Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

בגישה חדשנית עבור הקלטה בו זמנית של פעילות העצבים הסימפתטית כליות, לחץ דם עם עירוי תוך ורידי, בהכרה, עכברים ערככם.

Published: February 14, 2018 doi: 10.3791/54120
Automatic Translation
1, 2
1Department of Pediatrics, University of Alberta, 2Department of Physiology & Biophysics, University of Mississippi Medical Center, 3Mississippi Center for Obesity Research

Summary

עכברים ומורדמת התערוכה-פיזיולוגיים לחץ דם סיסטמי, שמונע את הערכה משמעותי של הטון האוטונומית נתון את הקשר האינטימי בין לחץ הדם ואת מערכת העצבים האוטונומית. לפיכך, התווה שיטה פעילות במקביל להקליט העצבים הסימפתטית כליות, לחץ דם עם עירוי תוך ורידי בעכברים בהכרה.

Abstract

העצבים הסימפתטית כליות לתרום באופן משמעותי תופעות פיזיולוגיות וגם pathophysiological. הערכת פעילות העצבים הסימפתטית כליות (RSNA) הוא עניין רב בתחומים רבים של מחקר כגון מחלת כליות כרונית, לחץ דם, אי ספיקת לב, סוכרת והשמנה. הערכת חד-משמעית של התפקיד של מערכת העצבים הסימפתטית הכרחי ובכך לפרשנות הראויה תוצאות ניסויית והבנה של תהליכי מחלה. RSNA היה נמדד באופן מסורתי בחולדות מרדימים, לרבות עכברים. עם זאת, עכברים בדרך כלל התערוכה לחץ דם סיסטמי מאוד נמוך וחוסר יציבות והמודינמיקה למשך מספר שעות במהלך הרדמה וניתוח. משמעות הפרשנות RSNA הוא מבולבל על ידי המדינה-פיזיולוגיים, בהתחשב הקשר האינטימי בין בטון עצבני סימפטי מצב הלב וכלי הדם. כדי לטפל מגבלה זו של הגישות המסורתיות, פיתחנו שיטה חדשה למדידת RSNA בעכברים בהכרה, לנוע בחופשיות. עכברים היו כרוניים שעברו אינסטרומנטציה עם רדיו-telemeters עבור ניטור רציף של לחץ דם וכן קטטר עירוי ורידי צוואר ו אלקטרודה דו-קוטבי שעוצב עבור הקלטה ישירה של RSNA. לאחר תקופת החלמה של 48-72 שעות, שיעור ההישרדות היה 100%, כל העכברים התנהגו כרגיל. בשלב זה הזמן-, תצורתן של RSNA הוקלט בהצלחה ב- 80% של עכברים, עם אותות קיימא רכשה עד 4 ו- 5 ימים לאחר הניתוח 70% ו- 50% של עכברים, בהתאמה. לחץ דם פיזיולוגיים נרשמו בעכברים כל (מ מ כספית 116±2; n = 10). RSNA מוקלטות גדל עם אכילת וטיפוח, כמו ומבוססת בספרות. יתר על כן, RSNA אומתה על ידי המצור ganglionic ו אפנון של לחץ דם עם סוכנים תרופתי. במסמך זה, מתוארת שיטה לניהול ויעילים עבור הקלטה ברורה של RSNA בעכברים בהכרה, לנוע בחופשיות.

Introduction

עניין שימוש בעכברים במספר תחומים של המחקר הביו-רפואי ממשיכה להתרחב עם הפיתוח של אינספור מודלים מהונדס גנטית. ברוב המקרים, ההתקדמות הטכנית לשמור בקצב עם שימוש מוגבר של עכברים בפיזיולוגיה, ויש עכשיו מבחר מרשים של התקנים ולמחקר שפותחה במיוחד עבור מדידת פרמטרים פיזיולוגיים חשובים בעכברים. למרות telemetric מכשירי מדידה של אוטונומי ישיר בטון עצבני בחולדה בהכרה היו זמינים עבור למעלה מעשור, התקנים ולמחקר להערכת פעילות העצבים בעכברים בהכרה אינם כיום זמינים. החוקרים בדרך כלל לעקוף מגבלה זו על-ידי הערכת התרומה של מערכת העצבים האוטונומית עם שיטות עקיפות (דהיינו פלזמה או שתן catecholamines, המצור תרופתי אוטונומי, ניתוח ספקטרלי של דפוסים של דם לחץ/דופק)1.

בעוד גישות אלה מספקים מידע רב ערך, התוצאה היא תמונה גלובלית של הטון הכללית אוטונומי, במקום לחשוף את התרומה דיסקרטית של אוכלוסיות מבודדות של העצבים לתופעה תחת חקירה. לחלופין, הקלטה ישירה של פעילות מתוך עצבים ספציפיים בוצע בעכברים מרדימים, אשר מהווה המון חששות. . זה קשה מאוד לשמור על לחץ הדם יציב בטווח פיזיולוגיים עכבר anesthetized עבור מספר שעות לאחר הניתוח. למעשה, אלו סוגים של ניסויים, לחץ דם לעיתים קרובות בלתי מדווחות או הציג ברמות נמוכות מאוד (קרי 60-80 מ מ כספית לעומת > 100mmHg ב עכבר בהכרה)2. השבריריות של מערכת הלב וכלי הדם באורה של העכבר ומורדמת הכנה לעתים קרובות מונע הערכת משמעותי של הפעילות במערכת העצבים הרצונית, נתן את תלות בין לחץ הדם בטון סימפטי3, 4.

כדי לטפל מגבלה זו, שיטה חדשה עבור הקלטה ישירה של פעילות העצבים הסימפתטית כליות (RSNA) בהכרה, פותחה ערככם עכברים, ללא הפרעה בתוך הכלובים הביתה. הן הגישה הכירורגית ו ניסיוני עבור יישום מוצלח של טכניקה זו מתוארת בפירוט. הכנה זו מאפשרת לחוקר ובו-זמנית להקליט לחץ הדם בעורק ויה radiotelemetry בנוסף RSNA, בעזרת היכולת הוסיף לווריד להחדיר סוכנים עניין מבלי להפריע את העכבר.

עשרים וארבע שעות לאחר הניתוח, עכברים מתנהגים בצורה נורמלית, לא מפגינים סימנים של כאב או מצוקה. הקלטות ניסיוני ואז אולי להתחיל 48 עד 72 שעות לאחר הניתוח בעוד העכבר נח בנוחות בכלוב בבית שלה עם גישה בלתי מוגבלת אוכל ומים, העשרה סביבתית. נקה עקבות RSNA מוצגים, התגובות האופייניות של אוכלוסייה זו חוצפה לתנועות גופניות נורמלי של החיה (כגון אכילה וטיפוח) מודגמות בנוסף אפנון תרופתי בלחץ דם מערכתית. איכות וספציפיות של האות RSNA תאומת רחוק על-ידי המצור ganglionic. כתב יד זה כולל את המשלים אורקולי את תיאור שפורסם בתחילה של טכניקה זו5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני הינם בהתאם מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה והמרכז הרפואי של אוניברסיטת מיסיסיפי.

1. בעלי חיים ודיור

  1. הבית עכברים (24-35 גר') עם ההגעה במתקן חיות מעבדה מוסדיים.
  2. מציעים עכברים תקן האוכל מכרסמים, מי ברז ad libitum בשלבים השונים של פרוטוקול נסיוני בסביבה מבוקרת טמפרטורה ולחות.

2. אישית פבריקציה נוספת של האלקטרודה RSNA מושתלת

הערה: לבנות האלקטרודה RSNA מושתלת לפחות כמה ימים לפני הליך כירורגי מתוזמנת כדי להכיל את זמן אשפרה, סטריליזציה (יפורט בהמשך).

  1. חותכים שלושה שווים באורכם של פלדת אל-חלד מבודד גדילי מרובים חוט, 250 מ מ (קוטר חוט חשוף 0.0254 מ"מ, 0.14 מ"מ מצופה). להשתמש באזמל להב (רצוי #11) להתפשט כ- 15 מ מ של חומר בידוד ולחשוף את המתכת הבסיסית מקצה אחד של כל האורכים של חוט.
    1. הלחמה יחידה פין זכר מחבר (פליז עם ציפוי זהב) לסוף חשופות רק שני החוטים כדי ליצור הפניות אלקטרודה הפרעה דו קוטבית (איור 1 א'). להשאיר לסוף האורך השלישי של חוט חשוף. זה יפעל כמבצע הקרקע.
    2. להחליק קצר (~2.0 - 2.5 ס מ) פיסת 1.6 מ מ קוטר לכווץ אבובים על פינים מחבר ועל חוט לכסות לגמרי את המפרק מולחם לאחרונה בין המחבר תיל וסיכה.
      הערה: קצה המחבר pin זה להיות פקוק לתוך headstage מגבר חייבת להישאר חשוף.
    3. החזק את החוט מעל אקדח חום עם זוג פלייר קטן או ועוצרי דימום לכווץ את הצנרור רגיש לחום, חשמלית לבודד את הקשר בין המחבר pin את החוט. חזור על המחבר השני חוט של חשבונך.
  2. לחתוך באורך 200 מ מ של צינורות פוליאתילן (PE 90; הקוטר הפנימי 0.86 מ מ, הקוטר החיצוני 1.27 מ מ). לקבץ את החוטים שלוש (שניים מוביל + קרקע חוט), להציג את הקצוות שלא נגעו לתוך צינורות PE 90, להשחיל אותם יחד דרך לקצה הפתוח של הצנרת (איור 1B).
    הערה: ה-90 PE צינורות פונקציות כמו נדן לקבץ ולהגן על האלקטרודה מוביל ולקרקע תיל.
    1. לזהות את החוט הקרקע, מושך אותו מהנרתיק PE 90 קצת יותר רחוק כדי להבדילה ללידים אלקטרודה הפרעה דו קוטבית.

3. בנייה של קצה האלקטרודה

  1. דמיינו את קצות החוטים אלקטרודה לא נגעה עם מיקרוסקופ ויבתר. החוט הקצוות שלושה של האלקטרודה דרך 5 מ מפיסה מוארכת של צינורות פוליאתילן קטנים יותר (PE 10, הקוטר הפנימי 0.28 מ מ, הקוטר החיצוני 0.61 מ"מ) לקשור את החוטים אלקטרודה ביחד.
    1. שרשור פיסת זה צינורות PE 10 אל החוטים אלקטרודה 3 1.5 מ מ. מראש זה אבובים לנוח 2.0 מ מ מן היצירה הראשונית 5 מ מ של PE 10.
    2. שרשור חתיכה 1.5 מ מ השני של צינורות PE 10 אל קצות ללידים אלקטרודה דו קוטבי שני מכסים לבודד את הטיפים ולהפריד ביניהם מן החוט הקרקע (איור 1C).
  2. לקצץ בכל אורך עודפי החוטים עם מספריים.
  3. הדבק יצירות בודדות של צינורות PE 10 לרדיו אלקטרודה עם טיפה קטנה של דבק נוזלי cyanoacrylate נוסחה. הצב מחט מד 25 קהות על קצה הצינור בדבק כדי לשפר שליטה הישפכות.
    1. מקם את מחט בצומת בין PE 10 דוקרני, אז לוותר על טיפה קטנה של דבק והמחש דבק ציפוי הפנימי של הצנרת PE.
    2. לאפשר הדבק לרפא לחלוטין למשך הלילה.

4. בסדר הכנה של קצה האלקטרודה הקלטה

  1. רצועת ציפוי בידוד העצות אלקטרודה הפרעה דו קוטבית, קצה החוט הקרקע עם להב #11 ומהדקים. לא להפריע או לפגום הבסיסית חוטים נטושים מרובים כמו זה ישפיע על איכות האות RSNA.
  2. גריפ האלקטרודה נבנה בין 5.0 מ מ 1.5 מ מ PE 10 עוגנים עם מעוקל מלקחיים ולכופף את החוטים כדי ליצור זווית 90 מעלות (איור 1D).
    הערה: זה תמרון צריכים למקם את ההפניות אלקטרודה דו-קוטבי מעל הכבל הקרקע, במצב אופטימלי על ערש את הצרור עצב.

5. בניית המעמד עגינת

  1. לבנות הדום לייצב את האלקטרודה מוביל באזור השכמה באמצע של העכבר על כיציאה מתוך הגוף על ידי חיתוך חתיכה 3 ס מ של צינורות פוליאתילן (הקוטר הפנימי 2.70 מ מ, קוטר חיצוני מ מ 4.00).
    1. לאחוז את הצנרור עם מלקחיים, להמיס קצה אחד על אקדח חום. לחץ על הקצה מחוממת של אבובים מאונך משטח מתכת קריר ליצירת רכס מעוגל או "flange".
    2. לשרשר את המעמד הזה אל האלקטרודה נבנה, כך והסתיר מצביע לכיוון קצה האלקטרודה.
      הערה: השילוב של PE 90 נדן, הדום יגנו את ההפניות אלקטרודה אוזני פעם מהחיה.

6. עיקור של האלקטרודה מושתלת שהושלמו

  1. חבילת האלקטרודה שהושלמו בנפרד על עיקור תיקים, האוזון לחטא (TSO3) לפני ההשתלה.
    הערה: התייעץ עם מתקן עיקור החולים המקומי לגבי סוג מסוים של עיקור התיק ואת הליך עוד זה שונה בין מוסדות.

7. לקראת ניתוח והרדמה

  1. לנהל נגד כאבים 20 דקות לפני תחילת הניתוח (meloxicam 2 מ"ג/ק"ג, ספורטינג). מקם את העכבר תא אינדוקציה רווי חמצן 100% יש לזה סיווג רפואי. כוונן הגדרות מכשיר אידוי כדי להגדיל את האחוז של איזופלוריין הרדמה, במרווחים של 0.5 עד לרמה של 4%. להעריך את המטוס כירורגי על-ידי הערכת תגובת רפלקס לחץ עדין אצבעות הרגליים או רפידות הרגל של הפורה, בגפיים האחוריות וכן האטה של קצב נשימה.
    1. להעביר את החיה שולחן הניתוחים ולתחזק הרדמה עם 1.5-2% איזופלוריין ויה nosecone ברגע שזה הגיע המטוס כירורגי ומוצגים כבר לא את רפלקס הבוהן-קורט. חזור על התגובה הבוהן-קמצוץ מעת לעת, להעריך את קצב נשימה לאורך כל תהליך כירורגי. להחיל משחה אופטלמולוגיות עיניים למניעת יובש.
    2. לשמור על טמפרטורת גוף נורמלית של החיה בכל עת עם רפידות ג'ל מלא חום איזותרמי, שולחן הניתוחים המתאימים. לאחסן רפידות איזותרמי באמבט מים 37° C, להחליף רפידות לעתים קרובות לפי הצורך במהלך הניתוח כדי לשמור על טמפרטורת הגוף פיזיולוגיים.
    3. ניהול glycopyrrolate (50-70 µg/kg, subcutaneously (ש)) כדי למנוע ייצור יתר של דרכי הנשימה הפרשות מיד עם אינדוקציה של הרדמה. לנהל את המינון של glycopyrrolate בפעם השנייה אל נקודת האמצע של הליך כירורגי (שלב 9.1).
    4. לנהל את כל הניתוחים בתנאים אספטי. ודא שכל כלי ניתוח היה בלוק לפני הניתוח מתוזמנת. לנקות את השדה הכירורגי כמפורט להלן (7.2.1) ולשמור על עקרות לאורך כל ההליך.
      1. לובשים מסיכת פנים, בלוק בידוד חלוק וכפפות חד-פעמיים, סטרילי. לנקות את כל הציוד גדולים כגון מנורה מתכווננת, לנתח שולחן הניתוחים עם אתנול 70% והיקף. מעת לעת במהלך ההליך, להחיל 70% אתנול כפפות כירורגי כדי להבטיח עקרות.
  2. להסיר שיער מן האגף השמאלי של החיה, באזור הצוואר הגחון הגבי האזור midscapular עם קוצץ שיער בעלי חיים קטנים ואחריו קרם depilatory (נוסחת לעור רגיש).
    1. לנקות את העור שני שדות כירורגי אלה עם 3 לסירוגין יישומים של פתרון טיהור כירורגי (10% Povidone יוד) ו-70% אתנול. הכינו את השדה כירורגית עם יישום הסופי של הפתרון ניקוי כירורגי.

8. ניתוח ההשתלה של האלקטרודה RSNA

  1. מיקום העכבר בצד ימין שלה עם תום rostral הצבעה לשמאל של המנתח, לחשוף את האגף השמאלי של החיה. עושים חתך 5 מ מ בעור של האזור midscapular עם איזמל (11).
    הערה: זהו האתר שבו אוזני ללידים אלקטרודה RSNA.
    1. עושים חתך השני (< 20 מ מ) של העור המכסים את האגף השמאלי, בניצב עמוד השדרה ואת 2 מ מ סימטרית כדי קשת הצלעות. המנהרה מחט נירוסטה 13G subcutaneously מן החתך כדי החתך באתר יציאה הגבי.
      הערה: קובץ את קצוות חדים של המחט לעזוב חלקה, ללא חיתוך קצה.
    2. עוברים המחט 13G האלקטרודה RSNA מושתלת סטיריליים (שלבים 2 - 6). . תחזיר את המחט 13G להשאיר את הטיפ אלקטרודה שוכב על שריר הבטן של האגף השמאלי להשאיר קטע ההפניות אלקטרודה שוכב מתחת לעור, ולהשאיר את אורך הנותרים העולה מן החתך הגבי.
  2. מקם את הטיפ אלקטרודה לצד. לעשות חתך בשריר הבטן ישירות שבבסיס החתך בעור שנעשה 8.1.1. הפרד את השומן ורקמות לאורך השריר האחורי באמצעות applicators שקצהו כותנה קטן כדי לחשוף את הכליה השמאלית.
    1. פתח את השדה כירורגית עם מיקרו-רטרקטורים ומשכו את הכליה. לא למתוח את הצרור נוירו-וסקולריים כליות, אשר העצבים כליות נזק בלתי הפיך, למנוע הקלטות של אות RSNA קיימא.
      הערה: יכול להיות מיושן פלדה מיקרו-רטרקטורים מהדק נייר רגיל, באורך של 4-0 משי. ודא שרטרקטורים אלה גם סטריליים עם מכשירי הניתוח על מנת לשמר את הטכניקה aseptic.
  3. דמיינו את הצרור כליות נוירו-וסקולריים בעזרת כוח גבוהה לנתח מיקרוסקופ. לזהות את הצרור עצב כליות, אשר בדרך כלל (אך לא תמיד) פועל לצד עורק הכליות ואת הווריד. לנתח את הצרור העצבים מן הרקמות הסובבות עם מלקחיים בסדר, ישר.
    הערה: הצרור עצב כליות יופיע אטום, עם "כמו חבל" רעיוני מראה ייחודי לעומת כלי הלימפה, אשר מופיעים ברורה.
    1. לתפעל את הצרור עצב מעט ככל האפשר. לא לגעת, למתוח או לאסוף את הצרור עצב בכל עת. לא לא לשבש את כלי הדם בסדר ויישם את האומץ או את צינור הלימפה כליות כי זה לסכן את הכדאיות של העצב ולייצר הלימפה רציפה באגירת נוזלים סביב העצב/האלקטרודה, לעכב או להשמיד לחלוטין את האות העצבי.
    2. עזוב הצרור עצב כליות ללא פגע, אשר יסייעו לשמר את הכדאיות לטווח הארוך של העצב, כמו גם לשמור על קשר יציב בין העצב האלקטרודה (קרי בעצב משרטוטי עלול להחליק ממני אלקטרודות עם הזמן ותנועות גוף טבעי).
  4. להציג את הטיפ אלקטרודה RSNA לתוך הבטן. התאם את מיקומו כך החוט עצה ועל קרקעי אלקטרודה דו-קוטבי ניצבים על הצרור כליות נוירו-וסקולריים. להתאים את המיקום של האלקטרודה כך החוט הקרקע יש קשר טוב עם שבבסיס הרקמות, האלקטרודה לא לדחוס את כלי הדם כליות, להתפשר על כליות זרימת הדם (איור 1D).
  5. הרם את הצרור עצב כליות עם מלקחיים בזווית. להחליק את הטיפ אלקטרודה מתחת העצב, עוזב את העצב במגע ישיר עם שני חוטים.
    1. להחליק חתיכה קטנה של פרפין הסרט בין החוטים עצב/ביפולר החוט (הקרקע) השלישי (איור 1D).
      הערה: להשרות לעקר את הסרט פרפין אתנול 70% במשך 24 שעות ולאחר מכן לשטוף בתוך תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית לפני ההשתלה.
    2. להסיר דם או נוזלים האלקטרודה/העצב עם ספיגה קטן ספירס כמו נוזלים סביב העצב או חוטים אלקטרודה יהיה לעכב או לכבות את האות העצבי.
    3. לבדוק את איכות האות RSNA במהירות במידת הצורך (התקנה המתוארים להלן).
      הערה: זה חייב להתבצע במהירות כמו חשיפה לאוויר יבש העצב ולסכן את יכולת הקיום שלה.
    4. אלסטומר שני סיליקון חלות על יחידת עצב/אלקטרודה, להבטיח כי הבריכות סיליקון מתחת וליד העצב לספק בידוד חשמלי מלא (כלומר לא פשוט טיפה מעל העצב).
      הערה: ודא שהטיפים אלקטרודה הם גם מצופה שהסיליקון. החוט הקרקע צריכה להישאר במגע עם הרקמה הבסיסית, ובכך elastomer אינו צריך בריכה מתחת החוט הזה. המנע ממריחת כמות אלסטומר סיליקון, שלא לצורך גדול כמו זה שעלולים לטרפד את זרימת הדם כליות, או להפוך רופף בתנועות גוף טבעי עם הזמן.
    5. אפשר 1-2 דקות אלסטומר סיליקון לרפא לחלוטין, ואז בזהירות להרים את הקצוות החיצוניים של שהסיליקון "גוש" עם מלקחיים ולהחיל כמות קטנה של דבק כירורגי נוסחה נוזלי.
      הערה: לטפל לא כדי להחיל כמות מוגזמת של דבק הזה, כפי שהוא עשוי לפגום מחזור או להתפשט האומץ לסכן את יכולת הקיום שלה.
  6. סגירת החתך בבטן עם התפרים מקוטע, שנספג (5-0). סגור צמוד העור באופן דומה עם תפר באותו החומר.

9. ההשתלה של לחץ דם Radiotelemeter

  1. למקם מחדש את העכבר על גבו, עם תום rostral מופנות לכיוון המנתח. התאם הרדמה nosecone לפי הצורך. לנהל את. מנה שנייה של glycopyrrolate בשלב זה (ראה 7.1.3).
  2. עושים קו האמצע חתך בעור של אזור הצוואר עם איזמל (#11), החל מתחת לסת תחתונה של החיה והארכת מעל קשת הצלעות. הפרד בין רקמת בלוטות לחשוף את שרירי הצוואר המשמשות כבסיס. לחשוף את עורק תרדמני השמאלי, להפריד בין הרקמות הסובבות.
    הערה: שמור על עצמך שלא יגרמו נזק התועה משום שזה יכול לגרום תמותה מוגברת לאחר ניתוח.
    1. לעבור שלוש חתיכות של 6-0 חומר תפרים משי מתחת העורק. למקם תפר אחד עד rostrally ככל האפשר, תקשור את זה כדי occlude את כלי הקיבול. הצב של מידוויי התפר השני לאורכו של כלי השיט, לקשור באופן רופף. מקם את התפר האחרון הקליפה ככל האפשר, לקשור באופן רופף.
    2. . משכי את התפר rostral ביותר ולאבטח את nosecone עם חתיכה קטנה של משתובב. משכי את התפר סימטרית ביותר עם מלקחיים מיקרו-יתושים כדי להגביל את זרימת הדם בתוך הכלי.
    3. עושים חתך קטן בדופן כלי במספריים אביבי נאה rostrally ככל האפשר. מציגים את הצנתר radiotelemeter העכבר לחץ הדם לתוך כלי הקיבול להתקדם התפר סימטרית.
      1. לקשור את התפר באמצע כדי לייצב את הצנתר באופן זמני, לשחרר את התנצלות סימטרית ולקדם את הקטטר 10 מ"מ. העניבה התפר סביב קטטר לאבטח במקום.
    4. המנהרה מד מרחק לגוף כיס תת עורית לאורך באגף הימני.

10. ההשתלה, כיציאה מתוך הגוף של הקטטר ורידי צוואר

  1. להשתמש applicators שקצהו כותנה קטן כדי לחשוף ומוחלף על נכון. להעביר שתי פיסות חומר תפרים משי 6-0 כלי הקיבול.
    1. הצב בתפר אחד עד rostrally ככל האפשר, עניבה כדי occlude את כלי הקיבול. מקם את התפר השני הקליפה ככל האפשר ומשכו בעדינות כדי לעצור את זרימת הדם בתוך הכלי.
    2. להשתמש במספריים אביבי נאה לעשות חתך קטן בדופן הכלי הכי קרוב התפר rostral ככל האפשר. Catheterize את הווריד עם אבובים נמתח-חום (יתר מ מ 1.02, נמתח יתר 0.64 מ מ), אשר קדם מלא עם תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית.
      הערה: ודא שקצה הצנתר נחתך עם איזמל לייצר שיקוע מעוגלות למניעת כלי מחורר. לקבוע את כמות הנוזלים הקטטר (שטח מת) לעיון (ראה שלבים 14.4-14.6 להלן).
      1. לקדם הקטטר ~ 8 מ מ לווריד. מאובטחים הצנתר על ידי קשירת התפרים משי סביב כלי השיט קטטר, וכן יישום של טיפה קטנה של דבק ג'ל cyanoacrylate נוסחה.
  2. הנח את העכבר בצד שמאל שלו. המנהרה הקטטר תוך ורידי מן הצוואר יציאה ב האזור הגבי midscapular באמצעות מחט נירוסטה 13G.
  3. למקם מחדש את העכבר על גבו. סגור את הצוואר החתך בתפרים מקוטע.
  4. מקם את החיה במצב שכיבה. שרשור כפתור תת-עורי קטן על הצנתר ורידים. אבטח את לחצן מתחת לעור עם תפרים. החוט המעיין מפלדת המתאימים על הצנתר ורידים ואבטח אותו על הלחצן העור כדי להגן על הצנתר.

11. אבטחת אלקטרודה יהיו Exteriorized מוביל

  1. לאבטח הדום פוליאתילן מגן שהאלקטרודה שמוביל השריר שמתחת עם דבק רקמות. תפר צמוד העור מעל-והסתיר לקבלת תמיכה.

12. ההחלמה שלאחר הניתוח

  1. אנטיביוטית חלות על כל החתכים.
  2. מחלקים תרופות להרגעה. מחלקים נוספים מינונים של תרופות להרגעה לפי הצורך במהלך תקופת ההחלמה, אם החיה מראה סימנים של כאב או מצוקה.
  3. הנח את העכבר בכלוב מטבולי מרופדת עם שבב עץ מצעים ומגבת נייר כדי לשחזר. ללא הרף לנטר את החיה, לא להשאיר אותו ללא השגחה עד שהיא תשוב להכרה יכול לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. מציגים העשרה סביבתית. ומזון ומים (ad libitum) בשלב זה.
  4. סליל אלקטרודה מוביל מחוץ לכלוב עד הזמן של הניסוי.
  5. הצב את הכלוב מעל משטח חום חם במשך 24 השעות הראשונות של התאוששות. לחבר האביב פלדת אל-חלד, קטטר תוך ורידי מערכת המסתובב/אינפוזיה עבור תקינות של תמיסת מלח פיזיולוגית במהלך תקופת ההחלמה (0.5 מ"ל לשעה).
  6. להבטיח שבעל החיים נשאר ביחידים שוכן בתוך כלוב ייעודי בשל אופיו של הקטטר יהיו exteriorized ומוביל אלקטרודה.

13. ניסיוני ההתקנה עבור ההקלטה לחץ הדם ואת RSNA

  1. לצייד טבלה רטט נגד העליון פלדת אל-חלד עם כלוב פאראדיי פשוטה.
    הערה: ניתן לבנות כלוב פאראדיי הזה עם רשת מסך מסגרת, אלומיניום עץ. חשמלית הקרקע הכלוב טבלה/פאראדיי לחסל כל רעש חשמלי.
  2. מקום מקלט radiotelemetry לחץ דם בתוך הכלוב פאראדיי.
  3. לחבר את המקלט radiotelemetry המתאם פלט לחץ המשויך. לחבר מתאם זה מערכת רכישת נתונים ללחץ דם רשומה באינטרנט.
  4. הלחמה שני מחברים pin נקבה כי הם ללא תשלום למחברים פין זכר אלקטרודה (פליז עם ציפוי זהב) בקצוות של PVC ששויך, חדרנו ומבודדים כבל. הלחמה את קצוות נגדיים של הכבלים לזווג את אטמי בננה. להתחבר השתלים בננה headstage preamplification (הגברה X 10).
  5. להתחבר זה מגבר קדם מגבר דיפרנציאלי. להתאים את ההגדרות כדי להגביר את האות העצבי x10, 000. התאמת הגדרות המסנן כדלקמן: מחשוף, 100 הרץ; גבוהה לחתוך, 1000 הרץ.
  6. למקם את הכלוב הביתה המכילה את העכבר אל המקלט radiotelemetry ממוקם בתוך כלוב פאראדיי 48 עד 72 שעות לאחר הניתוח. הפעל את המכשיר radiotelemetry להקליט אותות לחץ דם.
    הערה: הסתגלות העכבר על-ידי הצבת את הכלוב הביתה בכיוונון במהלך שבוע אחד לפני הניתוח הוא אופטימלי.
  7. Uncoil את ההפניות אלקטרודה, חבר את מחברי ה-pin של האלקטרודה דו-קוטבי למחברים המתאימים pin נקבה שתוארו לעיל (13.4) כדי להתחיל בהקלטת RSNA.
  8. להציג, ובו-זמנית להקליט אותות לחץ דם באינטרנט במחשב, תוך החדרת תמיסת מלח פיזיולוגית או פתרון מעניין. נתוני הרשומה בשיעור מזערי של 2500 דגימות לשניה.

14. לטעום נסיוני ובדיקת RSNA אות

  1. ודא עכברים הינם נוחים בכלוב שלהם הביתה, ערככם עם גישה חופשית מזון ומים. בצע את הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים אימות נורמלי המראה וההתנהגות.
  2. בית העכברים אותה טמפרטורה ובחדר לחות הנשלט אשר RSNA הקלטה יתקיים. ודא עירוי תוך ורידי ממשיך כמתואר לעיל.
  3. אפשר לפחות 30 דקות של ייצוב ברגע החיה ממוקם בכיוונון הקלטה שתוארו לעיל לפני הקלטת שעה אחת של לחץ דם בסיסית ונתונים RSNA. ודא שהחיה נחה בשקט במהלך ההקלטה מאז התנועה הטבעית קשורה עם עלייה בטון סימפטי. הערה כאשר החיה עוברת ישירות על המעקב דיגיטלי במהלך ההקלטה אז זה יכול להיות התעלמו במהלך ניתוח.
  4. מבחן התגובה baroreflex מאת הראשון לאט הזרקת סם חמצן (2.5 µg/g של משקל הגוף באמצעי אחסון של 25 µL של תמיסת מלח) לתוך קו אינפוזיה. לאט לאט אשטוף את תמיסת מלח פיזיולוגית ~ 50 µL ודא שטח מת קטטר נוקתה. לחץ דם הרשומה, RSNA במשך 2-5 דקות.
  5. לאט לאט להחדיר סיילין phenylephrine (20 µg/g של משקל הגוף ב 25 µL של תמיסת מלח). לשטוף עם תמיסת מלח פיזיולוגית ~ 50 µL. ודא שטח מת קטטר נוקתה. לחץ דם הרשומה, RSNA עבור 10-15 דקות נוספות.
  6. ודא הטבע postganglionic של האות העצבי בהזרקת לאט החוסם ganglionic, hexamethonium (50 µg/g משקל הגוף בתוך תמיסת מלח µL 25) לתוך הקו עירוי סיילין. לשטוף עם מי מלח µL ~ 50. ודא שטח מת קטטר נוקתה. המשך הקלטה למשך מספר דקות.
  7. השתמש הפעילות שיורית שנשאר אחרי hexamethonium ניהול כמו הערכת רעש רקע לשימוש בהניתוח של RSNA (יפורט בהמשך).
  8. המתת חסד את העכבר עם מנת יתר של איזופלוריין (stepwise המינון במרווחים של עד 0.5 5%) ולהמשיך מהקלטה RSNA 30 דקות נוספות. הערה: האות הנותרים עשוי לשמש גם הערכה של רעש רקע לניתוח של RSNA.

15. ניתוח נתונים

  1. שימוש תוכנה רכישת נתונים, לנתח לחץ דם raw ועקבות RSNA.
    1. דיגיטלית משלבים ולתקן מלא-גל המעקב RSNA raw באמצעות תוכנה זו. בחר "מוחלט אינטגרלית עבור הגדרות נפרד; חלה דעיכה קבוע הזמן של 0.1 שניות6.
    2. לנתח את האות RSNA משולב (מוצג ביחידות של µV·s) עבור כל אחד מהמקטעים של פרוטוקול נסיוני. להתעלם מקטעים של ההקלטה החיה קרה לעבור דירה. לקחת לפחות 3 מידות עבור הבסיס לבין חלקים ניסיוני של הניסוי, בהתאמה.
    3. לנתח RSNA באותה רמת לחץ הדם המינימלי והמקסימלי מושגת חמצן או phenylephrine, בהתאמה כדי להעריך baroreflex רגישות.
    4. ממוצע של מדידות נלקח מעל כל חלק של פרוטוקול נסיוני להניב ערך יחיד.
    5. לכמת את התגובה RSNA על-ידי חישוב השינוי באחוזים של RSNA מקו, אשר מיועד ב 100%7. ניתוח סטטיסטי מלאה לפי הצורך.
      הערה: בדוגמה זו, ניתוח סטטיסטי של תגובת RSNA חמצן, phenylephrine הושלמה, למבחן t של סטודנט; משמעות התקבלה עם P ערכים < 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות פרוטוקול המתואר, שיעור ההישרדות היה 100% - כל העכברים שעברו אינסטרומנטציה במחקר זה שרד. והחרמתי גם בעקבות הליך כירורגי. תוך 24 שעות הכנה כירורגי, עכברים כל התנהגה בדרך כלל, מפגין מסעדות טיפוסי, טיפוח והתנהגויות גישוש. חיות לא הראה שום סימן של כאב או מצוקה בשלב זה. 48 שעות לאחר הניתוח, אות RSNA לאימות וברור הוקלט ב-10 מתוך העכברים 12. האות הזה נשמר ב עכברים אלה 72 שעות לאחר הניתוח, אולם RSNA האמיתי אות הוקלט ב 7 (70%) של עכברים ביום 4, רק 5 עכברים (50%) על ידי יום 5 לאחר הניתוח. עכברים כי לא התערוכה אות RSNA באיכות גבוהה עקב רעש חשמלי או זיהום על ידי רל אותות היו עדיין במצב בריאותי טוב עד euthanization.

לחץ הדם בעורק ב עכברים בהכרה 48 שעות לאחר הניתוח היה מ מ כספית 116±2, עם קצב הלב אומר המתאים של 596±22 bpm (n = 10). הקלטה בו זמנית של מדגם מייצג של לחץ הדם ואת RSNA בשלב זה הפגינו בבירור וקצבי כאופייני התפרצויות RSNA (איור 2). העליות טיפוסי של RSNA לצפות עם פעילות רגילה כגון אכילה וטיפוח, כפי שנצפה ישירות, צוין על ידי אנשי, היו גם להציג (איור 3). RSNA באיכות גבוהה גם הוקלט ברצף ב- 50% של העכברים תחת חקירה עד 5 ימים לאחר הכנה כירורגי (איור 4). לחץ הדם וקצב הלב נשארה יציבה עבור תקופת החקירה חמישה ימים, ולא ערכים היו שונות מאלו שהקלטנו בעקבות עד 10 ימים של ההחלמה שלאחר הניתוח (טבלה 1)8.

כדי לאמת את האות RSNA ולוודא כי זה אכן entrained עם baroreflex עורקי, לחץ דם תומרנה פרמקולוגית עם זריקה תוך ורידי של חמצן ושל phenylephrine. RSNA כאופייני גדל בתגובה ההפחתה nitroprusside-induced נתרן של לחץ הדם; לעומת זאת, RSNA כמעט הושתק בעקבות עליית phenylephrine-induced לחץ הדם בעורק (איור 5). באופן כמותי, חמצן ירד לחץ הדם כדי 62±3 מ מ כספית, אשר תאמו העלאת RSNA 77±9% מעל רמות הבסיס (n = 5; P < 0.05, איור 6). באופן דומה, בעקבות ניהול phenylephrine, לחץ הדם בעורק הגיעו מ מ כספית 137±6, אשר מופחת RSNA בשיעור של 79±2% מהרמה הבסיסית (n = 5; P < 0.05, איור 6). יתר על כן, RSNA שתיפטר לחלוטין בעקבות המצור ganglionic עם hexamethonium (איור 7), הקמת הטבע פוסט-ganglionic של האות RSNA.

Figure 1
איור 1: בנייה והמיקום של האלקטרודה מושתלת העצבים הסימפתטית כליות. תיאור סכמטי של העיצוב והמיקום המומלצת של האלקטרודה מושתלת העצבים הסימפתטית כליות. (א) הפניות דו-קוטבי מצוידים עם סיכה המחברים ולקרקע שלישי תיל. (ב) חוטים מושחלים דרך צינורות פוליאתילן (PE) 90 להגן את ההפניות יהיו exteriorized. (ג) עיצוב של קצה האלקטרודה כדי להפריד את ההפניות דו-קוטבי החוט הקרקע. (ד) אלקטרודה קצה מכופף בזווית של 90° כדי להקל על מיקום אופטימלי; הצרור עצב כליות מושם מאונך ללידים דו-קוטבי ומבודד סרט המבוסס על שעווה מעבדה ללידים מן החוט הקרקע זה במגע עם הרקמה הבסיסית. מרובה עם הרשאה5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג הקלטה של לחץ הדם, הכליות סימפטי עצבים פעילות (RSNA). מעקב לדוגמה הממחיש הקלטה סימולטני של לחץ מערכתי דם עורקי, RSNA, RSNA משולב ב עכבר בהכרה, בשקט מנוחתו 48 שעות לאחר ההכנה כירורגי. מרובה עם הרשאה5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: בתגובה של פעילות העצבים הסימפתטית כליות (RSNA) פעילות גופנית רגילה. נציג מעקב שמציעות הקלטה בו זמנית של לחץ דם עורקי מערכתית, RSNA ואת משולב RSNA בעוד שעתיים עכברים בהכרה 48, 72 לאחר ניתוח בסיסית, (א) בעת פתיחתה של טיפוח פעיל או לאכול בשקט (B). החץ גדולה מסמל תחילת הפעילות הגופנית מן השאר. מרובה עם הרשאה5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: פעילות העצבים הסימפתטית כליות לטווח ארוך (RSNA) אות הכדאיות. הקלטות נציג רציפים של לחץ הדם ואת RSNA עכבר בהכרה, בשקט בזמן מנוחה אחת כמה ימים לאחר הכנה כירורגי. (א) 2 ימים, 3 (ב), (ג) 4 ימים ו- (ד) 5 ימים לאחר הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: Entrainment של האות פעילות (RSNA) העצבים הסימפתטית כליות עם baroreflex העורקים. נציג הקלטה של לחץ דם עורקי, RSNA ב עכבר בהכרה במנוחה במהלך התוכנית הבסיסית (א) ואחרי עוקבות עירוי לוריד (ב) חמצן ואחריו phenylephrine (ג). מרובה עם הרשאה5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: כימות של כליות אוהדת responsivity ללחץ דם עורקי. תגובה כמותית של לחץ דם עורקי ופעילות העצבים הסימפתטית כליות (RSNA) טיפול תרופתי עם חמצן, phenylephrine. (א) אומר לחץ הדם בעורק בסיסית (פס שחור; 116±2 מ מ כספית), בעקבות עוקבות עירוי לוריד של חמצן (בר אפור; 62±3 מ מ כספית), phenylephrine (בר פתוח; 137±6 מ מ כספית). (ב) המתאימים RSNA התגובה במהלך חמצן (בר אפור; 77±9%) או phenylephrine (בר פתוח; - 79±2%). RSNA מתבטא שינוי באחוזים מקו, זאת אומרת ± ב- SEM * הבדל משמעותי מקו (p < 0.05, n = 5). מרובה עם הרשאה5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: טבע פוסט-ganglionic של פעילות העצבים הסימפתטית כליות (RSNA). נציג מעקב של לחץ דם עורקי, RSNA-(א) בסיסית, (ב) מיד לאחר המצור ganglionic עם hexamethonium ו- (ג) פוסט-מורטם. מרובה עם הרשאה5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

זיהוי בעלי חיים   2d 3d 4d 5d
A מ מ כספית 112 110 108 109
  bpm 657 551 626 616
B מ מ כספית 115 107 111 110
  bpm 582 652 662 668
C מ מ כספית 115 118 113 111
  bpm 591 599 689 664
D מ מ כספית 114 115 116 110
  bpm 457 513 599 531
E מ מ כספית 109 109 103 105
  bpm 632 687 699 689

טבלה 1: ערכים של תוכנית בסיסית רשע העורקים וקצב הלב בעכברים מספקים יותר מ-5 ימים רצופים לאחר ניתוח. מרובה עם הרשאה5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בזאת יש המתוארים, הפגינו ואנו אימות שיטה להערכה יישוב של RSNA בעכברים בהכרה, חינם לזוז לנוח בנוחות בכלובים שלהם הביתה. בעקבות ניתוח ההשתלה של radiotelemeter של לחץ הדם בעורק, קטטר שכנה של עירוי תוך ורידי אישית מעוצבת דו-קוטבי RSNA אלקטרודה עכברים התאושש מהניתוח, נותרו ללא הפרעה במשך 48 עד 72 שעות. עכברים נותרה בנוחות שיוחסו בכלוב בבית שלהם כל הזמן (כולל תקופות ניסיוני) עם גישה בלתי מוגבלת אוכל ומים, העשרה סביבתית. כל מניפולציה ניסויית שהתפתח על ידי החוקר היה מרוחק, לא disquiet את בעלי החיים. לגבי איכות ו פרשנות של האות RSNA, גישה זו הוסרו לחלוטין סיבוכים פיזיולוגיים בלתי רצויות ונמרצים להיערכותם של הרדמה, ניתוחי טראומה, כמו גם איפוק ומקורות אחרים של מתחים פיסיים ומנטאליים כדי החיה. לכן, אלה גורמים מבלבלים רציני אשר תמיד להשפיע על הפרשנות של העצבים הסימפתטית פעילות מדידות חוסלו ביעילות.

כל העכברים היו בקו הבריאות ומוצגים מוקדם ככל 24 שעות לאחר הניתוח, התנהגויות טיפוסיות כגון בהירות, פעילות, תגובתיות, לאכול, לשתות, טיפוח וכן שובבה והתנהגות גישוש. כל החיות הציג את המאפיינים הבאים, העוסקים באופן פעיל עם העשרת הסביבה שסופקו ללא קשר אם לאו אות RSNA קיימא היה מסוגל להקליט. למרות זמן ההחלמה הדרוש כדי לחלוטין שחזור לחץ דם תקין השרשה הבאות של המכשיר radiotelemetric הוא הדיווחים כל עוד 4-7 ימים9, לחץ הדם בעורק מחזיר לקדמותו הרבה קודם, כפי שמגלה את הערכים דיווח פה על לחץ הדם וקצב הלב. אכן, פרמטרים וכלי דם אלה הם שווי ערך לאלה דיווח בעבר באופן דומה שעברו אינסטרומנטציה חיות אשר מורשה לעלות ל-10 ימים להתאושש ניתוח8,10.

הבחירה להשתמש radiotelemetric הגששים למדידה לחץ דם מעל צנתר מלאות נוזל היה מכוון, כמו זו מפחיתה מתחים בעכברים, גם התשואות יותר דם נקי ואמין אותות לחץ הדופק ואת קצב הלב ערכים11 באמצעות טכנולוגיית telemetric ללחץ דם הרשומה מהווה יתרון נוסף שכן צורך לעתים קרובות ועצירה של לשמור על שהנוזל מלא צנתר עורקי עם heparinized מלוחים, באופן בלתי נמנע שמטרידה את החיה, מסולק לחלוטין. כמו כן, הגישה של ניתוח exteriorizing, בעיגון והגנה קטטר תוך ורידי ומוביל אלקטרודה דו קוטבי הינו אידיאלי לעומת דוחות אחרים המתארים אחסון זמני של הפניות גם עם כיס תת עורית12, מאז הגישה שלנו מונע re-הרדמה קצר אפילו ומניפולציה כירורגי של החיה מיד לפני ההקלטה ניסיוני, אשר ללא ספק perturb העכבר ולסכן את האיכות ואת interpretability של מערכת העצבים האוטונומית רגיש ביותר נתונים.

שיטה זו מניבה אותות RSNA נכון, איכות אשר מודגמות לפי האופייני להתפרצות פעילות חשמלית ניתן להבחנה ברורה בין הקולות לרעשי הרקע ב ורגוע בשקט נח העכבר. בנוסף, RSNA הראו תגובתיות טיפוסי לפעילות גופנית החיה כגון טיפוח ושקט לאכול כפי שדווח ב ספרות13,14. נתון את העליות האופיינית RSNA לצפות עם תנועה טבעית או עירנות של החיה, ולכן הכרחי כדי הערה או לא לכלול תקופות אלה למטרת ניתוח ניסיוני וכדי להתמקד מקטעים של ההקלטה במהלכו חיה בשקט נח. פעולה זו מסייעת למנוע ניתן פירוש מוטעה של הנתונים. גורמים אחרים אשר יכול להוביל פירוש מוטעה של הנתונים כוללים רעש חשמלי או הפרעה, וכן אות זיהום עם פולסים א15. תנועה מוגזמת של חלק ללידים אלקטרודה יהיו exteriorized יכולים גם להשפיע על איכות האות RSNA של יכול להופיע בתור בסיסית לא יציב או "וליצב". לעתים מקורות אלה של האות הפרעה יכולים להופיע באופן ספונטני נעלמים במהלך הקלטה ברור לחלוטין, לא להיות כלולים ניתוח5,15,16. שיקול נוסף זה הזמן שבו מתקבלים ההקלטות. חשוב לציין כי לחץ הדם ואת RSNA להשתנות עם קצב השעון הביולוגי, ולכן הוא אידיאלי לערוך ניסויים באותו זמן של יום כדי להימנע גורם מבלבלים פוטנציאל זה. במחקר זה, לא נתבונן השתנות משמעותית של לחץ הדם ואת RSNA עקב תנודות היממה כפי הקלטנו את כל הפרמטרים בין 10 בבוקר ל- 18:00 - בתוך מחזור שעון קיץ של המתקן דיור בעלי חיים. מרכיב חשוב נוסף של דו ח זה הוא האימות של האות RSNA, אשר כפי שמתואר, הוא אכן entrained עם baroreflex העורקים. בהתחשב הפחתה מהירה והעלאה של RSNA במקביל עם ירידה בהשפעה פרמקולוגית, עלייה בלחץ הדם מערכתית, העורקים baroreflex היה בהחלט שלם - שהוא עצמו מדגים את השרשת ריטלין radiotelemetry הצנתר בעורק התרדמה אחד אינו מפריע תפקוד לב וכלי דם תקין. העלמות וירטואלי של האות RSNA בעת המצור ganglionic עם hexamethonium יותר מאשר הקלטה של postganglionic RSNA...

זה יהיה אידיאלי כדי לספק תקופה ההחלמה לאחר הניתוח ארוך על העכברים, אולם אנחנו ואחרים בתחום זה מזהה כי שמירה על הכדאיות לטווח הארוך של העצבים האוטונומית בבעלי חיים באופן כרוני שעברו אינסטרומנטציה, במיוחד עכברים, נותר מאתגר. למרות איכות האות RSNA פחתה במשך מספר ימים לאחר הניתוח, עדיין ניתן היה לתעד באופן אמין RSNA נכון לפחות 3 ימים רצופים בעכברים כל, עד 5 ימים כמחצית מבעלי החיים. זה הישג בפני עצמו מעיד על פריצת דרך בתחום של מחקרים אוטונומי בעכברים. יתר על כן, שיטה זו הגדלת השימוש בבעלי חיים הטרנסגניים יקר, ככל האפשר להקליט מספר ניסיוני ולשלוט ניסויים אותה חיה בימים שונים, כמובן, המאפשרות אקראיות של סדר הניסיון ורישום נאות בסיסית לפני כל הניסוי17. זה מעודד לראות דוחות מוצלחת של הקלטות העצבים הסימפתטית ארוך טווח שנערך מכרסמים בהכרה18,19,20 כולל החידושים telemetric עצבים הקלטת טכנולוגיות עבור חולדות 15,21. המזעור של טכנולוגיה זו לשימוש בעכבר בהכרה המתקרב, בינתיים, אנו שואפים לשפר את הטכניקה הזאת כדי להגדיל את תוחלת החיים של סיבי העצב סימפטי להרחיב את החלון ניסיוני, אולי היתר ארוך יותר זמן ההחלמה לאחר הניתוח. עם זאת, שיטה זו יישארו שימושי ולא נגיש בקלות ובמחיר אלטרנטיבית/משלימים התפתחויות עתידיות בעצב telemetric טכנולוגיית ההקלטה בעכברים, אשר דורשים השקעה התקן קבוע וציוד ייעודי תחזוקה.

הצורך של טכניקות אמין להערכת תפקוד אוטונומי וכלי דם בעכברים מעולם לא היה כל כך נהדר, בהתחשב ההולכת האינטרס העכבר הטרנסגניים מודלים בתחום המחקר הביו-רפואי. צעדים גדולים נעשו בתחומים רבים של פיזיולוגיה, עם זאת יש עדיין רחוקים ללכת מבחינת תקנון, אופטימיזציה של גישות להערכת תפקוד אוטונומי העכבר. נכון להיום, יש מדידה אחת דו ח המתאר של פעילות העצבים החישה העכבר בהכרה12. גישה זו מתווה את המדידה של פעילות העצבים החישה שלפוחית השתן והיא כוללת הרדמה, ניתוח מניפולציה של קטטרים שמוקם subcutaneously מיד לפני ההקלטה ניסיוני איפוק הפיזי של העכברים במהלך הקורס נסיוני12. גורמים אלה ידועים לחצים זה יש להימנע לחלוטין עם הגישה הנוכחי, אשר בהחלט התפורות להקלטה של מגוון רחב של עצבים עניין בנוסף העצבים כליות. לאחרונה, דווח העצבים הסימפתטית מדידות בעכברים בהכרה, עם זאת, מדידות אלה ברובו מתנהל שעות לאחר ההכנה כירורגי, ללא אזכור של המינהל כאבים22. מלבד דוחות אלה, תפקוד אוטונומי כבר העריך אחרת באופן בלעדי בעכברים מורדם. סקירה מקיפה של הספרות מניב מספר רב של גישות, משך שעות באורך ניסיוני, שילובים הרדמה/מינונים, אוורור מכני, לעיתים קרובות יצירתי שננקטו צעדים כלשהם כדי לקיים את העכברים במצב הנושאת איזשהו צל-צלו פיזיולוגיים (כלומר חמצן פוצצו ישירות לכיוון האף של החיה)23,24,25,26,27,28,29, 30,31. בין מחקרים אלו, דוחות של ערכי לחץ הדם הם נעדר, או עד מוות נמוך - מתחת לטווח פיזיולוגיים של לחצים עורקי מערכתית2. . זה בעייתי במישורים רבים, אך במיוחד כאשר הערכה נכונה של תפקוד אוטונומי החיות הללו הוא מודאג, ובהינתן החוליה הוקמה בין לחץ הדם ואת הטון אוטונומי. סוכנים הרדמה עצמם משפיע ישירות על טון סימפטי, עם דיווחים רבים רומז שכי הרדמה dampens הפעילות הסימפתטית. אכן, ראיות להדגים אראטאן הזה, ההרדמה נרחב ביותר שבחרת עבור עצב חריפה הקלטה ניסויים32, מנה dependently ירידות RSNA33 , מעכב את עורקי baroreflex34. לעומת זאת, דוחות אחרים מציעים שאראטאן הזה מגביר את הטון סימפטי35. כמובן מאליו, שמחקרים כאלה בדרך כלל להשוות בין פעילות העצבים ניסיוני כשינוי מקו מוקלטות, אולם המדינה מסולף של מערכת העצבים האוטונומית בתנאים המתוארים לעיל ללא ספק מונע זיהוי של שינויים דיסקרטית עצב פעילות.

האתגר של שיטה זו נעוץ בעיקר מיומנות כירורגית הנדרש להכנה מוצלחת של העכבר עבור הקלטת עצב בהכרה. עם זאת ההשקעה השחזה הכישורים האלה יותר מחפים את האיכות והאמינות של הנתונים RSNA ישירה הפיק. גישה זו לגמרי עוקף את המגבלות שמציב עקיפה הערכות של שליטה האוטונומית כגון רמות קטכולאמין פלאזמה, די יציב בעכברים והם מוגבלים על ידי כמות הדם שעשויים להיות שנאספו בצורה הומאנית36. בנוסף, פלזמה קטכולאמין המצור אוטונומי ברמה, כמו גם תרופתי הערכה הכוללת אוטונומי טון1 לעומת תרומות דיסקרטית של אוכלוסיות עצב מסוים, אשר בדרך כלל יותר עניין. הערכה מתמטי של הטון אוטונומי באמצעות כוח ניתוח ספקטרלי של עקבות לחץ הדם וקצב הלב הוא שימושי עבור הערכת תפקוד אוטונומי של ניסויים, אולם טכניקה זו לא בהכרח וישימה עכברים36,37. לכן, דגימה ישירה של פעילות העצבים עכבר בהכרה, בנוחות מנוחתו הוא אידיאלי כמו זה מקרוב משקף מצב טבעי, ללא פגע אוטונומי של הנושא ומקל מתוחכמים הערכת התרומה של העצבים שנבחר כדי תופעות פיזיולוגיות של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

S.M.H. נתמך על ידי דוקטורנטים מן המוסדות הקנדי לבריאות מחקר (CIHR), הלב & קו הבסיס של קנדה (HSFC), פתרונות בריאות מחדשת של אלברטה (AiHS); J.E.H. נתמך על ידי מענק הלאומי ללב, ריאות, דם מכון PO1HL-51971....

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire A-M Systems 793200 0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated
#11 Scalpel Blade Fisher Scientific ALMM9011
Soldering Iron and solder Any make or model suitable
Male miniature pin connectors A-M Systems 520200 Brass with gold plating
Female miniature pin connectors A-M Systems 520100 Brass with gold plating
Heat Shrink tubing Radio Shack Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610 1.6 mm diameter
Polyethylene 90 (PE90) tubing VWR CA-63018-703 0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter
Dissecting microscope Leica Microsystems Leica M80 Any make or model also suitable
Polyethylene 10 (PE10) tubing Braintree Scientific PE10 50 FT 0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter
Super Glue Liquid Loctite n/a Liquid Formula; any brand suitable
Super Glue Gel Loctite n/a Gel Formula; any brand suitable
Polyethylene tubing Scientific Commodities BB31695-PE/13 For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter
Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets Contact local hospital sterilization services
Isoflurane anesthesia Abbott 05260-05
Deltaphase isothermal heat pads & surgical table Braintree Scientific 39OP Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential
Glycopyrrolate Amdipharm Mercury Company Limited n/a
Isoflurane vaporizer system & flow gauge Braintree Scientific VP I Include medical grade oxygen supply
Tissue scissors Fine Science Tools 14173-12
Fine spring scissors Fine Science Tools 15006-09
Small cotton-tipped applicators Fisher Scientific 23400100
Fine Straight Forceps Fine Science Tools 11254-20 #5, FST by Dumont Biologie Tip
Angled Forceps Fine Science Tools 11251-35 #5/45 FST by Dumont
Small Absorbent Spears Fine Science Tools 18105-03
Parafilm Sigma Aldrich BR701605 ALDRICH
Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer World Precision Instruments (WPI) KWIK-SIL Purchase extra specialized tips from WPI
5-0 Polysorb Suture Tyco Healthcare n/a
6-0 Silk Suture Braintree Scientific SUT-S 104 Deknatel brand, spool
Radiotelemetry Probe Data Sciences International (DSI) TA11-PAC10
Radiotelemetry Receiver Data Sciences International (DSI) PhysioTel RPC-1
Ambient Pressure Reference Data Sciences International (DSI) Apr-01
Pressure Output Adapter Data Sciences International (DSI) R11CPA
Rena Pulse Tubing Braintree Scientific RPT-040
Infusion Swivel Instech Solomon 375/D/22
Swivel Support Arm & Mount Instech Solomon SMCLA
Polysulfone button  Instech Solomon LW62S/6
Stainless steel spring Instech Solomon PS62
Vetbond surgical adhesive 3M n/a
Triple Antibiotic Ointment Fougera n/a
PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software ADInstruments PowerLab 8/35
PVC Insulated Cable Belden PVC Audio Connection Cable 32 AWG
Preamplification Headstage Dagan Corporation Model 4002
Differential Amplifier Dagan Corporation EX4-400
Sodium Nitroprusside Sigma Aldrich 71778-25G
Phenylephrine Sigma Aldrich P6126-5G
Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl Beckton Dickinson Contact local hospital supplier
hexamethonium Sigma Aldrich H0879-5G
Stainless Steel top anti vibration table n/a n/a Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable
Faraday cage n/a n/a Custom designed and constructed in-house
Small animal hair trimmer n/a n/a Drugstore, men's beard trimmer suitable
Dipilatory Cream n/a n/a Veet brand, sensitive skin formula
10% Povidone Iodine Purdue Products Betadiene
70% Ethanol n/a n/a
Steel microretractors n/a n/a Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor
Hemostats Fine Science Tools 13011-12
Heat Gun Fisher Scientific 09-201-27

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, C. N., Davisson, R. L. In vivo assessment of neurocardiovascular regulation in the mouse: principles, progress, and prospects. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (3), H654-H662 (2011).
  2. Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
  3. Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Compr Physiol. 4 (2), 825-850 (2014).
  4. Guyenet, P. G. The sympathetic control of blood pressure. Nat Rev Neurosci. 7 (5), 335-346 (2006).
  5. Hamza, S. M., Hall, J. E. Direct recording of renal sympathetic nerve activity in unrestrained, conscious mice. Hypertension. 60 (3), 856-864 (2012).
  6. DeBeck, L. D., Petersen, S. R., Jones, K. E., Stickland, M. K. Heart rate variability and muscle sympathetic nerve activity response to acute stress: the effect of breathing. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), R80-R91 (2010).
  7. Krowicki, Z. K., Kapusta, D. R. Microinjection of glycine into the hypothalamic paraventricular nucleus produces diuresis, natriuresis, and inhibition of central sympathetic outflow. J Pharmacol Exp Ther. 337 (1), 247-255 (2011).
  8. do Carmo, J. M., et al. Control of blood pressure, appetite, and glucose by leptin in mice lacking leptin receptors in proopiomelanocortin neurons. Hypertension. 57 (5), 918-926 (2011).
  9. Brockway, B. P., Mills, P. A., Azar, S. H. A new method for continuous chronic measurement and recording of blood pressure, heart rate and activity in the rat via radio-telemetry. Clin Exp Hypertens A. 13 (5), 885-895 (1991).
  10. Tallam, L. S., Silva, da, A, A., Hall, J. E. Melanocortin-4 receptor mediates chronic cardiovascular and metabolic actions of leptin. Hypertension. 48 (1), 58-64 (2006).
  11. Van Vliet, B. N., Chafe, L. L., Antic, V., Schnyder-Candrian, S., Montani, J. P. Direct and indirect methods used to study arterial blood pressure. J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (2), 361-373 (2000).
  12. Zvara, P., et al. A non-anesthetized mouse model for recording sensory urinary bladder activity. Front Neurol. 1, 127 (2010).
  13. Hagan, K. P., Bell, L. B., Mittelstadt, S. W., Clifford, P. S. Effect of dynamic exercise on renal sympathetic nerve activity in conscious rabbits. J Appl Physiol. 74 (5), 2099-2104 (1985).
  14. Matsukawa, K., Ninomiya, I. Changes in renal sympathetic nerve activity, heart rate and arterial blood pressure associated with eating in cats. J Physiol. 390, 229-242 (1987).
  15. Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (10), 6 (2013).
  16. Burke, S. L., Lambert, E., Head, G. A. New approaches to quantifying sympathetic nerve activity. Curr Hypertens Rep. 13 (3), 249-257 (2011).
  17. Smith, F. G. Techniques for recording renal sympathetic nerve activity in awake, freely moving animals. Methods. 30 (2), 122-126 (2003).
  18. Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Exp Physiol. 87 (1), 33-39 (2002).
  19. Yoshimoto, M., Miki, K. Measurement of renal sympathetic nerve activity in freely moving mice. J Physiol. 560, (2004).
  20. Yoshimoto, M., Miki, K., Fink, G. D., King, A., Osborn, J. W. Chronic angiotensin II infusion causes differential responses in regional sympathetic nerve activity in rats. Hypertension. 55 (3), 644-651 (2010).
  21. Salman, I. M., Sarma Kandukuri,, Harrison, D., L, J., Hildreth, C. M., Phillips, J. K. Direct conscious telemetry recordings demonstrate increased renal sympathetic nerve activity in rats with chronic kidney disease. Front Physiol. 6, 218 (2015).
  22. Morgan, D. A., Despas, F., Rahmouni, K. Effects of leptin on sympathetic nerve activity in conscious mice. Physiol Rep. 3 (9), (2015).
  23. Alfie, M. E., Sigmon, D. H., Pomposiello, S. I., Carretero, O. A. Effect of high salt intake in mutant mice lacking bradykinin-B2 receptors. Hypertension. 29 (1 Pt 2), 483-487 (1997).
  24. Dietz, J. R., Landon, C. S., Nazian, S. J., Vesely, D. L., Gower, W. R. Effects of cardiac hormones on arterial pressure and sodium excretion in NPRA knockout mice. Exp Biol Med (Maywood). 229 (8), 813-818 (2004).
  25. Zhang, W., et al. Cyclosporine A-induced hypertension involves synapsin in renal sensory nerve endings. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9765-9770 (2000).
  26. Szczesny, G., Veihelmann, A., Massberg, S., Nolte, D., Messmer, K. Long-term anaesthesia using inhalatory isoflurane in different strains of mice-the haemodynamic effects. Lab Anim. 38 (1), 64-69 (2004).
  27. Tank, J., et al. Sympathetic nerve traffic and circulating norepinephrine levels in RGS2-deficient mice. Auton Neurosci. 136 (1-2), 52-57 (2007).
  28. Schwarte, L. A., Zuurbier, C. J., Ince, C. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
  29. Zuurbier, C. J., Emons, V. M., Ince, C. Hemodynamics of anesthetized ventilated mouse models: aspects of anesthetics, fluid support, and strain. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2099-H2105 (2002).
  30. Farnham, M. M., O'Connor, E. T., Wilson, R. J., Pilowsky, P. M. Surgical preparation of mice for recording cardiorespiratory parameters in vivo. J Neurosci Methods. 248, 41-45 (2015).
  31. Cuellar, J. M., Antognini, J. F., Carstens, E. An in vivo method for recording single unit activity in lumbar spinal cord in mice anesthetized with a volatile anesthetic. Brain Res Brain Res Protoc. 13 (2), 126-134 (2004).
  32. Carruba, M. O., Bondiolotti, G., Picotti, G. B., Catteruccia, N., Da Prada, M. Effects of diethyl ether, halothane, ketamine and urethane on sympathetic activity in the rat. Eur J Pharmacol. 134 (1), 15-24 (1987).
  33. Wang, G. F., Mao, X. J., Chen, Z. J. Urethane suppresses renal sympathetic nerve activity in Wistar rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 18 (10), 1454-1457 (2014).
  34. Xu, H., et al. Effects of induced hypothermia on renal sympathetic nerve activity and baroreceptor reflex in urethane-anesthetized rabbits. Crit Care Med. 28 (12), 3854-3860 (2000).
  35. Shimokawa, A., Kunitake, T., Takasaki, M., Kannan, H. Differential effects of anesthetics on sympathetic nerve activity and arterial baroreceptor reflex in chronically instrumented rats. J Auton Nerv Syst. 72 (1), 46-54 (1998).
  36. Janssen, B. J., Smits, J. F. Autonomic control of blood pressure in mice: basic physiology and effects of genetic modification. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (6), R1545-R1564 (2002).
  37. Nunn, N., Feetham, C. H., Martin, J., Barrett-Jolley, R., Plagge, A. Elevated blood pressure, heart rate and body temperature in mice lacking the XLalphas protein of the Gnas locus is due to increased sympathetic tone. Exp Physiol. 98 (10), 1432-1445 (2013).

Tags

רפואה גיליון 132 כליות העצבים הסימפתטית פעילות (RSNA) עכברים בהכרה לחץ דם אינפוזיה תוך ורידי כליות מערכת העצבים האוטונומית הגישה כירורגי
בגישה חדשנית עבור הקלטה בו זמנית של פעילות העצבים הסימפתטית כליות, לחץ דם עם עירוי תוך ורידי, בהכרה, עכברים ערככם.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hamza, S. M., Hall, J. E. Novel… More

Hamza, S. M., Hall, J. E. Novel Approach for Simultaneous Recording of Renal Sympathetic Nerve Activity and Blood Pressure with Intravenous Infusion in Conscious, Unrestrained Mice.. J. Vis. Exp. (132), e54120, doi:10.3791/54120 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter