담즙액은 잠재적으로 중요한 바이오마커를 포함하는 세포 외 소포체/엑소좀의 귀중한 공급원입니다. 이 프로토콜은 miRNA 프로파일링을 포함한 추가 분석을 위해 인간 담즙에서 엑소좀을 분리하는 강력한 방법을 나타냅니다.
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이 논문에서
요약
초록
지난 3 년간의 엑소 좀 연구는 크게 바이오 마커 및 치료 용도의 식별 및 특성으로 범위를 확장했다.
엑소 좀 최근 마이크로 RNA (미르)을 함유하는 것으로 나타났다. 미르 자체 진단을 위해 가치있는 바이오 마커로 제기했다. 진료소와 병원에서 표본 수집이 매우 변수이기 때문에, 전체 담즙에서 miRNA의 분리가 실질적으로 변화한다. 간단하게 수집 담즙 샘플들로부터 강력한 정확하고 재현성 miRNA의 프로파일을 달성하기 위해서 분리 담즙에서 엑소 좀을 특징 고품질 프로토콜의 개발이 필요했다. 이 방법은 몇 회 원심 분리 및 엑소 좀 펠렛 최종 초 원심 분리 공정과 여과 단계를 필요로한다. 전자 현미경, 웨스턴 블랏은 유동 세포 계측법 및 다중 파라미터 나노 광학 분석이 가능하며, 전자의 품질을 확인하는 것이 중요 특성화 단계는xosomes. 즉, 예쁜 꼬마 선충, 같은 종에서 비특이적, 합성의 miRNA와 해물을 급상승 이러한 엑소 좀에서의 miRNA의 분리를 위해, CEL-은 miR-39, RNA 추출 효율의 정상화를 위해 중요하다. 이 방법에 따라 담즙 액에서 엑소 좀의 분리는 성공의 miRNA는 -80 ° C에서 몇 년 동안 저장된 담즙 샘플에서 프로파일 링 할 수 있습니다.
서론
다른 생물 즉, 유체, 모유, 플라즈마 또는 소변과 마찬가지로, 담즙은 엑소 좀, 지질이 풍부한 소포 1-4가 포함되어 있습니다. 엑소 좀을 유도하거나받는 셀 (5), (6), 정상 기능 (4), 7-9의 일부일 수도 세포 간 통신의 형태 생물학적 기능을 변경할 수있다. 엑소 좀 진단 (10)에 대한 바이오 마커의 가치있는 소스를 제공 할 수 miRNA의 종을 포함 할 수 있습니다. miRNAs의 프로파일 질환 11-14의 다양한 진단 및 예후 표지자로서 최근에 상당한 관심을 얻고있다.
miRNA의 자체는 생물학적 유체, 아마도 죽은 세포에 의해 발표 및 창고 세포의 양이 크게 기저 질환에 의해 영향을받을 수에서 찾을 수 있습니다. 엑소 좀의 miRNA의 프로필은 반드시 원래 셀 6, 10, 15 ~ 17의 miRNA의 프로파일을 반영하지 않는, 아직 엑소 좀은 부모 가전에 대한 특성 수 있습니다 miRNA의 서명을 수행 할 수있다종양 세포를 원하는 것이다. 종양 유래 엑소 좀은 폐 선암, 전립선 암 등의 종양이 8, 16, 18을 가진 환자의 혈장에서 발견되었다.
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프로토콜
내시경 역행 췌담 관 조영술에 의한 환자에서 담즙을 취득 (ERCP)는 임상 시험 심사위원회에 의해 인간 대상 연구 프로토콜의 승인을 필요로한다. 여기에 제시된 모든 작업은 존스 홉킨스 대학의 임상 시험 심사위원회의 승인을했다.
담즙 1. 엑소 좀 격리
- 내시경 역행 췌담 관 조영술 (ERCP)을 수행합니다. 앙와위에서 환자를 놓고 삽관.
- 환자의 구강을 통해 십이지장을 전달하고 십이지장의 두 번째 부분에 삽입하고 주요 유두를 식별합니다.
- 선택적 트리플 루멘은 0.035 인치 (0.9 mm) 가이드 와이어 친수성 사전로드 sphincterotome 삽입하여 담관을 cannulate.
- 경우에는 바로 간 덕트에서 담낭 관을 구별하기 어려울 수 있기 때문에 왼쪽 간장 덕트 투시하에 가이드 와이어를 사전, 다음을 발전안정된 위치를 취득하는 담관에 5cm를 sphincterotome.
- 루어 잠금 장치를 통해 가이드 와이어 포트에 10 ML의 주사기를 연결, 가이드 와이어를 제거하고 부압 10 ㎖를 사용하여 담즙을 대기음.
- 가이드 와이어를 다시 삽입하여 담즙 트리를 opacify하기 위해 주입 포트를 통해 조영제를 주입하여 ERCP를 진행하는 ....
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결과
엑소 좀 일반 현미경에 의해 검출 또는 유세포하기에는 너무 작기 때문에, 전자 현미경 또는 나노 입자의 광학 분석이 수행되어야한다. 나노 입자의 광학 분석은 또한 정량적이고 크기 분포 및 농도를 제공하는 전자 현미경 위에 이점을 갖는다. 장비는 시료에 유리 프리즘을 통해 정밀하게 초점을 맞춘 레이저 빔을 소개합니다. 격리 소포 브라운 운동은 EMCCD 고감도 카메라로 캡처 프레임마다 추적한다. 나노 입자 추적 분석 (NTA) 소프트웨어 대책이 브라운 운동 프레임. 크기 모드 및 담즙 엑소 제제의 분포를 계산하는 프레임 (1) 인간 담즙 샘플로부터 단리 엑소 전형적인 NTA 분석의 결과를 나타낸도.
또는, 전자 현미경을 이용할 수있다도 2A는 인간으로부터 분리 엑소 담즙에.......
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토론
확실 담즙 분리 엑소 좀을 이용하기 위해, 창에 고품질의 샘플을 얻기 위해 일관된 고품질의 분리 방법을 채용하는 것이 중요하다. 이 논문에 정의 된 방법론은 인간의 담즙에서 엑소 좀과의 miRNA를 분리하는 잘 확립 된 방법입니다. 그것은 최소한 전자 현미경이나 나노 입자의 광학 분석 및 웨스턴 블롯을 포함한다 고립 엑소 좀의 특성 몇 가지 중요한 단계를 강조한다.
이 miRNA의 안정성에 관해서 엑소 좀의 분리에서 가장 중요한 단계는 적어도 가능한 빨리 신선한 담즙 처리하는 것이다. RT 또는 여러 동결 - 해동 사이클을 받고 저장하더라도 달리 격리 엑소 좀은 매우 안정한 반면 RT에서 전체 담즙 또는 하나의 동결 - 해동 사이클의 장기간 보관 크게 miRNA의 함량을 감소시킬 수있다. 한 문제의 샘플은 -80 ° C, 엑소 좀 미르의 성공적인 분리에 저장되어있는로담즙의 NA는 샘플에서 miRNA의 서명을 식별하는 데 좋은 재현성으로 수행 될 수있다. 초기에 적절한 miRN.......
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공개 사항
저자 중 누구도 경쟁하는 재정적 이해관계를 가지고 있지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(NIH)에서 F.M.S.로 K08 상(DK090154-01)을
수상했습니다.....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 & 마이크로; m 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인 필터 | Corning | 431229 | |
| thinwall 폴리알로머 초원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti 로터 | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| 나노 입자 추적 분석(NTA) 소프트웨어 | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche 유통 Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 항체 | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
참고문헌
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before ....
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