Abstract
Эндотелиальные клетки выстилают внутреннюю стенку кровеносных сосудов и играют важную роль в регуляции сосудистого тонуса, проницаемости сосудов и новой сосудистой формации. Эндотелиальной дисфункции клеток вовлечена в развитие и прогрессирование многих сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе ишемической болезни сердца. Для изучения функции и характеристики коронарных эндотелиальных клеток, клеток изоляции является первым шагом, и это требует высокой степени чистоты и количества для проведения последующих экспериментов. Этот протокол описывает эффективный метод, чтобы изолировать взрослых мышей коронарные эндотелиальные клетки. Сердце мыши рассекают и измельчали на мелкие кусочки. После того, как переваривание сердца с помощью диспазу и коллагеназы II, клетки промывали и инкубировали с магнитными шариками, которые сопрягаются с анти-CD31 антителом. Шарики с эндотелиальные клетки промывают несколько раз и готовы к использованию в различных приложениях, в том числе изображений и молекулярно-биологической experimeNTS. Эффективная изоляция дает приблизительно 10 4 клеток на одно сердце с чистотой более 90%.
Introduction
Мышиные модели различных сердечно-сосудистых заболеваний и нарушений обмена веществ несут физиологические и молекулярные изменения, которые аналогичны тем, которые встречаются у пациентов. Кроме того, генетическое изменение мышей является мощным инструментом, который позволяет исследовать патогенную роль специфических генов в развитии и прогрессировании заболеваний. В настоящее время, ген-забивные камерного типа специфических или отъезда мышей легко образуются во многих лабораториях и измерения мРНК и уровня белка в определенных типах клеток является первым шагом в определении того, мыши были действительно генетически модифицированы.
Эндотелий представляет собой тонкий один слой эндотелиальных клеток (ЭКС), что линии внутренней стенки сосуда. Эндотелиальные клетки играют важную роль в регуляции сосудистого тонуса, проницаемости сосудов, а также новые сосудистые образования 1,2. Эндотелиальная дисфункция является отличительной чертой многих патологических состояний и изменений в эндотелиальной функции может привести к различным автомобилясосудистых заболеваний 3,4. Таким образом, существенным для изучения функции эндотелиальных клеток в физиологических и патофизиологических условиях.
Есть несколько способов , чтобы изолировать ECs 5-8 и метод изоляции должен быть оптимизирован в зависимости от того, который будет использоваться тканей и видов. Это происходит потому , что КЭ из разных тканей показывают высокий уровень неоднородности по отношению к их поверхности маркеров и экспрессии белка 9. Успешное выделение эндотелиальных клеток часто может быть сложным и требует некоторой степени обучения и практики. После того, как достигнуто, способ выделения предложенного в данном протоколе оказывается стабильной и эффективной.
Общая цель этого метода является получение мыши коронарных (MCECs ECs) высокого качества и количества. Даже при том, что количество клеток, выделенных из сердца меньше, чем клетки, собранные из других тканей с использованием других методов, этот метод все еще обеспечивает ставкуКачество тер. Чистота эндотелиальных клеток в результате популяции превышает 90%. Таким образом, этот метод был бы идеальным для приложений, которые опираются на чисто изолированных эндотелиальных клетках, таких как клетки визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования на мышах было одобрено животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) из Университета штата Аризона и по проводили в соответствии с Национальным институтом здоровья (NIH) руководящих принципов.
Примечание: В разделах 1, 2 и 3 следует проводить за день до начала эксперимента в качестве установки.
1. приготовления растворов
- CD31 буфер (50 мл)
- Добавить 50 мл 1 × забуференного физраствора (PBS) в 50 мл пробирку. Взвешивают 0,05 г бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,037 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и добавляют к 50 мл трубку и положить трубку, чтобы вращаться в течение приблизительно 1 ч до порошка не растворится. Регулировка рН до 7,4, фильтруют через фильтр с размером пор 0,2 мкм в новую 50 мл пробирку, и хранят при температуре 4 ° С до использования.
- Ханка сбалансированный солевой раствор (HBSS) с HEPES (500 мл)
- Добавьте 1.1915 г HEPES сделать 10 мМ HEPES в растворе HBSS и хорошо перемешать. Измерьте рН и отрегулировать до 7,4. Фильтр и хранить при температуре 4˚C.
- раствор 1x Кребса (1 л)
- Добавляют 100 мл раствора 10 × Кребса [Таблица 1] в дважды дистиллированной воде в колбу емкостью 1 л. Взвешивают 2,1 г бикарбоната натрия и 2 г D-глюкозы и добавляют в колбу. Смешать и довести общий объем до 1 л
- Bubble раствор с 95% O 2/5% CO 2 газа в течение 30 мин и фильтровальной раствора внутри капота. Хранить при температуре 4 ° С и держать на льду во время эксперимента.
2. Подготовка магнитных шариков
- Добавляют 1 мл CD31 буфера в каждую 1,5 мл трубки (одна трубка на образец). Смешайте овец против крысиного IgG шарики и добавить соответствующее количество для каждого образца [Таблица 1]. Встряхнуть пробирки энергично 30 раз и поместить их в магнитной пластине в течение 1 мин встряхивания. Откройте трубки в то время как на пластине и складывать решения в ведро.
- Добавить 1 мл CD31 буфера в каждую пробирку. Добавьте 2 мкл анти-мышиных анти CD31тела в каждую пробирку и вращать трубы O / N при 4 ° С.
3. автоклавирования
- Автоклав все инструменты хирургии и пипеток. Обрежьте концы пипеток, так что есть наконечники с 4-х различных диаметров, от самой широкой до узкой. Приблизительные диаметры для наконечников 3 мм, 2,5 мм, 2 мм и 1,5 мм соответственно. Обрежьте кончики и автоклав за день до 30 мин стерилизации при температуре 121 ° С.
Примечание: Разделы 4 - 11 должны проводиться на день эксперимента.
4. Решения Готовимся
- Приготовьте промывочный буфер, содержащий 2% обогащенные железом телячьей сыворотки (МФХБ) в M199. Для получения изображений, подготовить 30 мл / мышь.
- Готовят раствор фермента (10 мл / образец). Взвешивают 0,6 ед / мл диспаза и 1 мг / мл коллагеназы типа II в 50 мл пробирку. Добавить M199 и вращать трубу при температуре 4 ° С в течение 15 мин. Смесь фильтруют через фильтр 0,2 мкм в новую 50 мл трубки insidе капот и держать при температуре 4 ° С до использования.
- Приготовьте HBSS / HEPES с гепарином. Добавьте 10 мл HBSS с 10 мМ HEPES в 15 мл пробирку. Добавьте 100 мкл гепарин в пробирку и хранить при температуре 4 ° С до использования.
5. Стиральная Бусы
- Выньте пробирки с бусинами из ротатора при 4 ° С и привести к капоту. Место труб в магнитной пластины и встряхивают в течение 1 мин. Свалка раствора и добавляют 1 мл буфера CD31 в каждую пробирку.
- Возьмите трубы из магнитной пластины и энергично встряхивают в 30 раз. Поместите трубки обратно в магнитной пластины и повторить в общей сложности 3 стирок. После завершения, поместите пробирки обратно в 4С и держать вращая до использования.
6. Вскрытие
- Впрыскивать мышей внутрибрюшинно 0,1 мл гепарин для предотвращения свертывания крови. Подождите 10 минут, а затем обезболить мышей с использованием внутрибрюшинную инъекцию 0,01 мл пентобарбитала. Проверьте, если мышь чувствуетболи, зажимая ногу.
- Поместите мышь на полистирольной доске с головы и держать руки иголками. Используйте пинцет и жесткие-CUT-ножницы, чтобы разрезать кожу на верхней грудной области до горла.
- Делают разрез в центре грудной клетки, как раз над диафрагмой. Вырежьте кость в сторону и вверх по направлению к горлу, чтобы сделать треугольник, раскрывающую сердце и легкие. Вырезать аорту чуть выше диафрагмы.
- Держите тимус с пинцетом, не вытаскивая и использовать ножницы, чтобы тщательно вырезать любой соединительной ткани, чтобы удалить легкие и сердце вместе. Место ткани в химическом стакане с 1 × Кребса, трясти с пинцетом и передать 6 см блюдо с 1 × Кребса.
- Удалите долей легких с помощью ножниц и щипцов. Вставьте 20 G стерильный катетер в аорту. Промойте кровь в коронарной системы кровообращения с HBSS / гепарин. Сделайте небольшой разрез в желудочке, трясти сердце и переносят в пробирку из M199. Хранить трубы на льду.
- Перенести сердце на 6 см чашку, наполненную 10 мл раствора фермента и фарша его на мелкие кусочки с помощью ножниц. Поместите посуду в 37 ºC инкубаторе в течение 15 мин. Перемешайте переваривается материалы пипетированием вверх и вниз 30 раз через наконечник с конца разреза, чтобы ткань, чтобы пройти через легче.
- Положите его обратно в 37 ºC инкубаторе в течение еще 15 мин. Повторите агитацию в три раза, каждый раз с помощью пипеток из самых больших отверстий в узком и 15 мин инкубации между собой.
- После последней 15-минутной инкубации, берут пробы, и в капот. Пипеткой решение вверх и вниз 30 раз, используя пипеткой наконечник с отверстием и узкому проходят через 40 мкм клеточный фильтр с в новый 50 мл пробирку.
- Мойте блюдо с буфером для промывки 10 мл с помощью 10 мл пипетки и переносят на клеточный фильтр. Поместите 50 мл пробирки в центрифуге и спина при 400 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант, не нарушая гранул. Вымойте клеток с буфером для промывки 5 мл дважды.
- Получить один из предварительно приготовленный 1,5 мл пробирки с бисером и работы на одной трубе одновременно. Положите одну 1,5 мл трубки в магнитной пластине, встряхнуть 3 раза и открыть его.
- После последнего центрифугирования, удалить как можно больше супернатант насколько это возможно, не нарушая гранул. Разъединить сгустки клеток Смахивающее энергично.
- Добавить 1 мл промывочного буфера в 50 мл пробирку и смешать клетки с 1 мл пипетки. Дамп раствора из 1,5 мл трубки и прибавляют 1 мл клеточной суспензии из 50 мл пробирку с гранулами. Флик трубок 30 раз затем, вращая при 4 ° С в течение 30 мин.
9. Подготовка к клеточной культуре / визуализации
- Подготовка камеры для металлизации ячеек. Добавить раствор желатина (5% вес / объем, 300 мкл) в камере и для покрытия поверхности и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° С. После инкубации РЗМОве желатин и сухой поверхности.
- Выньте пробирки с бисером / клеток через 30 мин вращения и положить в магнитной пластины внутри вытяжки. Встряхивают в течение 2 мин, свалка и добавьте 1 мл промывочного буфера.
- Возьмите трубы из пластины, энергично встряхивают 30 раз, то Флик в 30 раз. Положите их обратно в магнитную пластину и встряхивают в течение 1 мин. Повторить 4 раза в общей сложности 5 промываний, но с 1 мин встряхивая на тарелке.
- После последней промывки, вынуть одну трубку и работать на каждой трубке по одному за раз. Взболтать 30 раз затем вылить в 30 раз. Положите его на магнитную пластину и встряхивают в течение 1 мин. Свалка и добавить 1 мл 20% СМИ МФХБ EC (предварительно нагревают при 37 ° С).
- Энергично встряхивают 30 раз затем вылить в 30 раз. Отрегулируйте пипетку до 500 мкл и пипеткой вверх и вниз 10 раз. Перенести 500 мкл в каждую камеру.
- Помещенный при 37 ºC инкубатора и оставить O / N. На следующий день, мыть клетки с 10% FBS СМИ ЕС.
10. Подготовка к вестерн-блот (ВБ) Образцы
- Takе из пробирки с бисером / клеток через 1 ч вращения. Поместите их в магнитную пластину и встряхивают в течение 2 мин. Свалка супернатант и добавляют 1 мл холодного HBSS. Энергично встряхивают 30 раз затем вылить в 30 раз. Повторите дважды в течение 3 стирок, но с 1 мин встряхивая на тарелке.
- После последней промывки, положить трубы на магнитной пластине и встряхивают в течение 1 мин. Удалить буфер с помощью пипетки и лизиса клеток для WB с использованием метода ранее описанного 11,12. Собранная лизат обычно содержит около 30 мкг белка.
11. обработки изображений
- Промыть клетки 3 раза с помощью средств массовой информации, с конечным объемом 250 мкл для камеры. Добавить 1,5 мкл Dil-AcLDL к клеткам. С этой точки зрения, сохранить клетки в темноте.
- Инкубируют в течение 3,5 ч при 37 ° С. Добавить 1,5 мкл Hoechst, хорошо перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при 37 ˚C.Wash клеток с PBS и зафиксировать 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Промыть два раза с PBS и блокируют с 5% BSA-PBS в течение 30 мип при комнатной температуре. Промыть два раза с 1% BSA-PBS. Развести BS-лектин-FITC с использованием 1% BSA-PBS, до концентрации 2 мкг / мл и добавляют по 300 мкл в каждую камеру.
- Поместите камеру на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Мытье с PBS 3 раза.
- Визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом с временем экспозиции 200 мс для FITC (лектина окрашивания, с маркером ЕС, возбуждение / излучения 488 нм / 519 нм), 30 мс для DAPI (Hoechst, ядерное окрашивание, возбуждения / эмиссии при 358 нм / 461 нм), и 300 мс для TRITC (AcLDL окрашивания, с маркером ЕС, возбуждения / эмиссии при 557 нм / 576 нм). Получение изображений с использованием 20X объектив.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное выделение коронарных эндотелиальных клеток из сердца мыши обычно дает около 10 4 клеток с более чем 90% чистоты с помощью формы булыжник. Для получения чистой популяции эндотелиальных клеток, следует соблюдать осторожность в течение всего протокола для обеспечения стерильной среде, свободной от каких-либо загрязнений. Появление удлиненных клеток или увеличенных клеток в популяции указывает на загрязнение с другими типами клеток, клеток и фибробластов гладкой мускулатуры. Испытание Эндотелиальная чистоты клеток осуществляется путем окрашивания клеток с эндотелиальной маркера клеточной поверхности, BS-лектин и AcLDL (рисунок 1). Процент положительных клеток, которые демонстрируют оба цвета были более 90% в МГИК. Такой результат указывает на то, что эта техника была выполнена успешно.
| PBS (10x) (1 л) | </ TD> | ||
| материал | МВт | Количество (г) | |
| NaCl | 58.44 | 80 | |
| KCl | 74.55 | 2 | |
| Na 2 HPO 4 | 141,96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136.08 | 2 | |
| Кребс (10x) (1 л) | |||
| материал | МВт | Конц (мМ) | Количество (г) |
| NaCl | 58.44 | 118 | 69 |
| KCl | 74.56 | 4.7 | 3.5 |
| CaCl 2 • 2H 2 O | 147 | 1.8 | 2.6 |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 246,5 | 1.2 | 2,96 </ TD> |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1.2 | 1,44 |
| EC Средства массовой информации (20%) (500 мл) | |||
| материал | Количество | ||
| M199 | 444,5 мл | ||
| 10 - 20 Ед / мл гепарин | 500 мкл | ||
| D-валин | 25 мг | ||
| МФХБ | 100 мл | ||
| EGS | 10 мг | ||
| Пенициллин / стрептомицин | 5 мл | ||
| Количество бусин, которые будут использоваться для одной мыши | |||
| Для получения изображений | 5 мкл | ||
| Fили WB / ПЦР | 10 мкл | ||
Таблица 1. Химические составы растворов , используемых.
Рисунок 1. Типичные Изображения MCECs. Флуоресцентные изображения показывают , что мыши коронарной КЭ (МГИК) , выделенные из сердца демонстрируют высокую чистоту населения ЕС. Чистота была проверена как поглощение AcLDL красного цвета (A) и лектин окрашивания в зеленый цвет (B) в МГИК. Ядро было окрашивали Hoechst в синем цвете (C). Процент положительных клеток, которые демонстрируют оба цвета были более 90% в МГИК. Бар является представителем 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное версион этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее широко используемые эндотелиальные клетки в исследовании являются эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs) из-за их удобства и простоты культивирования. Тем не менее, много исследований требует наличия физиологической модели достигается за счет выделения эндотелиальных клеток от других конкретных органов 10. Эндотелиальные клетки составляют очень незначительную популяцию клеток в ткани сердца; их изоляция и культивирование может оказаться очень трудным.
Есть три важных шагов в рамках этого протокола. Во-первых, чтобы очистить скважину крови. Это необходимо, так как лейкоциты в пределах крови также выразить CD31 в качестве маркера клеточной поверхности, и будет конкурировать с КЧС для связывания с антителом CD31. Как и другие эндотелиальные клетки, могут также присутствовать в крови, промывка имеет важное значение для предотвращения загрязнения такими клетками. Вторым важным шагом является поддержание стерильной среды в течение всего процесса выделения. Любое загрязнение RESULTS к резкому снижению числа клеток достигается. И, наконец, третий важный шаг заключается в корректировке рН буфера CD31, поскольку неспособность сделать это приведет к снижению эффективности изоляции.
качество Сотовый является наиболее важным во время этой изоляции. Плавный рост мышечных клеток может быть подавлена путем добавления соответствующего количества гепарина в культуральную среду. пролиферации фибробластов может быть замедлено добавлением D-валин в средствах массовой информации. Эндотелиальные клетки можно характеризовать поглощение Dil-AcLDL и совместным окрашиванием BS-лектина, чтобы проверить на чистоту фенотипа population.The эндотелиальной клетки нестабилен и их поведение может измениться быстро, как только вынимают из исходной ткани и культивируют. Ограничением метода является то, что клетки не должны быть использованы через 5 дней культивирования, чтобы гарантировать, что они по-прежнему сохраняют свою фенотип. Настоятельно рекомендуется не пропускать клетки. Первичные клетки будут обеспечивать последовательную RESUл.
В целом, метод приводит к хорошим числом клеток выдающейся чистоты. С необходимыми навыками, процесс изоляции может быть завершена в течение 6 часов. Это обеспечивает отличный способ получения мышиных коронарных эндотелиальных клеток для каждой культуры клеток или молекулярно-биологических экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья (HL115578 А. Макино).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
