois sans perdre immunogénicité.
3. Immunomarquage de Sectioned Xenopus Embryons
- Préparer Réactifs et matériels pour les expériences.
- Préparer 0,05% TBS-Triton X-100 en y ajoutant du Triton X-100 dans 1 x TBS pour obtenir une concentration finale de 0,05%. Cette solution est stable à température ambiante pendant 3-4 jours. Ne pas utiliser la solution expirée.
- Préparer 5% de sérum de chèvre inactivé à la chaleur ou à 5% de BSA dans TBST comme un tampon de blocage. En premier lieu, la chaleur inactiver le sérum de chèvre / agneau en plaçant environ 20 à 30 ml de sérum dans un bain d'eau à 65 ° C pendant 30 à 60 min. Aliquoter dans 1,5 ml centrifugeusetubes et gel à -20 ° C. Pas de re-inactivation est requis lors de l'utilisation.
- On dilue le sérum inactivé à la chaleur ou de BSA dans TBST pour obtenir une concentration finale de 5% avant l'utilisation.
- Préparer des anticorps primaires appropriées en fonction des dilutions dans un tampon de blocage (par exemple , 1: 250 tubuline anti Myt1 26 / anti-acétylée: 500 anti SOX3 10,25 / 1). Utilisez environ 100 pi de solution d'anticorps sur chaque diapositive.
- Préparer des anticorps fluorescents appropriés (/ lapin fluorescent rouge anticorps colorant conjugué par exemple anti-souris) dans un tampon bloquant (habituellement de 1: 500).
- (Optionnel) Ajouter rouge fluorescent colorant conjugué phalloïdine (1: 500) dans mélange d'anticorps secondaire pour révéler le réseau d'actine.
- (Optionnel) Ajouter DAPI (0,5 pg / ml concentration finale) dans mélange d'anticorps secondaire de visualiser la localisation nucléaire.
- Prenez le milieu de montage anti-fade du congélateur et décongeler dans un bain d'eau à température ambiante.
- immunocoloration
- Retirez les diapositives congelés de -80 ° C et les placer sur un morceau de papier de serviette dans une hotte de ventilation pendant au moins 1 heure pour éliminer les gouttelettes d'eau condensée, puis cuire les lames séchées sur un bloc C de chaleur 85-90 ° avec le tranches tournées vers le haut pendant 15 minutes pour activer le mécanisme d'adhérence. Enfin, les lames permettent de refroidir à la température ambiante (au moins 10 minutes).
- Remplissez le pot de coloration avec de l'acétone pure et incuber les lames dans de l'acétone pendant 10 min pour éliminer la gélatine de poisson. Si plusieurs diapositives doivent être traités, les disposer sur un support de coloration. Air-sécher les-lames traitées pendant 15 min dans une hotte de ventilation. Ne pas réutiliser l'acétone.
- dessiner soigneusement un anneau autour des échantillons sur la diapositive à l'aide d'un stylo PAP sans toucher les échantillons. Assurez-vous que l'anneau est auto-clos, sinon solution anticorps coulera pendant la coloration. sécher complètement la bague de stylo PAP.
- Remplir un autre pot de coloration avec 1x TBS sans Triton X-100. Insert les glissements secs dans le pot de coloration et de permettre la réhydratation pendant au moins 1 h. Pendant ce temps, préparer le tampon de blocage, soit par dilution de sérum de chèvre inactivé à la chaleur ou de la BSA à 5% de concentration finale en utilisant 1 x TBS avec 0,05% de Triton X-100.
- Faire une boîte humide en plaçant 1-2 plaques de 6 puits dans une boîte alimentaire clic-lock et remplir les puits à mi-chemin avec de l'eau ultrapure. Retirer les lames réhydratés de la cuvette et la placer horizontalement sur les plaques de 6 puits (sans le couvercle de la plaque).
- Ajouter avec précaution 300-600 pi de tampon de blocage à l'intérieur de l'anneau de PAP. Scellez la boîte humide par verrouillage du couvercle en position et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
- Diluer les anticorps primaires appropriés dans un tampon de blocage. En règle générale, utiliser 100-150 ul solution diluée d'anticorps par diapositive. Si plusieurs diapositives sont traitées, intensifier le volume proportionnellement.
- Après le blocage, retirez délicatement le tampon de blocage à partir de diapositives par aspiration et ajouter rapidement psolution rimaire d'anticorps pour prévenir sèche-out, puis sceller la boîte humide et incuber à 4 ° C pendant la nuit.
- Le lendemain, on élimine la solution d'anticorps primaire à partir des diapositives par aspiration. Laver les lames en insérant dans des pots remplis de coloration 1x TBS avec 0,05% de Triton X-100, 3 fois, 15 minutes à chaque fois. Pendant ce temps, on dilue les anticorps secondaires fluorescents appropriés avec du tampon de blocage (avec ou sans DAPI ou phalloïdine).
- ajouter soigneusement 100-150 ul d'une solution d'anticorps secondaire sur les lames. Placer les lames dans la boîte humide et sceller le couvercle. Incuber les lames pendant 1 à 2 heures à la température ambiante.
- Laver les lames dans des bocaux de coloration remplis 1x TBS avec 0,05% de Triton X-100, 3 fois, 15 minutes chacun. Au dernier lavage, dégeler le milieu de montage anti-fade dans un bain d'eau à 50 ° pendant 10 minutes si elle est conservée à -20 ° C. Refroidir le milieu de montage à la température ambiante avant utilisation.
- Ajouter environ 20 pi (une goutte) de milieu de montage surla diapositive et appliquer une grande lamelle (au moins 22 mm x 64 mm) sur les échantillons. Observer en utilisant fluorescent ou microscope confocal au sein de montage post 6 h.
- Si l'imagerie ne peut se faire le même jour, sceller des diapositives en utilisant le vernis à ongles et les placer dans la boîte humide à 4 ° C pendant la nuit.
NOTE: Le milieu de montage anti-fade va progressivement s'oxydée après quelques jours (et tourner brunâtre) il est donc recommandé de prendre les images le plus rapidement possible.
- Si l'imagerie ne peut se faire le même jour, sceller des diapositives en utilisant le vernis à ongles et les placer dans la boîte humide à 4 ° C pendant la nuit.
Representative Results
Les résultats représentatifs montrent des sections transversales de l' étape 30 embryons de Xenopus , à différents niveaux, à savoir le cerveau antérieur, le mésencéphale, du cerveau postérieur et de la moelle épinière, coloré avec des anticorps différents (figure 4). Comme mentionné précédemment, SOX3 neuronale marquée par la population de cellules progénitrices localise à proximité de la lumière du tube neural, tandis que Myt1-étiquetés neurones primaires différenciés migrent vers l'extérieur et de localiser à proximité de la couche marginale (membrane basale) du tube neural. Anti-acétyl-tubuline étiquettes axones dans les neurones différenciés, qui peuvent être observées dans l'ensemble du tube neural.
spécifiques à côté de knock-down de gènes ou la surexpression est une méthode largement utilisée en neurobiologie pour déterminer si la modulation de l'expression du gène spécifique (s) perturbe la croissance et la différenciation des cellules neuronales. Dans de tels cas, soit Morpholinos (OM) ou la construction d'ADN (s) portant pro gène (s) entraîné moter-sont injectés dans l' un des deux blastomères au stade de deux cellules 23. En variante, elles peuvent être injectées dans le ventricule cérébral suivie d' une électroporation, ce qui se traduira par effet de choc ou de surexpression de gène souhaité (s) 27. Dans les deux cas, les effets sont limités à un côté de l'embryon, ce qui rend le côté opposé de l'embryon comme témoin interne non traitée.
Après fixation, sectionner et immunocoloration, les impacts du knockdown du gène / surexpression sont quantifiées en comptant et en comparant le nombre de cellules de différentes populations des deux côtés de l'embryon. En accumulant les données provenant de plusieurs embryons, l'analyse statistique peut être effectuée. Dans nos résultats représentatifs, aucune perturbation n'a été effectué dans les embryons. Des exemples de perturbation génique et leurs effets sur les différentes populations de cellules neuronales peuvent être trouvés dans les références 20,23.
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Figure 1:. Arrangement de Embryo et de l' orientation dans la section moule (A) Une représentation de bande dessinée montrant l'ensemble de montage, notez le plateau a été marqué avec la date, le stade et l'orientation des embryons. (B) Une image montrant l'aspect naturel de l'ensemble de montage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. L'orientation et la position du bloc de gélatine sur le disque échantillon de maintien (A) Une représentation de bande dessinée montrant l'ensemble section de bloc, notez que les embryons sont dans une position "heads up" et le bloc de gélatine est solidement fixé onto l'échantillon de maintien de disque par le milieu de tissu-gel à la base (voir la figure 2B). (B) Une image montrant l'aspect naturel de l'ensemble de bloc de section, noter l'accumulation du milieu tissulaire de congélation entre le bloc de gélatine et le disque échantillon de maintien. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Tronçonnage continue (A) Modèle d'une chambre de section. Le disque de maintien de l'échantillon doit être tourné et fixé à la position du côté de l'embryon vers le haut. Après quelques (6-10) sections, la longue bande de carreaux de section en continu sont doucement séparé de la lame (bleu) à l'aide d'un pinceau fin, puis tourné de 90 ° sur la plaque de maintien. Ensuite, une chambre-temp chargée positivement diapositivefermement pressé sur la bande de section vers le bas et immédiatement levé à des bandes finies collectées. (B) En règle générale, chaque glissière peut accueillir 2 lignes parallèles de bandes, comme illustré. Rappelez - vous de faire rapport détaillé sur l'étiquette de diapositive à l' aide de crayon. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Coupe transversale de l' étape 30 X. laevis têtards et coloration dans le tissu neural, 20X. (A) Schematics indiquant les positions relatives (prosencéphale, mésencéphale, hindbrain, et de la moelle épinière) des plans de coupe sur têtards Xenopus. (B) cross-sections correspondantes colorées avec anti-SOX3 (Rouge), anti-acétyle-tubuline (Green) et DAPI (bleu), montrant les positions relatives des pools de cellules souches nerveuses, ainsi que les neurofilaments au sein du tube neural. (C) correspondant des coupes colorées avec des anticorps anti-Myt1 (rouge) et DAPI (bleu), montrant les positions relatives des neurones primaires différenciées au sein du tube neural. Barre d'échelle = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Ici , nous démontrons une méthode pratique et efficace pour la visualisation de la neurogenèse primaire dans des embryons de xénope. Cette méthode permet l'évaluation de différents types de cellules neurales, y compris des cellules souches neuronales et les neurones primaires différenciées en utilisant des marqueurs spécifiques d'un type cellulaire.
Le protocole est généralement robuste avec un très haut niveau de reproductibilité. Pour les embryons qui sont à des stades pré-incubation (soit jusqu'à mettre en scène 28), nous vous recommandons de retirer manuellement la membrane vitelline avant la fixation car cela permet embryons à défriser complètement avant fixation. Ceci est particulièrement important lors de la collecte des embryons à un stade relativement précoce (avant l'éclosion), étant donné que les embryons courbées sont extrêmement difficiles à organiser à l'orientation désirée à l'intérieur de la chambre de montage. On n'a pas connu une perte d'immunogénicité après MEMFA ou PFA fixation donc étape supplémentaire de récupération de l'antigène est pas nécessaire pour ce protocole. En outre, cetteProcédure d'immunocoloration peut être réalisée dans des échantillons provenant chromogénique / hybridation fluorescente in situ. Dans un tel scénario, il est recommandé de sauter l'étape K de traitement de protéase au cours du protocole d'hybridation in situ. Après la réaction chromogénique / fluorescence, les échantillons peuvent être lavés avec du TBS et noyées dans une solution de gélatine de poisson d'une manière similaire à MEMFA / PFA échantillons fixes. Les flacons d'échantillon peuvent être protégés de la lumière en enveloppant les flacons dans une feuille d'aluminium si hybridation fluorescente in situ sera imagée avec immunofluorescence plus tard.
Dans certains cas, les embryons peuvent rétrécir excessivement après la pénétration de la gélatine. Ceci est très probablement causée soit par une fixation insuffisante ou insuffisante extraction TBS-Triton. Veiller à ce que les embryons ont été corrigés dans PFA / MEMFA pendant au moins 2-3 heures ou de préférence pendant une nuit à 4 ° C. Si le problème persiste, augmenter le temps de lavage TBS-Triton à 3 pendant 1 heure.
Au cours de la cryo-sectioning, la rigidité du bloc d'échantillon peut varier selon les différents lots de gélatine de poisson ont des propriétés différentes. Ce problème peut être partiellement compensée par le réglage de la température du microtome. Une température plus basse se traduira par une "plus difficile" bloc d'échantillons mais à basse température excessive du bloc d'échantillon devient croustillant et difficile à section. Certains réglage fin ou de la pratique (à l'aide des blocs d'échantillons simulés sans embryons) avant chaque tronçonnage peut être bénéfique avant utilisation sur des échantillons particulièrement précieux.
Un problème fréquemment rencontré lors de tronçonnage est les sections minces ont parfois tendance à coller sur la plaque de verre épaisse plutôt que de rester à plat sur la scène de l'acier. Cela peut être particulièrement perturbant, car il interrompt constamment le processus de sectionnement continu. De tels cas sont généralement causés par l'une des deux raisons: la chambre de section et (surtout) la plaque de verre épais pour ne pas être une charge statique assez froid, ou excessive sur la machine et l'opérateur, surtout par temps sec. Le premier peut être résolu en baissant la température de la chambre de section et en laissant la plaque de verre à l'intérieur du temps supplémentaire (éventuellement la nuit); et le second par terre correctement le cryostat. Raccordement de la surface métallique du cryostat à un robinet en métal ou similaire système de tuyauterie d'eau en métal peut être une autre façon de libérer les charges statiques. Après chaque utilisation, la plaque de verre épaisse doit être bien lavé avec un détergent non corrosif (par exemple en tant que liquide de lavage de vaisselle), on le rince par de l'eau ultra-pure, pulvérisé avec de l'éthanol pur, et enveloppé dans du papier de serviette pour protéger la surface et les bords d'endommager.
Les anticorps énumérés dans le protocole sont généralement spécifiques et nous rencontrons rarement l'adsorption non spécifique ou d'un signal de fond élevé. Il convient de noter que, en cas d'utilisation de sérum de chèvre / agneau inactivé à la chaleur comme agent de blocage, la chaleur excessive-inactivation (comme visualisé par la formation de précipitants pelucheux dans le sérum) devraitéviter que cette précipitation est très attrayant pour les anticorps secondaires et peut contribuer à une source de bruit de fond élevé.
Il est possible, et parfois souhaitable, pour effectuer double coloration pour visualiser les différentes populations de cellules neuronales simultanément. Cette double coloration est possible et donne des résultats satisfaisants avec les combinaisons suivantes: généralement SOX3 / N-baignoire ou Myt1 / N-baignoire. Cependant, la double coloration des SOX3 et Myt1 est compliquée par le fait que les deux anticorps sont tous deux d'origine du lapin. Nous avons testé plusieurs kits de marquage direct d'anticorps, mais pas des résultats satisfaisants ont été observés (faible niveau de signal-bruit), probablement en raison de l'absence d'amplification du signal à partir d'anticorps secondaires. Une approche possible de contourner ce problème serait d'augmenter lignées transgéniques dans Xenopus, comme discuté ci - dessous.
L'une des principales restrictions de ce protocole est que, alors que ce protocole pourrait suffisamment distinguish deux principaux pools de cellules neuronales, à savoir, la neuronal pool de cellules souches SOX3 exprimant et les neurones différenciés Myt1 exprimant, il n'a pas la capacité de révéler les différentes sous-populations de neurones différenciés. Ces sous-populations, y compris, mais sans s'y limiter, les neurones moteurs primaires, les interneurones et les neurones sensoriels, sont généralement caractérisés par leurs gènes marqueurs différentiellement exprimés 28-30. Comme mentionné ci - dessus, les progrès récents dans le développement de multicolor hybridation in situ combinée avec la méthode de détection d'immunofluorescence à base d' anticorps dans des embryons de Xenopus en peuvent combler le vide pour révéler ces sous-populations de neurones différenciés pour enquête potentielle 31. En variante, comme cela a été démontré dans le modèle de souris, il serait également souhaitable de soulever un ensemble plus complet d'anticorps spécifiques de type cellulaire pour distinguer ces différentes populations cellulaires chez Xenopus.
C'estégalement à noter que, comme un ajout à cette méthode, les progrès récents dans l' imagerie optique et l' analyse d'image, telles que la microscopie multiphotonique, reconstruction 3D, et la segmentation, peuvent également être appliquées après des évaluations initiales pour parvenir à des observations plus complètes des ovocytes de Xenopus ainsi que embryons précoces, en particulier dans le cadre d' une mise en 32,33 en direct. Par conséquent, pour suivre la prolifération, la différenciation, et le mouvement des cellules neuronales dans les animaux vivants, il serait souhaitable d'établir une ou plusieurs lignées transgéniques qui abritent des protéines fluorescentes entraînées par cellule promoteur spécifique de type pour permettre l' observation en direct de ces populations de cellules au début de Xenopus embryons. La mise en place d'un X. ligne laevis avec spécifiques neuro β-tubuline promoteur conduite tauGFP et ses applications ont fourni un bel exemple 23,34. Avec les séquences de promoteur complète des deux SOX3 et Myt1 caractérisé en vertébrés 35-37, il est should être relativement facile d'établir des lignées transgéniques supplémentaires dans Xenopus qui devraient contribuer largement à la fois la communauté Xenopus et un domaine plus général de la recherche de la neurogenèse primaire.
Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions le Professeur Michael Klymkowsky à l'Université du Colorado à Boulder et le professeur Nancy Papalopulu à l'Université de Manchester pour fournir gracieusement des anticorps anti-SOX3 et anti-Myt1, respectivement. Nous remercions les membres du laboratoire Papalopulu pour leurs suggestions pertinentes dans l'élaboration de ce protocole. Ce travail a été soutenu par deux Fondation pour la guérison de stagiaire à SZ et JL, deux subventions de projet de la Fondation pour la guérison à SZ / EA et JL / EA respectivement, subvention du Wellcome Trust à EA (WT082450MA) un programme, et une subvention d'appui stratégique institutionnel du Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
| Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
| Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
| Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Gloves | |||
| Dry Ice | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 85-90 °C Heat block | |||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Acetone, analytical grade | |||
| Staining jar with slide racks | |||
| Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
| anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
| Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
| Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |
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