This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
الخلايا البطانية خط الجدار الداخلي للأوعية الدموية، وتلعب دورا هاما في تنظيم لهجة الأوعية الدموية، ونفاذية الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة. تورط خلل الخلايا البطانية في تطور وتقدم العديد من أمراض القلب والشرايين بما في ذلك مرض نقص تروية القلب. لدراسة وظيفة وتوصيف الخلايا البطانية التاجية، والعزلة الخلية هي الخطوة الأولى ويتطلب عالية النقاء وكمية لإجراء تجارب لاحقة. يصف هذا البروتوكول وسيلة فعالة لعزل الماوس الكبار الخلايا البطانية التاجية. يتم تشريح قلب فأر والمفروم إلى قطع صغيرة. بعد هضم القلب باستخدام dispase وكولاجيناز الثاني، يتم غسلها الخلايا وحضنت مع حبات مغناطيسية والتي مترافق مع الأجسام المضادة لمكافحة CD31. حبات مع الخلايا البطانية يتم غسلها عدة مرات ونحن على استعداد لاستخدامها في مختلف التطبيقات، بما في ذلك التصوير وexperime البيولوجي الجزيئياليلة. العزلة الفعالة ينتج ما يقرب من 10 4 خلايا في قلب واحد مع أكثر من 90٪ النقاء.
نماذج الماوس من مختلف الأمراض القلبية الوعائية واضطرابات التمثيل الغذائي تحمل التغيرات الفسيولوجية والجزيئية التي هي مماثلة لتلك التي وجدت في المرضى. وعلاوة على ذلك، والتعديلات الجينية من الفئران هو أداة قوية تسمح لنا للتحقيق في دور الممرضة من جينات معينة في تطور وتقدم في جميع الأمراض. في الوقت الحاضر، خلية من نوع معين الجينات تدق في أو تتولد الفئران-خارجا بسهولة في العديد من المختبرات وقياس مرنا ومستويات البروتين في أنواع معينة من الخلايا هي الخطوة الأولى في تحديد ما إذا كانت الفئران كانت حقا المعدلة وراثيا.
البطانة هي طبقة واحدة رقيقة من الخلايا البطانية (ECS) أن خطوط جدار الأوعية الدموية الداخلية. الخلايا البطانية تلعب دورا حاسما في تنظيم توتر الأوعية الدموية، ونفاذية الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة 1،2. الخلايا البطانية هو السمة المميزة للعديد من الحالات المرضية والتغيرات في وظيفة بطانة الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى السيارة المختلفةالأمراض diovascular 3،4. ومن ثم كبيرا لدراسة وظيفة الخلايا البطانية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض.
هناك عدة طرق لعزل ECS 5-8 وأسلوب العزل يجب أن يكون الأمثل اعتمادا على الأنسجة والأنواع سوف تستخدم. وذلك لأن ECS من الأنسجة المختلفة عرض على مستوى عال من عدم التجانس فيما يتعلق علامات سطحها والتعبير البروتين 9. العزلة الناجحة من الخلايا البطانية وغالبا ما تكون صعبة وتتطلب قدرا من التدريب والممارسة. وبمجرد تحقيقه، وطريقة العزل المقترحة في هذا البروتوكول يبرهن على أن تكون مستقرة وفعالة.
ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو الحصول على الماوس التاجي ECS (MCECs) ذات جودة عالية وكمية. على الرغم من أن كمية الخلايا التي تم جمعها من قلب أقل من الخلايا التي تم جمعها من الأنسجة الأخرى باستخدام تقنيات أخرى، فإن هذا الأسلوب لا يزال يوفر الرهانجودة ثالثا. نقاء من الخلايا البطانية في عدد السكان الناتج أكبر من 90٪. وبالتالي، فإن هذه التقنية سيكون مثاليا للتطبيقات التي تعتمد على الخلايا البطانية معزولة بحتة مثل التصوير الخلية.
الخلايا البطانية الأكثر استخداما على نطاق واسع في مجال البحوث والوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) بسبب الراحة وسهولة زراعة. ومع ذلك، هناك الكثير من الأبحاث يتطلب توافر نموذج الفسيولوجية التي حققتها عزل الخلايا البطانية من أجهزة محددة أخرى 10. الخلايا ?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل منحة من المعاهد الوطنية للصحة (HL115578 لألف ماكينو).
BSA | Sigma | A3311-10G | |
EDTA | Fisher | BP120-500 | |
HBSS | Fisher | SH3026801 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
M199 | Fisher | MT10060-CV | |
Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
EGS | BD | 356006 | Corning |
Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |