Abstract
내피 세포는 혈관의 내벽 라인 혈관 톤, 혈관 투과성, 새로운 혈관 형성의 조절에 중요한 역할을한다. 내피 세포 기능 장애, 허혈성 심장 질환을 포함한 다양한 심혈 관계 질환의 발생 및 진행에 관여한다. 함수 관상 내피 세포의 특성을 조사하기 위해, 세포 격리 첫 단계이며 이후의 실험을 높은 순도 및 품질을 필요로한다. 이 프로토콜은 성인 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 마우스 심장 해부 및 작은 조각으로 다진된다. 디스 파제 II와 콜라게나 제를 사용하여 심장의 소화 후, 세포를 세척하고, 항 CD31 항체가 결합되는 자성 비드와 인큐베이션. 내피 세포와 구슬은 세척 몇 번이고 이미징 및 분자 생물학적 experime 등 다양한 애플리케이션에서 사용할 준비가국세청. 효율적인 분리는 90 % 이상의 순도 하나의 심장 당 약 104 세포를 얻을 수 있습니다.
Introduction
다양한 심장 혈관 질병 및 대사성 질환의 마우스 모델은 환자에서 발견되는 것과 유사한 생체 분자 변화를 견딜. 또한, 마우스의 유전 적 변화는 우리 질환의 발생 및 진행에 특정 유전자의 병원성 역할을 조사 할 수있는 강력한 도구이다. 현재, 세포 유형 특이 적 유전자의 노크 또는 -out 생쥐 쉽게 마우스 진정 유전자 변형되었는지 여부를 결정하는 첫 번째 단계는 특정 유형의 세포에서 많은 실험실 mRNA를 측정 및 단백질 수준에서 발생한다.
내피 세포는 혈관 내피 세포되는 EC () 라인 안쪽 혈관 벽의 얇은 단일 층이다. 내피 세포는 혈관 장력, 혈관 투과성, 새로운 혈관 형성 1,2- 조절에 중요한 역할을한다. 내피 기능 장애는 많은 병리학 적 조건과 내피 세포 기능의 변화의 특징은 다양한 자동차로 이어질 수있다diovascular 질병 3,4. 이 병태 생리 학적 조건하에 내피 세포의 기능을 연구하는 것이 중요하다.
가 EC에 5-8을 분리하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 상기 분리 방법은 조직과 종 사용될에 따라 최적화되어야한다. 다양한 조직으로부터의 EC가 표면 마커에 대한 단백질 발현 9 이질성의 높은 수준을 표시하기 때문이다. 내피 세포의 성공적인 분리는 종종 도전하고 훈련과 연습의 어느 정도를 필요로 할 수 있습니다. 달성되면,이 프로토콜에서 제안 된 분리 방법은 안정적이고 효율적인 것으로 증명한다.
이 방법의 전체 목표는 높은 품질과 양의 관상 마우스의 EC (MCECs)을 획득하는 것이다. 심장에서 수집 된 세포의 양이 다른 기술을 이용하여 다른 조직에서 수집 된 세포보다 작은 경우에도,이 방법은 여전히 내기 제공터 품질. 얻어진 인구 내피 세포의 순도는 90 %보다 크다. 따라서,이 기술은 세포 이미징 순전히 절연 내피 세포에 의존하는 애플리케이션에 적합하다.
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Protocol
쥐에 대한 연구는 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을하고, 국립 보건 연구소 (NIH) 지침에 따라 수행 하였다.
주 : 섹션 1, 2, 3은 설치와 실험 하루 전에 수행되어야한다.
1. 준비 솔루션
- CD31 완충액 (50 mL) 중
- 50 ML 튜브에 50 ㎖ × 1 인산 버퍼 식염수 (PBS)를 추가합니다. 0.05 g 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.037 g 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 달아 50 ML 튜브에 추가 분말 용해 될 때까지 약 1 시간 동안 회전 튜브를 넣어. 7.4으로 산도를 조정 새로운 50 ML 튜브에 0.2 μm의 필터를 통해 필터링하고, 사용할 때까지 4 ℃에서 저장한다.
- HEPES와 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) (500 mL) 중
- HBSS 용액에 10 mM의 HEPES을 잘 혼합 HEPES의 1.1915 g을 추가합니다. pH를 측정하고 7.4로 조정한다. 4에서 필터 및 저장기음.
- 1 배 Kreb의 솔루션 (1 L)
- 1 L 플라스크에 증류수를 두 배로 10 × Kreb의 솔루션 [표 1] 100 ㎖를 추가합니다. 2.1 g 중탄산 나트륨 2 g D-포도당을 달아 플라스크에 추가 할 수 있습니다. 혼합 1 L.에 총 볼륨을 조절
- 후드 안쪽에 30 분 및 필터 솔루션 95 % O 2 / 5 % CO 2 가스 버블 솔루션입니다. 4 ℃에서 보관하고 실험 기간 동안 얼음에 보관하십시오.
2. 자기 비즈 준비
- 각 1.5 ML 튜브 (샘플 당 하나의 튜브)에 1 ml의 CD31 버퍼를 추가합니다. 양 반대로 쥐 IgG의 구슬을 혼합하고 각 샘플 [표 1]에 해당하는 금액을 추가합니다. 적극적으로 30 회 튜브를 흔들어 흔들어 1 분 동안 자기 접시에 배치합니다. 접시에있는 동안 튜브를 열고 물통에 솔루션을 덤프.
- 각각의 튜브에 1 ML의 CD31 버퍼를 추가합니다. 2 μL 쥐 항 마우스 CD31 안티 추가각각의 튜브에 몸과 4 ºC에서 튜브 O / N을 돌립니다.
3. 고압 증기 멸균
- 모든 수술 도구와 피펫 팁을 압력솥. 4 가지 직경 팁이되도록 좁은 데 넓은에서, 피펫 팁의 끝을 잘라. 팁에 대한 대략 직경 3 mm, 2.5 mm, 2mm, 각각 1.5 mm이다. 팁을 잘라 121 ºC의 온도에서 살균 30 분으로 전날 오토 클레이브.
주 : 섹션 4-11은 실험 당일에 수행되어야한다.
4. 준비 솔루션
- M199의 2 % 철 요새 송아지 혈청 (IFCS)를 포함하는 세척 버퍼를 준비합니다. 영상의 경우, 30 ㎖ / 마우스를 준비합니다.
- 효소 용액 (10 ㎖ / 샘플)을 준비한다. 50 ML 튜브에 0.6 단위 / 스파 아제 (Dispase) ml의 1 밀리그램 / 콜라게나 유형 II ml의 무게. M199을 추가하고 15 분 동안 4 ºC에서 튜브를 회전합니다. insid 새로운 50 ML 튜브에 0.2 μm의 필터를 통해 필터전자 후드와 사용할 때까지 4 ℃에서 보관하십시오.
- 헤파린과 HBSS / HEPES를 준비합니다. 15 ml의 튜브에 10 mM의 HEPES와 HBSS의 10 ML을 추가합니다. 튜브에 헤파린의 100 μl를 추가하고 사용할 때까지 4 ℃에서 보관하십시오.
5. 세탁 구슬
- 4 ºC에서 회에서 구슬 튜브를 타고 후드에 가져다. 자기 접시에 튜브를 넣고 1 분간 흔들어. 솔루션을 덤프하고 각 튜브에 1 ML의 CD31 버퍼를 추가합니다.
- 자기 판에서 튜브를 가지고 적극적으로 30 회를 흔들. 자기 접시에 튜브를 다시 넣고 3 세척 총 반복합니다. 완료 후, 4C 다시 튜브를 넣어 사용할 때까지 회전 유지.
6. 해부
- 혈액 응고를 방지하기 위하여 헤파린 0.1 ml를 복강 내 주사 한 마우스. 다음 펜토 바르 비탈 0.01 ml를 복강 내 주사를 사용하여 마우스를 마취, 10 분을 기다립니다. 마우스가 기분이되어 있는지 확인발을 곤란으로 고통.
- 머리 폴리스티렌 보드에 마우스를 놓고 핀으로 팔을 개최합니다. 목구멍까지 상부 흉부 영역에서 피부를 잘라 집게 힘든 컷 가위를 사용합니다.
- 바로 다이어프램 위의 흉곽의 중앙에 상처를 확인합니다. 심장과 폐를 노출 삼각형을 만들기 위해 목을 향해 옆으로 위쪽 뼈를 잘라. 단지 다이어프램 위의 대동맥을 잘라.
- 당기없이 집게로 흉선을 잡고 함께 폐와 심장을 제거하기 위해 조심스럽게 결합 조직을 잘라 가위를 사용합니다. 1 × Kreb의와 비커에 넣어 조직은 집게로 흔들어 1 × Kreb의와 6cm 접시에 전송할 수 있습니다.
- 가위와 집게를 사용하여 폐 로브를 제거합니다. 대동맥로 20 G 멸균 카테터를 삽입합니다. HBSS / 헤파린과 관상 동맥 순환계에 피를 플래시합니다. , 심실의 작은 상처를 확인 마음을 흔들 M199의 샘플 튜브에 전송할 수 있습니다. 얼음에 튜브를 유지합니다.
- 효소 용액 10ml를 가득 6cm 접시에 마음을 전송하고 가위를 사용하여 작은 조각으로 말하다. 15 분 동안 37 ºC 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 조직을 쉽게 통과 할 수 있도록 절단 끝이 팁을 통해 아래로 30 회를 피펫 팅에 의해 소화 물질을 교반.
- 또 다른 15 분 동안 37 ºC 인큐베이터에 다시 넣습니다. 교반을 세 번 반복, 가장 큰 구멍에서 피펫 팁을 사용하여 각 시간이 좁은 각 사이에 15 분 배양합니다.
- 마지막 15 분 부화 후, 출력 및 후드로 샘플을 채취. 피펫 솔루션 위로 피펫 팁 좁은 개구하고 새로운 50 ML 튜브에 40 μm의 셀 스트레이너 통과를 사용하여 아래로 30 회.
- 10 ML의 피펫을 사용하여 10 ml의 세척 버퍼 접시를 씻고 셀 스트레이너에 전송합니다. 실온에서 10 분 동안 400g의 원심 분리기 스핀에 50 ㎖ 튜브를 넣어.
- 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. 두 번 5 ml의 세척 버퍼와 세포를 씻으십시오.
- 이전 중 하나가 한 번에 하나의 튜브에 구슬과 작품에 1.5 ml의 튜브를 준비 가져옵니다. 자기 접시에 하나의 1.5 ML 튜브를 넣어 3 회 흔들어 엽니 다.
- 마지막으로 원심 분리 후, 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 많이 뜨는을 제거합니다. 적극적으로 쓸어 넘겨 세포 덩어리를 해제합니다.
- 50 ML 튜브에 1 ㎖의 세척 버퍼를 추가하고 1 ml를 피펫으로 세포를 섞는다. 1.5 ㎖의 튜브의 용액을 버리고 비드에 50 ㎖ 튜브에서 세포 현탁액 1 ㎖를 추가한다. 튜브 30 번 가볍게 한 다음 30 분 동안 4 ºC로 회전.
9. 세포 배양 / 이미징 준비
- 세포를 도금을위한 챔버를 준비합니다. 코팅 표면을 잘 챔버에 젤라틴 용액 (V / W 5 %, 300 μL)를 첨가하고, 37 ºC에서 30 분 동안 배양한다. 배양, REM 수면 후비켜 젤라틴 건조 표면.
- 회전 30 분 후에 비즈 / 세포와 튜브를 타고 후드 내부의 자기 접시에 넣어. 2 분, 덤프 흔들어 1 ml의 세척 버퍼를 추가합니다.
- 플레이트에서 튜브를 가지고, 적극적으로 30 배 다음 영화 30 번 흔들어. 자기 판에서 그들을 다시 넣고 1 분간 흔들어. 5 세척 총 4 회 반복하지만, 1 분은 접시에 진탕.
- 마지막 세척 후, 하나의 튜브를 꺼내 한 번에 각각의 튜브 하나에서 작동합니다. 다음 30 배를 가볍게 30 회 흔들어. 자기 접시에 넣어 1 분간 흔들어. 덤프 및 (37 ºC에서 미리 예열) 1 ml의 20 % IFCS EC 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 적극적으로 30 배는 30 배를 가볍게 흔들어. 500 μL에 피펫을 조정하고 최대 피펫 10 배 아래로. 각 챔버에 500 μl를 전송합니다.
- 37 ºC 배양기에 넣고 / N을 O를 둡니다. 다음 날, 10 % FBS EC 매체와 세포를 씻는다.
웨스턴 블롯 (WB) 샘플 (10)을 준비
- 탁회전 1 시간 후 비즈 / 세포와 튜브를 전자. 자기 접시에 넣어 2 분간 흔들어. 상층 액을 버리고 1 ml의 차가운 HBSS를 추가합니다. 적극적으로 30 배는 30 배를 가볍게 흔들어. 3 세척 두 번 반복하지만, 1 분은 접시에 진탕.
- 마지막 세척 후, 자기 접시에 튜브를 넣고 1 분간 흔들어. 피펫을 사용하여 버퍼를 제거하는 방법은 이전에 11, 12 설명 사용 WB의 세포를 용균. 수집 된 해물은 일반적으로 약 30 μg의 단백질이 포함되어 있습니다.
11. 영상
- 챔버 250 μL의 최종 볼륨, 미디어 세포를 3 회 반복한다. 세포에 DIL-acLDL의 1.5 μl를 추가합니다. 이 시점에서, 어둠 속에서 세포를 유지합니다.
- 37 ℃에서 3.5 시간 동안 품어. , 훽스트 (Hoechst)의 1.5 μl를 추가 잘 혼합과 PBS 37 ˚C.Wash 세포에서 30 분 동안 배양하고 실온에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정한다.
- 30 마일에 대한-PBS를 BSA PBS로 두 번 세척하고 5 %로 차단실온에서 N. 1 % BSA-PBS로 두 번 씻는다. ml의 2 μg의 /의 농도가 1 % BSA-PBS를 사용하여 BS-렉틴-FITC를 희석하고 각 실에 300 μl를 추가합니다.
- 실온에서 30 분 동안 진탕 기의 챔버를 넣는다. PBS 3 회 씻는다.
- FITC (렉틴 염색, EC 마커, 여기 / 방출 488 ㎚ / 519 ㎚), DAPI (훽스트, 358 nm에서 핵 염색, 여기 / 방출 / 30 밀리 초 200 밀리의 노출 시간을 형광 현미경으로 세포를 시각화 461 ㎚), 및 557 ㎚ / 576 ㎚)에서 TRITC (acLDL 염색, EC 마커, 여기 / 방출 300 밀리 초. 20 배의 대물 렌즈를 사용하여 이미지를 획득.
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Representative Results
마우스 마음에서 관상 동맥 내피 세포의 성공적인 분리는 일반적으로 조약돌 모양으로 90 % 이상의 순도 약 10 4 세포를 얻을 수 있습니다. 내피 세포의 순수한 인구를 들어,주의는 오염이없는 무균 환경을 보장하기 위해 프로토콜을 통해주의해야한다. 신장 세포 집단 내 세포의 확대 외관은 다른 유형의 세포, 평활근 세포 및 섬유 아세포 오염을 나타낸다. 내피 세포의 순도 시험 내피 세포 표면 마커, BS-렉틴 acLDL (도 1)으로 세포를 염색하여 수행된다. 두 색을 나타내는 양성 세포의 비율은 MCEC에서 90 % 이상이었다. 이러한 결과는 기술이 성공적으로 수행되었음을 나타냅니다.
| PBS (10 배) (1 L) | </ TD> | ||
| 자료 | MW | 양 (g) | |
| 염화나트륨 | 58.44 | (80) | |
| KCl을 | 74.55 | 이 | |
| 나 2 HPO 4 | 141.96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136.08 | 이 | |
| 크렙스 (10 배) (1 L) | |||
| 자료 | MW | 진한 (㎜) | 양 (g) |
| 염화나트륨 | 58.44 | (118) | 69 |
| KCl을 | 74.56 | 4.7 | 3.5 |
| 염화칼슘 2 • 2H 2 O | 147 | 1.8 | 2.6 |
| 황산 • 7H 2 O | 246.5 | 1.2 | 2.96 </ TD> |
| 의 NaH 2 PO 4 | (120) | 1.2 | 1.44 |
| EC 미디어 (20 %) (500 mL) 중 | |||
| 자료 | 양 | ||
| M199 | 444.5 ml의 | ||
| 10-20 U / ㎖ 헤파린 | 500 μL | ||
| D-발린 | 25 mg의 | ||
| IFCS | 100 ㎖ | ||
| EGS | 10 mg의 | ||
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 | 5 ml의 | ||
| 구슬의 양 한 마우스에 사용되는 | |||
| 이미징을위한 | 5 μL | ||
| 에프또는 WB / PCR | 10 μL | ||
표 1. 사용 솔루션의 화학 성분.
MCECs. 형광 이미지 그림 1. 대표 이미지는 마음에서 고립 된 마우스 관상 동맥되는 EC (MCEC)는 EC 인구의 높은 순도를 나타내는 것으로 나타났다. 순도는 MCEC에서 녹색 (B)에 붉은 색 (A) 및 렉틴 염색의 두 acLDL 흡수하여 확인 시험을 실시하고 있습니다. 핵은 푸른 색에 훽스트 (C)에 의해 염색 하였다. 두 색을 나타내는 양성 세포의 비율은 MCEC에서 90 % 이상이었다. 바는 20 μm의 대표입니다. 더 큰 적이있는을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 이온.
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Discussion
연구에서 가장 널리 사용되는 혈관 내피 세포 때문에 편리 성과 용이성 배양 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC에)에있다. 그러나, 많은 연구가 다른 특정 기관 (10)으로부터 내피 세포의 분리에 의해 달성 생리 모델의 이용을 필요로한다. 내피 세포는 심장 조직에서 세포의 매우 작은 인구를 구성; 자신의 분리 및 배양이 매우 어려운 것으로 증명할 수 있습니다.
이 프로토콜 내에서 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 혈액을 잘 세척하는 것입니다. 혈액 내의 백혈구는 세포 표면 마커로서 CD31을 발현하고, 상기 CD31 항체의 결합에 대해 경쟁되는 EC 바와 같이이 필요하다. 다른 내피 세포는 또한 세척, 혈액에 존재할 수있는 바와 같은 세포에 의한 오염을 방지하기 위해 필수적이다. 두번째 중요한 단계는 분리 과정 전반에 걸쳐 무균 환경을 유지하는 것이다. 모든 오염 resu얻어 세포의 수를 극적으로 감소 LTS. 마지막으로 세 번째 중요한 단계 분리의 효율을 감소 그렇지 정전 등 CD31 완충액의 pH를 조정할 수있다.
셀의 품질이 차단 중 가장 중요하다. 평활근 세포는 성장 배지에 헤파린 적절한 양의 첨가에 의해 억제 될 수있다. 섬유 아세포 증식 미디어에 D-발린을 추가로 둔화 될 수있다. 내피 세포는 population.The 내피 세포 표현형의 순도를 테스트하기 위해 BS-렉틴 DIL-AcLDL 공동 염색의 흡수에 의해 특징 지어 질 수있는 것은 불안정하고 그 동작을 빠르게 회 원 조직 취출 변경할 수 배양. 기술의 한계는 세포들이 여전히 표현형을 유지하도록 배양 5 일 후에 사용되지 않아야한다는 것이다. 강력하게 세포를 통과하지 않는 것이 좋습니다. 차 전지는 일관된 resu을 제공 할 것입니다LT.
전반적으로,이 기술은 뛰어난 순도 세포의 좋은 숫자가 발생합니다. 필요한 기술을 가진, 상기 분리 공정은 6 시간 내에 완료 될 수있다. 그것은 세포 배양 또는 분자 생물학적 실험 중 하나에 대한 마우스 관상 동맥 내피 세포를 얻기위한 좋은 방법을 제공한다.
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Acknowledgments
이 작품은 건강 (A. 마키노에 HL115578)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
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