Het doel van dit protocol is om gebruikers een reeks methoden te bieden voor de hoogwaardige decapsulatie van Lymnaea stagnalis embryo's en larven ter voorbereiding op gehele berging in situ hybridisatie, en voor daaropvolgende pre- en post-hybridisatie behandelingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ganse berg in situ hybridisatie (WMISH) is een techniek die het mogelijk maakt voor de ruimtelijke resolutie van nucleïnezuurmoleculen (vaak mRNA) binnen een 'hele mount' het prepareren van weefsels of ontwikkelingsstadium (zoals een embryo of larve) van belang. WMISH is zeer krachtig omdat het aanzienlijk kunnen bijdragen tot de functionele karakterisatie van complexe metazoïsche genomen, een uitdaging die steeds meer een knelpunt wildgroei aan volgende generatie sequentiegegevens. Ondanks de conceptuele eenvoud van de techniek veel tijd vaak nodig om de verschillende parameters die inherent zijn aan WMISH experimenten nieuwe model te optimaliseren; subtiele verschillen in de cellulaire en biochemische eigenschappen tussen soorten weefsels en ontwikkelingsstadia dat één WMISH methode niet voor alle situaties. We hebben een set van WMISH methoden voor het opnieuw opkomende gastropod model poelslak die consistent genereren en ontwikkeldduidelijke WMISH signalen voor een reeks van genen, en in alle ontwikkelingsstadia. Deze werkwijzen zijn het inbrengen van larven van onbekende chronologische leeftijd een ontogenetische venster, het effectief verwijderen van embryo's en larven uit hun ei capsules, de toepassing van een geschikte proteïnase-K behandeling voor elk ontogenetische raam en hybridisatie, post-hybridisatie en immunodetectie stappen. Deze werkwijzen verschaffen een basis van waaruit het resulterende signaal voor een bepaald RNA-transcript verder verfijnd met probe specifieke aanpassingen (voornamelijk probe concentratie en hybridisatietemperatuur zijn).
Inleiding
Weekdieren zijn een groep van dieren die het belang van een brede diversiteit aan wetenschappelijke disciplines te houden. Ondanks hun morfologische diversiteit 1, soortenrijkdom (tweede alleen voor de geleedpotigen in termen van soorten nummer 2) en relevantie voor een breed scala aan commerciële 3, 4 medische en wetenschappelijke kwesties 5-8, zijn er relatief weinig weekdieren soorten die aanspraak kunnen maken op zowel goed uitgerust wetenschappelijke modellen en onderhoudsvriendelijk in een laboratoriumomgeving. Een weekdier dat veel wordt gebruikt door disciplines zoals de neurobiologie 9, ecotox....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: De volgende stappen schets onze methode voor het uitvoeren van een in situ experiment op de embryonale en larvale stadia van L. stagnalis. Wanneer een stap omvat het gebruik van een gevaarlijk chemisch dit wordt aangegeven door het woord 'LET OP' en de nodige veiligheidsprocedures moeten worden aangenomen. Links naar representatieve MSDS sheets voor gevaarlijke chemische stoffen zijn opgenomen in aanvullend bestand 1. Recepten voor alle reagentia zijn aanwezig bij het tweede Aanvullend File 2.
1. Vergadering van decapsulation Apparatus
- Hiertoe sluit een 20 ml....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De representatieve WMISH kleurpatronen figuur 3 werden gegenereerd met behulp van de hierboven beschreven techniek, en geven verschillende ruimtelijke expressiepatronen van genen betrokken bij diverse moleculaire processen gaande van shell formatie (nieuw gen 1, 2, 3 en 4), tot cel-cell signaling (Dpp) om transcriptie regulatie (Brachyury) in een heel scala van ontwikkelingsstadia. Hoewel we niet de expressieniveaus van deze genen verw.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven methode maakt de efficiënte visualisatie van RNA transcripten met vermoedelijk variërende expressieniveaus in alle ontwikkelingsstadia van poelslak. Embryo's en larven van de capsules te verwijderen we uitgetest diverse chemicaliën, osmotische shock en fysische behandelingen gerapporteerd voor andere encapsulated- het ontwikkelen van model organismen. In onze handen de hier beschreven werkwijze is het enige high-throughput techniek die de taaie capsulaire membraan verwijderd zonder bescha.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de financiering aan DJJ door de DFG-project # JA2108 / 2-1.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | VOORZICHTIG - Kankerverwekkend zijn. Giftig bij inademing, bij contact met de huid en als het wordt ingeslikt. Giftig: gevaar voor zeer ernstige onomkeerbare effecten door inademing, bij contact met de huid en als het wordt ingeslikt. |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur | Carl Roth | CN06.3 | VOORZICHTIG - KAN OOGIRRITATIE VEROORZAKEN. KAN IRRITATIES VAN DE ADEMHALING EN DE HUID VEROORZAKEN. Vermijd het inademen van stof. Vermijd contact met ogen, huid en kleding. Alleen gebruiken met voldoende ventilatie |
| Magnesiumchloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | VOORZICHTIG - Kan schadelijk zijn bij inademing. Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij opname door de huid. Kan huidirritatiem veroorzaken. Kan oogirritatiem veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij inslikken. |
| Natriumchloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidon K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | VOORZICHTIG - Kan schadelijk zijn bij inademing. Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij opname door de huid. Kan huidirritatiem veroorzaken. Kan oogirritatiem veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij inslikken. |
| Nuclease-vrij bovien serumalbumine | Carl Roth | 8895.1 | |
| Zalmbrem | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparine | Carl Roth | 7692.1 | VOORZICHTIG - BIJWERKINGEN OMVATT BLOEDINGS, LOKALE IRRITATIE. MOGELIJK ALLERGISCHE REACTIE ALS GEÏNHAAL, GEÏNST/CONTACT. IRRITAANT VOOR OEGEN/HUID/ADEMHAALWEG. MOGELIJKE OVERGEVOELIGHED. TIJDENS ZWANGERSCHAP IS GERAPPORTEERD DAT HET HET RISICO VAN STILBORT VERHOOGT |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| De-ioniseerd formamide | Carl Roth | P040.1 | VOORZICHTIG - Irriterend voor ogen en huid. Kan schadelijk zijn bij inademing, bij contact met de huid en als het wordt ingeslikt. Kan schadelijk zijn voor de ongeboren baby. Hygroscopisch. |
| Standaard formamide | Carl Roth | 6749.3 | VOORZICHTIG - Irriterend voor ogen en huid. Kan schadelijk zijn bij inademing, bij contact met de huid en als het wordt ingeslikt. Kan schadelijk zijn voor de ongeboren baby. Hygroscopisch. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | VOORZICHTIG - Vermijd het inademen van dampen of mist. Vermijd contact met de ogen. Vermijd langdurig of herhaald contact met de huid. Was grondig na gebruik. |
| Acetaanzuuranhydride | Carl Roth | 4483.1 | VOORZICHTIG - KAN ERNSTIGE HUID- EN OOGVERBRANDINGEN VEROORZAKEN. REAGEERT GEWELDIG MET WATER. SCHADELIJKE ALS GEÏNST. DAMP IRRITATIE VOOR DE OGEN EN DE ADEMHAALWEG |
| Maleïnezuur | Carl Roth | K304.2 | VOORZICHTIG - Zeer gevaarlijk bij contact met de ogen (irriterend), bij inname, . Gevaarlijk bij contact met de huid (irriterend), bij inademing (longirritant). Licht gevaarlijk bij contact met de huid (permeator). Corrosief voor ogen en huid. |
| Benzylbenzoaat | Sigma | B6630-250ML | VOORZICHTIG - Kan schadelijk zijn bij inademing. Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij opname door de huid. Kan huidirritatiem veroorzaken. Kan oogirritatiem veroorzaken. Schadelijk als ingeslikt. |
| Benzylalcohol | Sigma | 10,800-6 | VOORZICHTIG - Schadelijk als ingeslikt. Schadelijk bij inademing. Veroorzaakt ernstige oogirritatiem. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragmenten AP-geconjugeerd | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blauw tetrazoliumboorchloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | VOORZICHTIG - Kan schadelijk zijn voor de ongeboren baby. Schadelijk bij inademing en bij contact met de huid. Irriterend voor de ogen. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-fosfaat | Carl Roth | A155.3 | VOORZICHTIG - Potentieel schadelijk bij inname. Niet op huid, in ogen of op kleding komen. Mogelijke huid- en oogirritant. |
| N-acetylcysteïne | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | VOORZICHTIG - Kan oog- en huidirritatiem veroorzaken. Kan irritatie van de luchtwegen en het spijsverteringskanaal veroorzaken. De toxicologische eigenschappen van dit materiaal zijn niet volledig onderzocht. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | VOORZICHTIG - Kan schadelijk zijn bij inademing. Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij opname door de huid. Kan huidirritatiem veroorzaken. Kan oogirritatiem veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij inslikken. |
| Natriumdodecylsulfaat | Carl Roth | CN30.3 | VOORZICHTIG - Schadelijk als ingeslikt. Giftig bij contact met de huid. Veroorzaakt huidirritatie. Veroorzaakt ernstige oogbeschadiging. Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. |
| Kaliumchloride | Carl Roth | 6781.1 | |
Referenties
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
- Food and Agriculture Organisation of the Uni....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
