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Developmental Biology

प्रेरित pluripotent स्टेम तंतुकोशिका-तरह Synoviocytes का उपयोग कोशिकाओं की पीढ़ी रुमेटी गठिया के रोगियों के जोड़ों से पृथक

Published: October 16, 2016 doi: 10.3791/54072
Automatic Translation
1,3, 1, 1, 2,3
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, Republic of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, Republic of Korea, 3College of Medicine, The Catholic University of Korea, Republic of Korea

Summary

यहाँ हम रोगी व्युत्पन्न fibroblast-तरह synoviocytes से मानव प्रेरित-स्टेम कोशिकाओं को पैदा करने, फीडर कोशिकाओं के बिना एक lentiviral प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Abstract

परिपक्व दैहिक कोशिकाओं reprogramming कारकों में से एक परिभाषित सेट का उपयोग कर एक स्टेम सेल की तरह राज्य में उलट हो सकता है। Oct4, Sox2, Klf4 और सी Myc: कई अध्ययनों से चार यामानाका प्रतिलेखन कारक transducing द्वारा विभिन्न दैहिक प्रकार की कोशिकाओं से प्रेरित-pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) उत्पन्न किया है। IPSCs का अध्ययन जैविक और नैदानिक ​​अनुसंधान की धार पर बनी हुई है। विशेष रूप से, रोगी विशेष IPSCs के बाद से IPSCs किसी भी व्यक्ति के ऊतकों से प्रेरित किया जा सकता है, रोग pathobiology के अध्ययन के लिए एक अग्रणी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। संधिशोथ (आरए) एक जीर्ण सूजन की बीमारी, कार्टिलेज और संयुक्त में हड्डियों के ढांचे के विनाश के द्वारा वर्गीकृत है। श्लेष हाइपरप्लासिया प्रमुख कारण या लक्षण है कि आरए में इन परिणामों के लिए नेतृत्व में से एक है। Fibroblast-तरह Synoviocytes (FLSs) hyperplastic synovium में मुख्य घटक कोशिकाओं रहे हैं। संयुक्त में FLSs limitlessly पैदा करना, अंत में आसन्न cartil पर हमलाउम्र और हड्डी। वर्तमान में, hyperplastic synovium केवल एक शल्य प्रक्रिया द्वारा हटाया जा सकता है। हटा synovium एक सामग्री है कि संयुक्त के भड़काऊ हालत को दर्शाता है के रूप में आरए अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है। आरए के रोगजनन में एक प्रमुख खिलाड़ी के रूप में, FLSs पैदा करते हैं और आरए रोगियों के IPSCs जांच करने के लिए एक सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम IPSCs उत्पन्न करने के लिए एक आरए रोगी की FLSs इस्तेमाल किया। एक lentiviral प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमें पता चला कि FLSs आरए रोगी विशेष IPSC उत्पन्न कर सकते हैं। FLSs से उत्पन्न IPSCs आगे भविष्य में आरए के pathophysiology अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

स्टेम कोशिकाओं विभिन्न नैदानिक ​​और जैविक क्षेत्रों में अगली पीढ़ी के मंच हैं। वे एक होनहार उपकरण है कि रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, और पुनर्योजी चिकित्सा उपचार में इस्तेमाल किया जा सकता है। मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) मुख्य रूप से अध्ययन करने और pluripotent कोशिकाओं को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया। बहरहाल, मानव ब्लास्टोसिस्ट के विनाश से अलग, hESCs कई नैतिक चिंताओं के साथ जुड़े रहे हैं। 2007 में, डा शिन्या यामानाका और उनकी टीम सेल प्रोग्रामिंग प्रक्रिया उलट और मानव वयस्क दैहिक कोशिकाओं 1,2 से स्टेम कोशिकाओं को विकसित किया है। इसलिए, hESCs के विपरीत, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) परिपक्व दैहिक कोशिकाओं से उत्पन्न किया जा सकता है, नैतिक बाधाओं से परहेज।

Oct4, Sox2, Klf4, और सी Myc: आमतौर पर, IPSCs चार बहिर्जात जीन का वितरण द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। इन कारकों यामानाका मूल lentiviral और रेट्रोवायरल सिस्टम का उपयोग कर दिया जाता है। पहले IPSCs से माउस दैहिक ग प्राप्त किए गएएल 3। बाद में, तकनीक मानव त्वचीय fibroblasts 1,2 करने के लिए लागू किया गया था। बाद के अध्ययन सफलतापूर्वक ऐसी मूत्र 4, रक्त 5,6 के रूप में विभिन्न स्रोतों से उत्पन्न IPSCs, keratinocytes 7, और कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं। हालांकि, वहाँ कुछ दैहिक कोशिकाओं है कि reprogramming में इस्तेमाल नहीं किया गया है, और इस बीमारी से राज्य में विशिष्ट ऊतकों से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के reprogramming क्षमताओं की स्क्रीनिंग कर रहे हैं, अभी भी आवश्यक है।

संधिशोथ (आरए) एक रोग है कि सभी जोड़ों हड़ताल और अन्य अंगों में स्व-प्रतिरक्षित की स्थिति को जन्म दे सकता है। आरए विकसित दुनिया में वयस्कों के बारे में 1% को प्रभावित करता है। यह एक नहीं बल्कि आम बीमारी है और इसकी घटना को हर साल 8 बढ़ जाती है। हालांकि, आरए प्रारंभिक अवस्था में पहचान करने के लिए कठिन है और विनाश oncebone होता है कोई इलाज है कि क्षति को ठीक कर सकता है। इसके अलावा, दवा प्रभावकारिता रोगी से रोगी से अलग है, और यह डॉक्टर की भविष्यवाणी करना मुश्किल हैine कि आवश्यक है। इसलिए, एक दवा स्क्रीनिंग पद्धति के विकास की जरूरत है, और एक सेल सामग्री है कि आरए की स्थिति को प्रतिबिंबित कर सकते हैं की आवश्यकता है।

Fibroblast-तरह Synoviocytes (FLSs) आरए 9,10 के रोगजनन में एक सक्रिय सेलुलर भागीदार हैं। FLSs संयुक्त कैप्सूल और गुहा, जो भी synovium के रूप में जाना जाता है के बीच श्लेष intimal अस्तर में मौजूद हैं। संयुक्त संरचना का समर्थन और आसपास उपास्थि के लिए पोषक तत्वों प्रदान करके, FLSs आम तौर पर संयुक्त समारोह और रखरखाव करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, आरए में FLSs एक आक्रामक phenotype है। आरए FLSs अंततः अनंत प्रसार 10 से आसपास के हड्डी को नष्ट करने के लिए एक कैंसर की तरह phenotype है। इस अनूठी विशेषता के साथ, FLSs एक होनहार सामग्री है कि आरए के pathobiology प्रतिबिंबित कर सकते हैं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। फिर भी, इन कोशिकाओं को शायद ही कभी उत्पादित कर रहे हैं, और सेल phenotypes को बदलने के रूप में कोशिकाओं में इन विट्रो में कई मार्ग के माध्यम से जाना

सैद्धांतिक रूप से, आरए रोगी व्युत्पन्न IPSCs (RA-IPSCs) दवा स्क्रीनिंग और आगे अनुसंधान के लिए एक आदर्श उपकरण बन सकता है। जनित IPSCs आत्म नवीकरण की क्षमता है और बनाए रखा और इन विट्रो में विस्तार किया जा सकता है। Pluripotency के साथ, इन कोशिकाओं को परिपक्व उपास्थिकोशिका और osteocyte प्रजातियों, जो आरए और अन्य हड्डी से संबंधित बीमारियों 11 में विशिष्ट अनुसंधान के लिए सेल सामग्री में योगदान कर सकते हैं भेदभाव किया जा सकता है।

इस अध्ययन में, हम अलग और एक शल्य चिकित्सा द्वारा हटा synovium, और कैसे से FLSs विस्तार यामानाका कारकों युक्त lentiviruses का उपयोग कर FLSs से RA-IPSCs उत्पन्न करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है।

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Protocol

आचार कथन: इस अध्ययन प्रोटोकॉल कोरिया के कैथोलिक विश्वविद्यालय (KC12TISI0861) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. Synoviocyte अलगाव और विस्तार

  1. Synoviocyte अलगाव
    1. शल्य कैंची के दो जोड़े और संदंश की एक जोड़ी जीवाणुरहित।
    2. एक 100 मिमी डिश के लिए श्लेष ऊतक स्थानांतरण और फॉस्फेट बफर खारा के 5 मिलीलीटर (पीबीएस) युक्त 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन से धो लें।
    3. पीले वसा ऊतक और हड्डी के अवशेष काट दिया। 6 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए छंटनी ऊतक स्थानांतरण और Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 20% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ (DMEM) (एफबीएस) के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. कैंची से ऊतकों जल्द तक टुकड़े काफी छोटी एक डिस्पोजेबल पिपेट घुसना करने के लिए कर रहे हैं।
    5. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ऊतक युक्त मीडिया स्थानांतरण। 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए 20% FBS के साथ DMEM के 5 मिलीलीटर जोड़कर शेष सामग्री फसल और फिर ट्यूब को हस्तांतरण। </ Li>
    6. बर्फ पर पिघलना कोलैजिनेज़। 0.01% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए कोलैजिनेज़ जोड़ें और parafilm के साथ ट्यूब सील। 4 घंटे के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में सेते हैं।
    7. ऊष्मायन के बाद, 20% FBS के साथ DMEM के साथ ट्यूब भरने तक कुल मात्रा 10 मिनट के लिए 300 XG पर 50 मिलीलीटर और सेंट्रीफ्यूज, आरटी है।
    8. गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली resuspend करने के लिए मीडिया के 40 मिलीलीटर जोड़ें।
    9. दोहराएँ 1.1.10-1.1.11 कदम।
    10. 20% FBS के साथ DMEM के 25 मिलीलीटर में गोली Resuspend और नीचे करने के लिए सिंक करने के लिए ऊतक के बड़े गुच्छों के लिए प्रतीक्षा करें।
    11. एक 100 मिमी पकवान स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और 14 दिन के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. Synoviocyte रखरखाव और विस्तार
    1. थाली से इस्तेमाल किया मीडिया त्यागें और पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    2. 1 मिलीलीटर पीबीएस / 1 मिमी EDTA जोड़ें और 2 मिनट के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. पकवान धीरे और transfe ठोकरआर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं। 2 मिनट के लिए आरटी 250 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
    4. गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें और 20% FBS के साथ DMEM के 30 मिलीलीटर में गोली resuspend।
    5. 3 x 100 मिमी व्यंजन कोशिकाओं स्थानांतरण किसी भी दृश्य बचे हुए माल छोड़ने के बिना।
    6. ताजा मीडिया हर 3 डी के साथ मीडिया बदलें। 80% confluency 1 मिलीलीटर पीबीएस / 1 मिमी EDTA का उपयोग कोशिकाओं को विभाजित। उपयोग करने से पहले पारित होने के 3 जब तक बनाए रखें। हर विभाजन में 3 बर्तन में कोशिकाओं में से प्रत्येक पकवान फूट डालो।
      नोट: बीतने के 3 तक पहुँचने के बाद, कोशिकाओं है कि तुरंत इस्तेमाल किया जा करने के लिए नहीं जा रहे हैं जमे हुए किया जा सकता है।

2. Reprogramming FLSs lentiviruses एन्कोडिंग यामानाका कारकों का उपयोग

  1. पारगमन (D0)
    1. विकास मीडिया में 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से बीज 3 × 10 4 कोशिकाओं (DMEM के 500 मिलीलीटर 10% FBS और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक)। 5% सीओ में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हे / एन सेते2।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर और फ्रीजर और पिघलना से सी Myc Oct4, Klf4, Sox2: अगले दिन, 4 यामानाका कारकों युक्त lentivirus की एक शीशी निकाल दें। नोट: Lentivirus प्रक्रिया हमारे पिछले अध्ययन 11 में वर्णित द्वारा तैयार की गई थी।
    3. वायरस विगलन, वहीं (DMEM में 20% FBS प्लस एंटीबायोटिक) FLS विकास मीडिया के लिए मीडिया को 10 माइक्रोग्राम / एमएल hexadimethrine ब्रोमाइड और 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड युक्त बदल जाते हैं।
    4. मीडिया बदलने के बाद, कोशिकाओं के लिए lentivirus के 30 μl जोड़ें और धीरे मिश्रण। संक्रमण में सुधार करने के लिए, 680 XG, 30 मिनट के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर थाली अपकेंद्रित्र।
    5. Centrifugation के बाद, 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
  2. Reprogramming तक रखरखाव दिखाई दे रहा है
    1. 3 दिन के लिए, 0.1 मिमी सोडियम butyrate और 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड युक्त FLS विकास मीडिया के साथ दैनिक मीडिया की जगह।
    2. अगले दिन, FLS विकास मीडिया का एक मिश्रण के साथ मीडिया की जगह है औरIPSC मीडिया (1: 1 के अनुपात में) 0.1 मिमी सोडियम butyrate और 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड युक्त।
      नोट: IPSC मीडिया के घटकों सामग्री / उपकरणों की सूची में दी गई है।
  3. कॉलोनी गठन के लिए बंटवारे प्रकोष्ठों
    1. एक vitronectin लेपित 6 अच्छी तरह से थाली तैयार करें।
      1. सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना 6 मिलीलीटर पीबीएस के लिए 60 μl vitronectin जोड़ें। प्रत्येक कुओं में मिश्रण के 2 मिलीलीटर रखो और कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी में सेते हैं। नोट: vitronectin का काम कर रहे एकाग्रता 5 माइक्रोग्राम / एमएल है।
    2. D5 पर, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    3. 1 मिलीलीटर पीबीएस / 1 मिमी EDTA कोशिकाओं को अलग और 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते में जोड़े।
    4. 2 मिनट के लिए आरटी 250 XG पर कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज फसल,।
    5. (9: 3: 1: 6 और 1 1) अलग confluencies प्राप्त करने के लिए 3 अलग अलग अनुपात में कोशिकाओं को विभाजित। सेल गोली और resuspend करने के लिए मीडिया के 900 μl जोड़ें। एक 6 के प्रति अच्छी तरह से सेल मिश्रण के 300, 150, और 100 μl जोड़े9 क्रमश: 3, 1: 6 और 1 अच्छी तरह से थाली 1 के अनुपात को प्राप्त करने के लिए।
    6. जब तक कालोनियों दिखाई मीडिया दैनिक IPSC मीडिया के साथ बदलें। कालोनियों के बारे में D18 बाद दिखाई देगा। नोट: इस स्तर पर, IPSC कालोनियों गैर reprogrammed FLSs के साथ सह अस्तित्व।
  4. कॉलोनी उठा
    1. कुओं के लिए 500 μl vitronectin जोड़कर एक 48 अच्छी तरह से vitronectin लेपित थाली तैयार है, और कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
    2. एक साफ बेंच पर माइक्रोस्कोप प्लेस, और इनक्यूबेटर से 6 अच्छी तरह से थाली हटा।
    3. 48 अच्छी तरह से थाली से vitronectin समाधान निकालें और 500 μl IPSC मीडिया के साथ 10mM रो-जुड़े, कुंडलित-तार युक्त प्रोटीन काइनेज (रॉक) अवरोध पूरक जोड़ें।
    4. एक 10p विंदुक टिप का उपयोग करना, कॉलोनी के आसपास कटौती। 48 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से करने के लिए उठाया कॉलोनी स्थानांतरण।
    5. कई कालोनियों को चुनने के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।
    6. कोशिकाओं को बनाए रखें जब तक कालोनियों बड़ा इनो हैंऊ हस्तांतरण के लिए। नोट: हम आम तौर पर कोशिकाओं गिरा जब कॉलोनी माइक्रोस्कोप के दृश्य क्षेत्र में, जब 100X बढ़ाई देखी से बाहर हो जाता है।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. सेल तैयार
    1. एक बाँझ 18 मिमी कवर गिलास एक 12 अच्छी तरह से थाली में रखें।
    2. पीबीएस के 1 मिलीलीटर शांत और कांच कवर कुल्ला करने के लिए जोड़ें।
    3. एक 10 माइक्रोग्राम / एमएल vitronectin समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें।
    4. कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी पर थाली सेते हैं।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 vitronectin समाधान और vitronectin लेपित 12 अच्छी तरह से थाली और 7 दिनों के लिए संस्कृति में थाली IPSCs त्यागें, दैनिक मीडिया बदल रहा है।
  2. सेल धुंधला
    1. संस्कृति मीडिया त्यागें और एक बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    2. आरटी पर 30 मिनट के लिए 0.4% paraformaldehyde (पीएफए) में कोशिकाओं को ठीक करें।
    3. आरटी पर 5 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ कोशिकाओं Permeabilize।
    4. permeabilization हटायेसमाधान और पीबीएस आरटी पर 30 मिनट के लिए 2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) युक्त के साथ ब्लॉक।
    5. पीबीएस 1 टेबल के अनुसार 2% बीएसए युक्त एंटीबॉडी पतला। आरटी पर 2 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी (पतला 1: 200) जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं, प्रकाश से परहेज।
    7. 1 μl / 10 मिनट के लिए एमएल DAPI के साथ कोशिकाओं को समझो।
    8. antifade अभिकर्मक के साथ स्लाइड कांच के शीर्ष पर कवर कांच की जगह है और 24 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं, प्रकाश से परहेज।
    9. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ अभिव्यक्ति की जाँच करें।

4. वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी पीसीआर)

  1. Guanidinium thiocyanate फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण विधि 11 का उपयोग सेल गोली से mRNA निकालें।
  2. रिवर्स प्रतिलेखन 11 का उपयोग कुल mRNA की 2 माइक्रोग्राम से सीडीएनए बढ़ाना।
  3. पीसीआर के लिए आवश्यक घटक सीडीएनए मंदिर के 2 μl का उपयोग कर मिक्सप्लेट 11।
  4. आरटी पीसीआर प्रदर्शन और जेल वैद्युतकणसंचलन 11 से परिणामों की पुष्टि।

5. alkaline फॉस्फेट (एपी) धुंधला

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 दिनों के लिए संस्कृति IPSCs, पूर्व धुंधला करने के लिए 5% सीओ 2।
  2. मीडिया Aspirate और 1 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के साथ कोशिकाओं को ठीक।
  3. लगानेवाला त्यागें और 1X कुल्ला बफर के साथ कोशिकाओं कुल्ला।
  4. एपी धुंधला के लिए अभिकर्मकों तैयार करें। निम्नलिखित अनुपात में अभिकर्मकों मिक्स: फास्ट लाल वायलेट: naphthol AS-बीआई फॉस्फेट समाधान: पानी = 2: 1: 1।
  5. 15 मिनट के लिए आरटी पर धुंधला समाधान के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, प्रकाश से परहेज।
  6. धुंधला समाधान त्यागें और कुल्ला बफर के साथ कोशिकाओं कुल्ला।
  7. सुखाने को रोकने के लिए और एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अभिव्यक्ति सत्यापित करने के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कवर।

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Representative Results

इस अध्ययन में, हम एक प्रोटोकॉल एक lentiviral प्रणाली का उपयोग कर FLSs से IPSCs उत्पन्न करने का वर्णन है। चित्रा 1 ए FLS अलगाव प्रोटोकॉल का एक सरल योजना से पता चलता है। synovium के सर्जिकल हटाने के बाद, ऊतक शल्य कैंची का उपयोग छोटे टुकड़ों में कटा हुआ था। कोलेजिनेस ऊतक के झुरमुटों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए जोड़ा गया है। प्रकोष्ठों आगे की प्रक्रिया के पहले 14 दिनों के लिए incubated रहे थे। चित्रा 1 बी पृथक FLSs की आकृति विज्ञान से पता चलता है। कोशिकाओं का उपयोग करने से पहले 3 मार्ग के लिए बनाए रखा गया। FLSs सामान्य fibroblasts के साथ इसी तरह की एक विशेषता का हिस्सा है। हमारी पृथक FLSs fibrotic मार्कर, vimentin और fibronectin व्यक्त किया। पृथक आरए FLSs भी बृहतभक्षककोशिका की तरह synoviocyte मार्कर, CD68 (चित्रा 1 सी) की कम अभिव्यक्ति दिखाया।

FLSs काटा और lentiviruses युक्त 4 यम के साथ transduced थेनाका reprogramming के लिए कारकों। विभिन्न अनुपात (D7) पर कोशिकाओं बंटवारे के बाद, छोटी कालोनियों प्रकट करने के लिए शुरू कर दिया। दर्शनीय कालोनियों के रूप में चित्रा 2A में दिखाया गया है, D8-11 पर दिखाई दिया। कालोनियों इस बात से उठाया जा सकता है। चित्रा 2 बी एक उठाया और प्रवर्धित कॉलोनी की एक छवि से पता चलता है।

IPSCs पारित होने के 5-10 तक विस्तार किया गया और उसके बाद विभिन्न assays में इस्तेमाल किया। अविभाजित ESCs एपी के एक उच्च स्तर की विशेषता है। प्रकोष्ठों undifferentiated राज्य पुष्टि करने के लिए एपी के लिए दाग रहे थे। RA-IPSCs एपी (चित्रा -2) व्यक्त की है, यह दर्शाता है कि वे अविभाजित हैं। Pluripotent मार्कर अभिव्यक्ति (चित्रा 2 डी, ई) जांच की गई थी। ऐसे Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28, DPPB5 और TDGF1 के रूप में pluripotent मार्करों की अभिव्यक्ति आरटी पीसीआर (चित्रा 2 डी) का उपयोग कर पुष्टि की गई। Oct3 / 4 की अभिव्यक्ति, Sox2 भी इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक द्वारा पुष्टि की गईऐसे SSEA4, टीआरए-1-60, 1-81 टीआरए और Klf4 के रूप में अतिरिक्त मार्कर के साथ nalysis। टीआरए-1-60, जो वर्तमान में सबसे महत्वपूर्ण IPSC मार्कर माना जाता है, अत्यधिक हमारे उत्पन्न IPSCs में व्यक्त की गई थी।

आगे के विश्लेषण के लिए, हम karyotyping और टेराटोमा परख प्रदर्शन किया। RA-IPSCs 44 + XY (चित्रा 3 ए) के एक सामान्य गुणसूत्र पैटर्न से पता चला है। एस.सी.आई.डी चूहों में RA-IPSCs के 12 सप्ताह के पद इंजेक्शन, teratomas गठन किया है और इस तरह की ग्रंथि, वसा ऊतक और रक्त वाहिकाओं (चित्रा 3 बी) के रूप में विविध ऊतकों, प्रदर्शित किया था। रोगाणु परत भेदभाव भी immunofluorescence धुंधला के माध्यम से इस बात की पुष्टि की गई थी। बाह्य त्वक स्तर वंश कोशिकाओं सकारात्मक Otx2 के लिए दाग रहे थे। Mesodermal कोशिकाओं brachyury व्यक्त की, और एण्डोडर्म SOX17 के सकारात्मक धुंधला द्वारा पुष्टि की गई।

चित्र 2
चित्रा 1: Protocएक आरए रोगी से FLS अलगाव के लिए राजभाषा। (ए) synoviocyte अलगाव के लिए इस्तेमाल किया विधि का एक सरल आरेख। (बी) पृथक FLSs की आकृति विज्ञान। (सी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी FLSs की छवि fibrotic मार्कर vimentin, फ़ाइब्रोनेक्टिन और एक बृहतभक्षककोशिका की तरह synoviocyte मार्कर, CD68 के साथ दाग। सभी स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: FLSs से IPSCs एक आरए रोगी से पृथक की पीढ़ी उठा से पहले एक IPSC कॉलोनी के (ए) उज्ज्वल क्षेत्र छवि।। (बी) के उठा के बाद एक कॉलोनी की छवि। (सी) कालोनी एपी के लिए दाग। (डी) पीसीआर विश्लेषण ओएफ pluripotent मार्करों। (ई) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी IPSCs की छवि। उत्पन्न IPSCs सभी pluripotent मार्कर व्यक्त किया। सभी स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: कुपोषण विश्लेषण और टेराटोमा परख (ए) उच्च संकल्प जी बंधी छवियों IPSCs के सामान्य karyograms दिखा।। छवि एक 46XY सामान्य द्विगुणित पुरुष गुणसूत्र सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) टेराटोमा assays और immunofluorescence धुंधला के परिणाम। सभी स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

IPSCs की खोज से पहले, वैज्ञानिकों मुख्य रूप से इस्तेमाल किया ESCs भेदभाव के माध्यम से स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और अन्य सेल प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए। हालांकि, ESCs एक ब्लास्टोसिस्ट, जो एक प्रारंभिक चरण भ्रूण है की भीतरी द्रव्यमान से उत्पन्न। ESCs को अलग-थलग करने के लिए, ब्लास्टोसिस्ट के विनाश नैतिक मुद्दों पर काबू पाने के लिए असंभव है कि ऊपर उठाने के लिए अपरिहार्य है। इसके अलावा, हालांकि ESCs stemness विशेषताओं और pluripotency है, वे व्यक्तियों से प्राप्त नहीं किया जा सकता है और कभी कभी व्यक्तिगत विश्लेषण और रोग स्क्रीनिंग के लिए एक आदर्श उपकरण नहीं हैं।

2007 में, ताकाहाशी एट अल। मानव fibroblasts 2 से उत्पन्न IPSCs। सैद्धांतिक रूप से, ESCs के विपरीत, IPSCs किसी भी वयस्क दैहिक कोशिकाओं से उत्पन्न किया जा सकता है। इस लाभ के साथ, IPSCs ऑटो कोशिका प्रत्यारोपण के लिए आदर्श उपकरण माना जाता है। इसके अलावा, epigenetic स्मृति की अवधारणा के साथ, IPSCs रोगजनक की स्थिति, यानी के अनुकरण के लिए आदर्श सेल सामग्री माना जाता है। रोग मॉडलिंग। ऐसी बहुत सी रक्त कोशिकाओं, मूत्र कोशिकाओं और अधिक के रूप में कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। फिर भी, वहाँ इस तरह के FLSs के रूप में कई प्रकार की कोशिकाओं, जिसमें reprogramming आयोजित नहीं किया गया हैं।

गठिया रोगों प्रमुख प्रतिरक्षा विकारों कि स्थायी विकलांगता का कारण बन सकती हैं। आरए जोड़ों में जीर्ण सूजन के कारण होता है, अंत में हड्डी और उपास्थि क्षति में resultimg। इसे इलाज या नुकसान रिवर्स करने के लिए विशेष रूप से, क्योंकि उपास्थि विवो में पुनर्जीवित नहीं कर सकता मुश्किल है। इसलिए पुनर्योजी दवा का उपयोग कर IPSCs आरए के इलाज के लिए एक नया महत्वपूर्ण उपकरण है। हड्डी और उपास्थि नुकसान भी पैंनस गठन में हुई है। पैंनस एक सींग की तरह संरचना संयुक्त के histological छवि में देखा जा सकता है। पैंनस FLSs है कि कैंसर कोशिकाओं की तरह limitlessly पैदा द्वारा किया जाता है। इसलिए, यह सोचा है कि FLSs रोग के रोग विशेषताओं को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। इस अध्ययन में, हम मरीज को फ्लोरिडा में इस्तेमाल कियाएस एस IPSCs उत्पन्न करते हैं।

FLSs प्रमुख सेल प्रकार है कि आरए के रोगजनन के लिए योगदान कर रहे हैं। कि ज्यादातर श्लेष संयुक्त अंदर सूजन वातावरण के संपर्क में है एक सेल के रूप में, हमारे समूह सोचा था कि यह एक सामग्री है कि मरीज की बीमारी की हालत को दर्शाता रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए जल्द से जल्द reprogramming पद्धति का उपयोग करके, हम FLSs से RA-विशिष्ट IPSCs उत्पन्न करने का प्रयास किया, 4 यामानाका के वितरण का उपयोग कारकों - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 और सी Myc - lentivirus द्वारा। FLSs हटा synovium से अलग थे। synovium की ट्रिमिंग महत्वपूर्ण है जब FLSs अलग था। अस्थि और वसा के अवशेष इसे और अधिक जटिल शुद्ध FLSs प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं। इसके अलावा, collagenase के उपयोग FLS अलगाव के लिए अपरिहार्य है। यह मार्ग 3-8 के बीच कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। जब FLSs पारित होने के 3 तक पहुँचने, lentiviruses युक्त यामानाका कारक प्रक्रिया हमारे पहले काम 11 में उल्लेख के बाद उत्पन्न कर रहे हैं। उत्पादित lentiviruses का प्रयोग, हम सफलतापूर्वक आरए FLS व्युत्पन्न IPSCs (RA-IPSCs) उत्पन्न। शुद्ध IPSC क्लोन कॉलोनी उठा विधि द्वारा उत्पन्न किया गया। RA-IPSCs सभी pluripotent प्रतिलेखन मार्कर व्यक्त की है और एक सामान्य कुपोषण था। इसके अलावा, RA-IPSCs टेराटोमा परख के अनुसार तीनों जनन परतों में अंतर करने में सक्षम थे। इसके अलावा, हम इस बात की पुष्टि की है कि RA-IPSCs अधिक खनिज पता चला जब इन विट्रो में osteogenic प्रजातियों में भेदभाव (डेटा नहीं दिखाया गया है) 11।

हालांकि, इस विधि के लिए कुछ सीमाएं हैं। Lentiviruses reprogramming के लिए जीनोमिक एकीकरण की आवश्यकता है। KLF -4 और सी Myc ओंकोजीन होते हैं और इन दो कारकों यामानाका विवो में ट्यूमर के विकास को सुविधाजनक बनाने के कर सकते हैं। इसलिए, यह इन कारकों का उपयोग करने के लिए नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए सामग्री उत्पन्न करने के लिए आदर्श नहीं हो सकता। इसके अलावा, FLSs और त्वचा fibroblasts क्लीनिक में प्राप्त करने के लिए मुश्किल नहीं कर रहे हैं। विभिन्न रिपोर्टों, त्वचा fibroblasts में उल्लेख किया है (यानी वास्त्विकएल fibroblasts) केवल पंच बायोप्सी से प्राप्त किया जा सकता है। FLSs एक इनवेसिव शल्य प्रक्रिया द्वारा ही अलग किया जा सकता है और इस सर्जरी गंभीर हाइपरप्लासिया जो घुटने की सर्जरी आया है के साथ रोगियों पर किया जाता है। इसलिए, जब एक गैर-आरए IPSC reprogramming FLSs का उपयोग करने की कोई जरूरत नहीं है। इसके अतिरिक्त, प्रक्रिया है जिसके द्वारा fibroblasts reprogramming के लिए तैयार किया जाता है कठिन और समय लेने वाली है। FLSs त्वचा fibroblasts के रूप में ही कमियों का हिस्सा है। इसलिए, सेल के सूत्रों है कि संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं और प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं।

इस कारण से, शोधकर्ताओं ने एक वैकल्पिक सेल स्रोत के लिए खोज करने के लिए शुरू कर दिया है। एक वर्तमान में प्रयुक्त सामग्री रक्त कोशिकाओं है। यह रक्त आकर्षित करने के लिए आसान है और अलगाव की प्रक्रिया अपेक्षाकृत सरल और तेज है। इसके अलावा, वहाँ उपकरण, ऐसे सेंडाइ वायरल प्रणाली, छोटे अणुओं, और episomal plasmids के रूप में है कि जीनोम एकीकरण की आवश्यकता नहीं करने के लिए lentiviruses के उपयोग से एक बदलाव है।

FLSs के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता हैविविध व्यक्तियों के लिए एक सामग्री, यह अभी भी एक महान सामग्री जब अनुसंधान प्रयोजनों के लिए RA-IPSCs पैदा कर रहा है। भविष्य में, हम एक आरए रोगी FLS व्युत्पन्न IPSC बैंक उत्पन्न करने के लिए देख रहे हैं। आरए रोगियों को व्यक्तिगत रूप से दवाओं है कि इलाज के लिए उपयोग किया जाता है के लिए विविध प्रतिक्रियाओं दिखा। आरए IPSCs की कई लाइनों के साथ, हम आरए रोगियों के लिए एक दवा स्क्रीनिंग सेल बैंक उत्पन्न करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं। प्रत्येक कोशिका लाइन पर सभी दवाओं स्क्रीनिंग करके, हम भविष्यवाणी करने के लिए जो दवा है जो व्यक्ति रोगी पर काम करेंगे सक्षम हो सकता है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल संधिवातीयशास्त्र को IPSC प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल के साथ, IPSCs आरए रोगी व्युत्पन्न FLSs से उत्पन्न हो सकता है, और उत्पन्न IPSCs आवश्यक विशेषताओं है। ये IPSCs क्लीनिकल रिसर्च, दवा स्क्रीनिंग, रोग मॉडलिंग, और आरए के जीव विज्ञान की आगे की जांच के लिए पुनर्योजी चिकित्सा में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Dish TPP 93100
6-well Plate TPP 92006
50 ml Cornical Tube SPL 50050
15 mlL Cornical Tube SPL 50015
10 ml Disposable Pipette Falcon 7551
5 ml Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS Life Technologies 14190-144
DMEM Life Technologies 11995-073
Penicilin Streptomycin Sigma Aldrich P4333
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044
Collagenase Sigma Aldrich C6885-100MG
Parafilm Sigma Aldrich 54956
PBS/1 mM EDTA Life Technologies 12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM Life Technologies 11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148
Polybrene Chemicon TR-1003-G
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044
DPBS Life Technologies 14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES Life Technologies 11330-057 iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080-094 iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite Sigma Aldrich S5261 iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin Sigma Aldrich T3705 iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2 Peprotech 100-18B iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin Life Technologies 12585-014 iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A8960 iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene Chemicon TR-1003
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA) Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA) Vector Lab SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10x TBE Buffer Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004

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References

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  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  5. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
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  9. Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
  10. Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
  11. Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).

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विकास जीवविज्ञान अंक 116 प्रेरित pluripotent स्टेम सेल संधिशोथ fibroblast-तरह synoviocyte lentivirus कोशिका जीव विज्ञान reprogramming फीडर मुफ्त स्टेम
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Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J. Vis. Exp. (116), e54072, doi:10.3791/54072 (2016).

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