Abstract
Menselijk brein is een hoge energie verbruikende orgaan dat voornamelijk is gebaseerd op glucose als brandstof bron. Glucose wordt gekataboliseerd door hersenen mitochondria via glycolyse, tri-carbonzuur (TCA) cyclus en oxidatieve fosforylering (OXPHOS) wegen om cellulaire energie te produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP). Bijzondere waardevermindering van mitochondriale ATP productie veroorzaakt mitochondriale aandoeningen, die klinisch presenteren met prominente neurologische en myopathische symptomen. Mitochondriale gebreken zijn ook aanwezig in neurologische aandoeningen (bv autisme spectrum stoornis) en neurodegeneratieve aandoeningen (bijvoorbeeld amyotrofe laterale sclerose, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson). Aldus is er een toenemende belangstelling voor het gebied voor het uitvoeren van 3D analyse van mitochondriale morfologie, structuur en distributie onder gezond en ziektetoestanden. De hersenen mitochondriale morfologie is zeer divers, met een aantal mitochondria name inde synaptische gebied in het bereik van <200 nm diameter, hetgeen lager is dan de resolutielimiet van traditionele lichtmicroscopie. Uitdrukken van een op mitochondriën gerichte groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen aanzienlijk verbetert de organellen detectie met confocale microscopie. Dit betekent echter niet de beperkingen van de gevoeligheid van detectie van relatief kleinschalige mitochondria overwinnen zonder oversaturating de beelden van groot formaat mitochondria. Terwijl seriële transmissie elektronenmicroscopie is met succes gebruikt om mitochondriën karakteriseren de neuronale synaps, deze techniek is zeer tijdrovend vooral bij het vergelijken van meerdere monsters. De seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) techniek houdt een geautomatiseerd proces van snijden, imaging blokken van weefsel en data-acquisitie. Hier bieden we een protocol om SBFSEM uitvoeren van een bepaald gebied van knaagdieren hersenen om snel te reconstrueren en te visualiseren mitochondriale morfologie. deze technique kan ook worden gebruikt om nauwkeurige informatie over mitochondrial nummer, volume, grootte en verdeling in een bepaald hersengebied verschaffen. Omdat de verkregen beeldresolutie is hoog (meestal minder dan 10 nm) alle bruto mitochondriale morfologische defecten kunnen ook worden gedetecteerd.
Introduction
Mitochondriën zijn dynamische organellen die hun vorm en locatie afhankelijk van de cellulaire signalen en verandert zal in nauwe interactie met mobiele cytoskelet en als reactie op cellulaire gebeurtenissen zoals calcium stromen in neuronen 1. Mitochondriën ook een wisselwerking met andere cellulaire organellen, bijv endoplasmatisch reticulum, waardoor reguleert de dynamiek en metabolisme 2. Mitochondriale morfologie toont heterogeniteit in verschillende celtypen dwz. de vorm van het organel verschilt van die buisvormige bestaande uit platen, zakken en ovalen 3. Het is aangetoond dat mitochondriale fusie en splijtstofcyclus eiwitten de locatie, afmeting, vorm en verdeling van mitochondria 4 kan reguleren. Bovendien, veranderingen in mitochondriale vorm geassocieerd met neurodegeneratie, neuronale plasticiteit, spieratrofie, calcium signaaloverdracht, reactieve zuurstofspecies generatie en levensduur en celdood impliceert that celspecifieke mitochondriale morfologie essentieel is voor de handhaving van normale cellulaire functie 5-11.
Een belangrijke bio-energetische functie van de mitochondriën is om adenosine trifosfaat (ATP) te genereren door het uitvoeren van een reeks van metabole reacties die volledige afbraak van voedingsstoffen (ie glucose, vetzuren en aminozuren) via de TCA cyclus te betrekken en OXPHOS trajecten 12. Het menselijk brein vormt slechts 2% van het lichaamsgewicht maar het verbruikt ~ 20% van de totale energie geproduceerd, waardoor het een zeer energie veeleisende orgaan 13. Het is dan ook niet verwonderlijk dat mitochondriale dysfunctie bij de mens leidt tot een groot aantal neurologische verschijnselen 14-17. Genetische mutaties in OXPHOS componenten die ATP productie leidt afbreuk mitochondriale aandoeningen 17,18, die klinisch heterogene groep van aandoeningen met een prevalentie van ~ 1: 5000 individuen, en een van de meest voorkomende oorzaak van metabolic stoornissen bij kinderen en volwassenen. Deficit van mitochondriën afkomstig ATP invloed op meerdere orgaansystemen met een hoge energie-eisen organen, zoals de hersenen, het hart en de skeletspieren wordt voornamelijk beïnvloed bij deze patiënten 14,17,18. In de afgelopen jaren hebben meerdere studies bewijs geleverd voor mitochondriële disfunctie bij zowel neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen 15-17,19,20. Aangezien mitochondria essentieel en kritisch voor ontwikkeling van de hersenen en de functie, is het noodzakelijk om protocollen die veranderingen in de hersenen mitochondriale morfologie, structuur, grootte, aantal en distributie onder zowel gezonde als zieke toestanden kunnen analyseren ontwikkelen. Muismodellen mitochondriën gerichte groen fluorescerend eiwit (GFP) werden geproduceerd om mitochondriale mutaties en lokalisatie visualiseren in de hersenen 21,22. Hoewel dit een zeer nuttig hulpmiddel mitochondriale motiliteit algemene verspreiding te onderzoeken, zijn er een aantal nadelen die include beperkte resolutie en gevoeligheid van fluorescentie microscopie. Deze kenmerken maken het moeilijk om de relatief kleine formaat mitochondria volgen. Evenzo seriële transmissie elektronenmicroscopie is met succes gebruikt om synaptische mitochondriën 23 bekijken, maar deze methode is zeer tijdrovend. Mitochondriale morfologie bekend is zeer dynamisch te zijn als ze worden voortdurend kernsplijting en kernfusie cycli, en in de meeste cellen mitochondria onderhouden van een sterk verbonden netwerk 24-26. Neuronen zijn sterk gepolariseerde cellen met meerdere dendrieten en axonen verlengd, en dat mitochondria een aangesloten netvormige netwerk in het cellichaam vormen kan hebben om te scheiden als zij hun weg door deze neurieten (figuur 1). Hierdoor hersenen mitochondriën zeer gevarieerd in grootte en vorm. Bijvoorbeeld met gebruikmaking serieblok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) techniek we eerder waargenomen dat het verschil in de hoeveelheid of de grootte van extrasynaptic mitochondria aan mitochondria in de zenuwuiteinden kan zo veel als zestien vouwen 27.
Er zijn verschillende manieren voor het uitvoeren van analyses volume 28, welke seriële sectie TEM 29, geautomatiseerde tape verzamelen ultramicrotoom SEM 30 omvat, gefocusseerde ionenbundel SEM 31 en SBFSEM 32. De SBFSEM analyse heeft voordelen doordat zij de resolutie kwantitatieve gegevens over de morfologische vorm, grootte, verdeling en het aantal van organellen zoals mitochondriën, deze gebieden tot 1 mm van de hersenen. De technische werking is ook de minst veeleisende, met data-acquisitie en analyse binnen de mogelijkheden van vele biologische laboratoria die eerdere EM ervaring missen. De komst van commerciële instrumenten voor het genereren seriële sectie-achtige beelden heeft 3D ultrastructurele analyse van weefsels die routinematig techniek, die een onbevooroordeelde volumetrische analyse op een snelle en reproduceerbare wijze 28 verder toelaat 32, gebaseerd op een idee van Leighton geïntroduceerd in 1981 33. Meerdere studies sindsdien deze techniek als een belangrijk instrument voor reconstructie analyse van neuronale circuits 34 zijn opgesteld. Bovendien vele kleinere projecten, biedt reconstructie analyse celorganellen 27,35-39 identificeren. Daar worden de verkregen beelden afkomstig zijn van lage spanning terug scatter elektronen, nieuwe kleuringsprotocollen waarin verschillende bekende heavy metal-kleuring technieken te combineren werden ontwikkeld om de resolutie van 40 te verhogen.
In dit artikel geven we een protocol voor het gebruik van 3D-elektronenmicroscopie beeldvorming en volumetrische analyse van de hersenen mitochondriën gebaseerd op methoden die eerder zijn gebruikt door ons en anderen 38,39,41. Het weefsel nabewerking methoden waren zoals eerder beschreven door Deerinck c.s.40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op Virginia Tech.
Let op: Extreme voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het hanteren en afvoeren verschillende onderdelen gebruikt in dit protocol. Voor gebruik moet de lokale institutionele richtlijnen en praktijken gezondheid en veiligheid worden opgesteld en in acht name van osmiumtetroxide dat vluchtig en zeer giftige, uranyl acetaat, die zowel een zwaar metaal en radioactieve bron en loodnitraat, wat een heavy metal gif. Thiocarbohydrazide (TCH) kan ontbinden explosieve en giftige gassen produceren, verkeerde behandeling. Veel instellingen zullen een EM kernfaciliteit waarin deze reagentia routinematig worden gebruikt en kan hulp te bieden hebben.
1. Voorbereiding van het hersenweefsel en SBFSEM Imaging
- Verdoven jonge (~ 2-4 maanden oud) C57 zwarte muizen (C57BL / 6J-stam) gebruikt 4-5% isoflurane volgens de institutionele richtlijnen. Bevestig verdoving door het volgen van het verlies van spiertonus, gebrek aan vrijwillige bewegingen en reacties op aversieve stimuli als een staart knijpen.
- Speld de muis op een dissectie lade en zorg een incisie op de huid langs de ventrale middellijn. Verdere incisies in de huid op de borstkas van de muis bloot. Incise het middenrif, en zorgvuldig ontleden uit de borstholte langs de periferie naar het kloppend hart bloot te leggen, en maak dan een incisie aan de rechter atrium.
- Met behulp van een vlinder canule canule de linker ventrikel. Perfuseren de muis transcardially behulp 10-20 ml fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) pH 7,2, tot leegbloeden wordt bevestigd door een verandering in de kleur van de lever.
Opmerking: Een verandering in de kleur van de lever wordt gebruikt als een leidraad voor het bepalen van de omvang van de verbloeding. Bevestigen dat de lever kleur verandert van roodachtig bruin tot lichtroze. - Perfuseren de muis transcardially behulp 10-20 ml 2% glutaraldehyde en 4% paraformaldehyde in 0,10 M cacodylaatbuffer (pH 7,2), aan het hersenweefsel snel oplossen van binnenuit. Fixatie wordt bewaakt door het observeren van de staart verstijving.
Opmerking: Bereid 0,10 M cacodylaatbuffer (pH 7,2) door het oplossen van 2,14 g natriumcacodylaat in 80 ml water, voeg zoutzuur om de pH en maken het volume op 100 ml met water. - Na perfusie onthoofden de muis, ontleden de hersenen, gevolgd door fixatie in 0,10 M natriumcacodylaat (pH 7,2) bevattende 2% glutaaraldehyde en 4% paraformaldehyde gedurende 48 uur bij 4 ° C
- Na 48 uur laten 400 urn coronale secties met behulp van een vibratoom en vervolgens voorzichtig ontleden het gebied van belang in de hersenen (bijvoorbeeld de hippocampus) onder de dissectie microscoop 42. trimmen voorzichtig het weefsel en neem een foto voor het behoud van de oriëntatie.
Opmerking: Post verwerkingsmethoden weefsel kleuring in SBFSEM combineert een verscheidenheid van heavy metal kleuring methoden inOm de resolutie te verbeteren en zijn gebaseerd op de methode die eerder door Deerinck et al 40 ontwikkeld. - Was de glutaaraldehyde gefixeerde weefsels 3 keer 5 min elk in 0,1 M cacodylaatbuffer (pH 7,2).
- Bereid 0,1% looizuuroplossing door oplossen looizuur in 0,1 M natriumcacodylaat (pH 7,2). Swirl totdat het is opgelost en filteren door middel van 0,45 pm filter, indien nodig.
- Postfix de weefsels cacodylate gebufferde 0,1% looizuur door incubatie in 1 ml reagens voor 30 - 60 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: De incubatietijd is afhankelijk weefselgrootte, maar 30 min het beste werkt voor de meeste weefsels. - Wassen weefsels 3 keer 5 min elk in cacodylaatbuffer (pH 7,2).
- Los op 0,3 g kaliumferrocyanide en 0,86 g natriumcacodylaat in 10 ml gedestilleerd H2 O (dH 2 O). Houd de kaliumferrocyanide-oplossing op het ijs. Net voor gebruik, voeg 10 ml van 4% osmiumtetroxide (OsO 4).
- Vlekken op de weefsels met 2% osmium-ferrocyanide oplossing voor 90 min op ijs. Was 3 maal, 5 min elk in dH 2 O.
- Bereid 1% thiocarbohydrazide (TCH) oplossing door het oplossen van 0,1 g TCH in 10 ml dH 2 O. Oplossen bij 60 ° C door zwenken om de 10 min tot het volledig opgelost. Neem de veiligheidsvoorschriften bij behandeling van TCH, in het bijzonder zorgen om gebruik te maken van metalen, verhitting tot hoge temperaturen, of als oplossing te voorkomen uit te drogen.
- Behandel de monsters met vers bereide 1% TCH gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was 3 maal, 5 min elk in dH 2 O.
- Verdun 4% OsO 4-2% met dH 2 O, vlek weefsels met 2% waterig osmiumtetroxide door incubatie gedurende 1 uur. Wassen weefsels 3 keer, 5 minuten elk met dH 2 O.
- Incubeer de monsters O / N op 1% uranylacetaat in dH 2 O bij 4 ° C.
- Bereid Walton's lead aspartaat-oplossing (zoals beschreven door Deerinck et al 40).
- Los op 0,998 gram L-aspartaat in 250 ml dH 2 Oen voeg 10 N kaliumhydroxide (KOH) druppelsgewijze totdat de pH 5,5 bereikt. Na pH aanpassing, voeg 0,066 g loodnitraat in 10 ml asparaginezuur voorraad en verhit tot 60 ° C gedurende 30 minuten.
- Spoel weefsels in dH 2 O en incubeer met Walton's lead aspartaat vlek gedurende 30 minuten in een 60 ° C oven. Was 3 maal, 5 min elk in dH 2 O.
- Uitdrogen monsters door een gegradeerde reeks van alcohol via gekoelde oplossing van 20%, 50%, 75%, 85% en 95% ethanol gedurende 5 minuten elk, gevolgd door 100% ethanol 3 maal, 10 minuten elk.
Opmerking: Gebruik 100% ethanol uit vers geopende fles, als geopend ethanol absorbeert water uit de lucht en veroorzaken inbedding te mislukken. Langere incubaties nodig met grotere weefselmonsters. - Spoelmonsters 2 maal, 15 minuten elk in propyleenoxide.
- Voeg plasticinsluiting hars middels 25 ml hars, 10,5 ml DDSA (dodecenyl barnsteenzuur anhydride), 15,5 ml NMA (methyl Nadic anhydride) en 1 mlDMP-30 (2,4,6-tris dimethylaminomethyl fenol). Meng de hars door schudden. Spin en laat de hars totdat bubbels vastberadenheid staan.
Let op: Dit is de standaard gemiddelde hardheid recept. Andere soorten elektronenmicroscopie (EM) plastic hars gebruiken, maar moet worden getest met een niet-essentiële controlemonster van tevoren als niet alle harsen werken SBFSEM. - Incubeer de weefsels O / N op een 50: 50 mengsel van inbedding hars en propyleenoxide, in een flacon die aanvankelijk wordt afgedekt, dan afgetopte na 2 uur, zodat het propyleenoxide verdampt in de periode van ongeveer 8-10 uur.
- Transfer het weefsel 100% verse inbedding hars in schone flesjes voor 2 uur.
- Insluiten monsters verse inbedding hars in vlakke matrijzen bevattende bedrukte papieren etiketten en harden ze in een oven bij 60 ° C gedurende 48 uur. Na ongeveer 1 uur, controleer dan het weefsel plaatsing en uitlijning weer, en indien nodig bijstellen.
- Trim monsters naar het gebied van interesse en monteren op een aluminium pin met behulp van Gelling cyanoacrylaat superlijm of een geleidende epoxyhars, vervolgens een laag colloïdaal zilver pasta rond de zijkanten van het blok naar een geleidingsbaan aan de aluminium pen verschaffen.
- Onderzoek weefselmonsters met behulp van een scanning elektronenmicroscoop systeem uitgerust met een interne kamer ultramicrotoom stadium lage kV teruggekaatste elektronen detector 32.
Let op: Zorg voor instrument- en de site-opleiding in de scanning elektronenmicroscoop (SEM) te gebruiken en uitgegroeid tot een geautoriseerde gebruiker. Als alternatief kan samenwerking met een onderzoeker of kernfaciliteit voor kleine projecten mogelijk zijn. Straling training kan ook nodig zijn als SEM genereren x-stralen. - Om het beeld van de monsters, kunt u de volgende instellingen: 2,25 kV, is 5 - 10 nm / pixel resolutie, met veld maten tussen 80-250 urn x, y (ander gebied maten mogelijk), en slice dikte van 50 - 100 nm, met in totaal 250-600 segmenten in een 16 - 20 uur periode.
Opmerking: Instellingen aanzienlijk variëren tussen de verschillende microscopen, indiindividuele monsters, en de gewenste resolutie. Deze instellingen moeten beelden die eenvoudig te interpreteren vele monsters produceren.
2. Het analyseren van de Imaging Dataset
Opmerking: Het beeld J / Fiji software wordt gebruikt om de dataset te analyseren en vertrouwt op de TrakEM2 plug. Voorbewerken stappen kunnen worden uitgevoerd met verschillende software, en kan daarna of kleine afhankelijk van de ervaring niveau en de stapels verkregen. De belangrijkste transformaties met behulp van de open-source software (ImageJ ver 1.50b, Fiji downloaden 1 oktober 2015) worden hier beschreven.
- afbeeldingen naar 8 bit tiff-formaat te converteren van de oorspronkelijke eigen 16-bits afbeeldingen door het openen in de software en het selecteren van menu-items Afbeelding → Type → 8 bit.
- Als automatische conversie contrast / helderheid tijdens deze stap is niet ideaal voor afbeeldingen, heropenen de 16-bits afbeeldingen, en druk op Afbeelding → Aanpassen → Helderheid / Contrast. Selecteer een bereik die werkt voor alle afbeeldingen en druk op Toepassen. Voer vervolgens conversion. Opmerking: Op sommige SEM, kan deze stap microscope fabrikant van software nodig.
- Indien nodig, te wijten aan een gebrekkige beeld- beweging tussen segmenten (bv. Drift als gevolg van het laden), registreren / uitlijnen het beeld stacks (menu-items Plugins → Registratie → Linear StackAlignmentWithSIFT). In de meeste registratie software, die voor "vertaling-only" mode in plaats van "star lichaam".
Opmerking: Veel benaderingen en software kan werken: de SIFT registratie plug-in werkt voor vele toepassingen en er is een virtuele stack versie.- Indien nodig, vergroot het doek grootte voorafgaand aan de registratie (Afbeelding → Aanpassen → canvasmaat) of te reduceren tot een gebied van belang (Afbeelding → Crop).
Opmerking: Sommige drift of splaying kunnen optreden, en proberen andere plugins of software kunnen betere resultaten. Handmatige opties zijn ook beschikbaar (bijv. ImageJ / Fiji, Plugins → Registratie → ManualLandmarkSelection).
- Indien nodig, vergroot het doek grootte voorafgaand aan de registratie (Afbeelding → Aanpassen → canvasmaat) of te reduceren tot een gebied van belang (Afbeelding → Crop).
- Als desired, schaal beelden naar kleinere, meer beheersbare omvang (bv. 25%) met behulp van ImageJ (Afbeelding → Scale).
- Start de software, selecteert u Bestand → Importeren → reeks afbeeldingen en selecteer vervolgens de tiff-bestanden.
- Start de plugin door Bestand → Nieuw → TrakEM2 (blanco). Twee vensters te openen; één beheert het project en area_lists en de andere beheert tracing, en wordt aangeduid als het 'doek'.
- Laad de afbeelding stapel in de plugin door een klik met de rechtermuisknop op het doek import. Kies de invoer en klik op import stack. In de pop-up opties, vinkt u het vakje voor virtuele stacks.
Opmerking: hoewel het beeld stacks reeds in de software worden geopend, moeten ze ook worden geopend in de plugin. De computer kan soepeler lopen als de doos virtuele stacks wordt gecontroleerd. - Nadat de mipmaps worden gecreëerd en de stack wordt geladen, klik met de rechtermuisknop op het project onder de plugin venster te noemen. Klik met de rechtermuisknop op 'nieuw project' in de sjabloon colUMN, en selecteer 'add new kind' voor dat project. Klik met de rechtermuisknop opnieuw om 'area_list' te selecteren.
- Stel de Z-as omvang van het project in te stemmen met de originele electronen microscoop instellingen door rechts te klikken op het doek, en klik vervolgens op scherm en selecteer kalibratie. Stel bovendien de Z-schaal door het selecteren van alle lagen in de plug-in venster, klik met de rechtermuisknop op schaal Z en de dikte te selecteren.
- Klik en sleep de 'project' en al 'kinderen' in het project sectie om de 'gebied lijsten' onder de tab 'Z ruimte' in het doek venster te maken objecten.
- Selecteer het 'gebied list' en klik met de rechtermuisknop te selecteren en een kleur. Nu, met de kwast tool om objecten zoals mitochondriën te sporen, in de electronen microscoop beelden. Gebruik 'Shift + klik op' in een gesloten cirkel te vullen, 'Ctrl + scrollen' om in en uit te zoomen, en 'Alt + klik op' om kwast cursor veranderen in een gum.
- Kies twee gebieden van ~ 10-15 urnvan 10 - 15 urn op de linkerbovenhoek en rechteronderhoek van het beeld en identificeren van alle mitochondriën binnen deze gebieden onpartijdige bemonstering van mitochondriën in elke dataset mogelijk te maken.
- Op het 'doek', te observeren en te traceren mitochondriën het hele secties. Let op: Mitochondriën zijn vrij donker / dichte verschijnen organellen, van vergelijkbare grootte in diameter en losjes cilindrisch. De unieke cristae gevormd door de binnenste membraan zijn gemakkelijk te onderscheiden binnen dit organel.
- Wanneer u klaar bent met het traceren, klik met de rechtermuisknop op het area_list onder het tabblad Z ruimte, selecteert u 'Show in 3D'. Dit zal de 3D-viewer plugin lanceren om een 3D-reconstructie van de getraceerd afbeelding te bekijken.
- Mitochondriale volume metingen, selecteert u object in 3D-viewer uit te voeren, klikt u op het tabblad 'Edit' en selecteer 'Objecteigenschappen'. De mitochondriale volume schatting wordt vermeld samen met een aantal andere metingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We tonen aan dat de hersenen mitochondriale morfologie en grootte heterogeen van verschillende neuronale deelcompartimenten. Confocale microscopie op lage dichtheid neuronale culturen getransduceerd met lentivirus uiten van mitochondriën gerichte groen fluorescerend eiwit toonde aan dat mitochondria die woonachtig zijn in neuronale soma vormen een reticulair netwerk, terwijl die woonachtig zijn in distale neurieten vertonen een discrete langwerpig morfologie (figuur 1 AB). Met de SBFSEM techniek, de mitochondriale morfologie, grootte, hoeveelheid en verdeling werden geanalyseerd in muizenhersenen. Driedimensionale (3D) beelden van de mitochondriën werden gereconstrueerd op basis van zowel neurieten en synapsen in de hersenen van muizen hippocampus. De presynaptische mitochondriën werden geïdentificeerd en het aantal presynaptische boutons herbergen inwoner mitochondria gekwantificeerd. Heterogeniteit in de grootte van mitochondria werd waargenomen in de dendritische versus axonale compartimenten (Figuur 1 CD). Bovendien zijn veel kleine presynaptische compartimenten muizenhersenen hippocampus misten mitochondria (figuur 2 AC). De volumetrische metingen van zowel presynaptische en extrasynaptic mitochondria bleek dat het volume of de grootte van de mitochondriën die woonachtig zijn binnen de neuronale presynapses was aanzienlijk kleiner dan die woonachtig zijn in de extrasynaptic regio (figuur 2 DF). Interessant is dat de tweedimensionale (2D) grootteverdeling van mitochondria gemeten vanaf een onbevooroordeelde steekproef van 200 non-somatische mitochondriën bleek dat ~ 11% van mitochondriale fractie ligt beneden de resolutielimiet van lichtmicroscopie (figuur 2G). Daarnaast bieden de 2D-beelden overgenomen door SBFSEM analyse verhoogde resolutie naar de ultrastructurele kenmerken van de individuele mitochondria (figuur 3 AB) te visualiseren. Door de duidelijk zichtbare topografie van het weefsel, is het verder mogelijk om de cellulaire comping classificerenartment van mitochondria door het bepalen van de nabijheid van scherp omlijnd structuren zoals nucleus (somatische) en synaptische blaasjes (presynaptische) (figuur 3 AB). Om mitochondriën in de neuronale processen identificeren reconstrueren de afzonderlijke Werkwijze axon of dendriet basis van de aanwezigheid of afwezigheid van presynaptische boutons respectievelijk 42. Op basis van deze resultaten stellen wij SBFSEM is een uiterst waardevol analysetechniek mitochondriale vorm, grootte, aantal en de distributie identificeren hersenweefsel en dat eventuele defecten in grove structuur van de mitochondriën verdeling kan ook worden bepaald met deze methode. Aangezien de ultrastructurele kenmerken van de verschillende celtypes in de hersenen zijn verschillende, voor bijv. aanwezigheid van glycogeen granules in astrocyten, is het ook mogelijk de celtype-specifieke verschillen in hersenen mitochondriën analyseren.
Figuur 1:. Heterogeniteit in neuronale mitochondriale morfologie en distributie corticale culturen van postnatale dag 1 muis pups werden getransduceerd met lentivirus uiten van mitochondriën gerichte groen fluorescerend eiwit (Mito-GFP). (A) toont neuronale soma uiten van Mito-GFP, let op de reticulaire netwerk van mitochondriale morfologie; Nu = nucleus; schaal bar = 5 micrometer. (B) toont langwerpige mitochondriale morfologie in distale neurieten; schaal bar = 5 micrometer. Representatieve 2D beeld uit de SBFSEM dataset gegenereerd uit de muis hersenweefsel (C), worden de mitochondria gekleurd groen, dendrieten gekleurd met blauw en axonale varicosities gekleurd in bruin; schaal bar = 1 micrometer. (D) 3D-reconstructies van de mitochondriën in de neurieten van de muis hersenweefsel, merken het verschil in grootte tussen de dendritische en axonale mitochondria indicated door grote en kleine pijlpunt respectievelijk; schaal bar = 1 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Serial Block-face Scanning Electron Microscopy (SBFSEM) analyse bleek Lage Overvloed van Mitochondriën op presynaptische Terminals (A) Vertegenwoordiger 2D ultramicrograph uit de SBFSEM dataset analyse verkregen uit de hippocampus van P15 wild-type muizen;. schaal bar = 1 micrometer. (B) Geeft 3D-reconstructie van 10 presynaptische zenuwuiteinden. Merk op dat slechts 4 van de 10 presynaptische terminals toonde waarneembaar mitochondriën; schaal bar = 1 micrometer. (C) Bar grafiek waarin de kwantificering van 173 gereconstrueerde presynaptische zenuwuiteinden van de RvCFSEM dataset analyse. (D) Vertegenwoordiger 2D-afbeelding van SBFSEM dataset die de extrasynaptic mitochondria in blauw en presynaptische mitochondria in het groen; schaal bar = 1 micrometer. (E) 3D-reconstructies van de presynaptische en extrasynaptic mitochondria van de SBFSEM dataset met de software; schaal bar = 1 micrometer. (F) staafdiagram dat de hoeveelheid extrasynaptic en presynaptische mitochondria. Gegevens worden uitgezet als gemiddelde ± SEM; n = 3 verschillende datasets (inclusief 62 presynaptische mitochondria en 80 extrasynaptic mitochondria in totaal); * Geeft p-waarde = 0,0405. (G) A 15 bij 15 micrometer gebied in alle vier de hoeken van de foto's werden gekenmerkt en alle niet-somatische mitochondriën werden geïdentificeerd aan aselecte steekproef mogelijk te maken. De minst dimensie van ~ 200 mitochondria werd gemeten. Pasteigrafiek blijkt dat ~ 11% van de niet-somatische mitochondriën <200 nm in afmeting die onder de resolutiegrens van lichtmicroscopie. Dit cijfer heeft bEen aangepast van Chavan et al 27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: 2D SBFSEM Beelden van de laterale geniculate kernen van de hersenen van muizen (A) Twee dimensionaal beeld vertegenwoordiger SBFSEM van de laterale geniculate kernen (8/8 pm) tonen een gedetailleerde topografie van de regio.. Soma en nucleus zijn aangegeven; schaal bar = 2 micrometer. (B) een vergroting van de door rode vierkant in panel A. Merk op dat de buitenste en binnenste membraan van de mitochondriën en cristae vorming zijn duidelijk zichtbaar gebied. De topografie en relaties met andere organellen en cellulaire structuur wordt ook waargenomen. PS duidt voorbeeld van presynaptische mitochondriaen NS geeft voorbeeld van niet-synaptische (NS) somatische mitochondriën; schaal bar = 1 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De complexiteit van het zenuwstelsel moeilijk na te reconstrueren grote weefselvolumes en analyseren van de morfologie en de verdeling van organellen zoals mitochondriën met voldoende resolutie. Meerdere cellen waaronder neuronen, oligodendrocyten en astrocyten met talrijke processen verlengd driedimensionaal communiceren in het hersenweefsel 43. Omdat mitochondriën bevindt zowel in de soma van cellen en distale processen, mitochondriale morfologie uiterst pleomorf in het zenuwstelsel (figuur 1). Adequate 3D structurele informatie met voldoende resolutie dan ook niet door middel van conventionele lichtmicroscopie technieken zoals confocale of twee-foton microscopie 44,45 kunnen worden verworven. Elektronenmicroscopie is de enige momenteel beschikbare techniek die reconstructie van grote hoeveelheden zenuwweefsel met een voldoende hoge resolutie mogelijk maakt. Traditioneel, 3D-reconstructie van zenuwweefsel is te bereikend door seriële sectie transmissie elektronenmicroscopie (sstem) van ultradunne secties 29. Echter, recente technologische vooruitgang de kwaliteit volume elektronenmicroscopie data acquisitie en automatisering verbeterd.
SBFSEM is een geautomatiseerd blok-face beeldvormende techniek welke seriële snijden binnen de kamer van een aftastende elektronenmicroscoop combineert om 3D weefselstructuur over honderden micrometers te reconstrueren, met een resolutie die voldoende is om de dunste cellulaire processen volgen en identificeren van kleine organellen . Deze techniek heeft opengesteld het vooruitzicht van routinematig reconstrueren zowel ongewervelde dieren en gewervelde zenuwstelsel. Het gaat om meerdere stappen met inbegrip van steekproefsgewijze voorbereiding, scanning elektronenmicroscoop operatie, data-acquisitie, het post-processing, en beeldanalyse. Deze procedures vereisen gespecialiseerde hands-on training en certificering voor scanning elektronenmicroscoop operatie. Drie factoren zijn criticusal dwz. het ontleden van de juiste hersenen anatomische regio, het verkrijgen van hoge resolutie beelden, en het uitvoeren van de juiste beeldanalyse. Na het ontleden van de anatomische regio van belang uit de vibratome stukje vaste hersenweefsel, is het cruciaal om de foto te maken voor het behoud van een goede oriëntatie. Het kan anders moeilijk zijn om de juiste plaats voor beeldvorming bepalen. Het verkrijgen van hoge resolutie beelden hangt af van adequate fixatie en goede post-fixing kleuring procedures. De hersenen neigt snelle verslechtering ondergaan de ultrastructuur na de dood. Daarom is het essentieel om de hersenen in een glutaaraldehyde oplossing hanteer transcardial perfusie methode vaststellen. Dit moet worden gevolgd door verdere fixatie van de hersenen glutaaraldehyde oplossing gedurende tenminste 24 uur. Omdat de beeldresolutie is volledig afhankelijk van de combinatie van een aantal zware metalen kleuring methoden, is het essentieel om de post-fixing methode volgen zoals beschreven in het protocol bij quantifiabl verwervene beelden. Oplossingen moeten worden gemaakt zoals beschreven in de werkwijzen. Tot slot, voor een nauwkeurige beeldanalyse het organel / s te analyseren moet ondubbelzinnig geïdentificeerd (bv. Door het visualiseren van ultrastructurele kenmerken) voor het opsporen en de richtlijnen software moet strikt worden nageleefd. De resolutie van de verkregen beelden worden bekend conversie van pixels nanometer volumetrische metingen.
Naast de software in het protocol beschreven voor het uitvoeren van beeldanalyse, kunnen andere beschikbare software zoals Reconstructie en Knossos worden gebruikt. Hoewel de nadruk van het beschreven protocol is het bekijken mitochondriën in het zenuwstelsel, kan worden gemodificeerd om hoge resolutie 3D-gegevens over verschillende andere subcellulaire structuren (bijv. Endoplasmatisch reticulum, lysosomen, enz.) In verschillende weefsels te genereren.
Terwijl een gedetailleerde gids voor het oplossen van problemen scanning elektronenmicroscoop operation valt buiten het bestek van dit artikel (zie instrument gebruikershandleidingen en training informatie), een paar problemen routinematig optreden tijdens beeldvorming experimenten en te begrijpen hoe het oplossen van problemen te kunnen nieuwe gebruikers of mensen om beelden te verkrijgen door middel van samenwerking / commerciële bronnen te helpen. Een veelvoorkomend probleem is het opladen van de steekproef die voornamelijk voorkomt in hars regio's die weinig of geen gekleurde materiaal bevatten. In een "positieve" image (dwz. Cytosol verschijnt wit), de kernen, bloedvaten, en lege hars uitgestrekte kan verschijnen "zwart". Daarnaast opladen bevordert ook de lokale balk drift wat resulteert in duidelijke afbeelding kromtrekken. Mogelijke oplossingen variëren tussen de instrumenten en samples. Het verminderen van kV instellingen vermindert het "zwart worden" artefact, maar kan meer beam drift te promoten. Met behulp van een lager vacuüm-modus, en met inbegrip van stikstof (N2) gas, waterdamp, enz. in de kamer vermindert ook opladen, maar tegen aanzienlijke kosten resolutie en Signal-ruisverhouding. Een tweede veel voorkomend probleem is mes overslaan. Langzamer scannen kan beam veroorzaakte schade aan het blok oppervlak, die ongelijkmatig of niet snijdt helemaal voor sommige beeldvorming / snijden cycli veroorzaken (bijv. Opeenvolgende beelden verschijnt hetzelfde). Verschillende oplossingen bestaan, waaronder het verhogen van de zaagdiepte / plakdikte met verminderde z-resolutie, het verhogen scansnelheid en als gevolg daarvan te aanvaarden luidruchtiger beelden, waardoor de pixelgrootte en het accepteren van een lagere x / y-resolutie, en het kiezen van monsters of gebieden met meer intense kleuring (als slecht -stained gebieden meer in rekening brengen, schade gemakkelijker, en vereisen een langere blootstelling balk om beelden met aanvaardbare krijgen signaal-ratio -Noise). Puin wederafzetting op het blok-gezicht is af en toe een bron van artefact in beelden, en als dit gebeurt vaak hij kan verlangen pauzeren van de overname, en zorgvuldig schoonmaken van het mes (blazen lucht), of retrimming het monster naar een kleiner formaat. Block-face opladen bevordert ook opnieuw afzetten, en bovenstaande stappen meihulp. Correctie van focus en stigmation kan ook nodig zijn als de microscoop beelden monsters continu gedurende vele uren tot weken, gedurende welke tijd het vacuüm diepte toeneemt in de kamer, die stigmation correcties. Elke scanning elektronenmicroscoop verschilt naargelang de leeftijd en kenmerken, en de ervaring is de beste gids. Plotselinge dramatische veranderingen in stigmation of de focus kan optreden wanneer doorgesneden materiaal hecht aan de microscoop imaging componenten. De kamer moet worden geopend en materiaal zorgvuldig losgemaakt door middel van vacuüm of samengeperste stikstof. Dit vereist absoluut gespecialiseerde opleiding.
Er zijn een aantal nadelen van SBFSEM technologie met betrekking tot zijn bruikbaarheid bij het analyseren hersenen mitochondriën. Een groot nadeel voor alle microscopie van gefixeerde weefsels, is dat het statische afbeeldingen een zeer dynamisch organel. Mitochondriën ondergaan continue kernsplijting en kernfusie cycli 26, zijn mobiel en verhandeld langs de neurite 21 verwerkt. Defecten in mitochondriale handel en dynamiek die niet zuiver numerieke of structurele kunnen gemakkelijk worden gemist door deze benadering, hoewel door te kijken naar het aantal mitochondria in een anatomisch gedefinieerde ruimte zoals presynapse men kan interpreteren als het transport van mitochondriën kan worden gewijzigd 39 . Een tweede nadeel is dat het alleen uitgevoerd in een klein deel van de hersenen, dus schakelingen specifieke defecten in het mitochondriaal verdeling kan worden gemist. Correlatieve nadert 28,46 in de gelegenheid om de confocale beeldvorming en multi combineren met SBFSEM technologie om de moleculaire en ultrastructurele genereren. Voor mitochondriale analyse derhalve kan het nuttig zijn om de SBFSEM voeren na lichtmicroscoop onderzocht hersensecties hetzij via het mitochondriale antigeenspecifieke antilichaam of door een transgen tot expressie die op mitochondriën gerichte fluorescent eiwit. dit gecombinenal strategie kan een robuuste methodiek om mitochondriale gebreken te identificeren in muismodellen van neurologische en mitochondriale aandoeningen.
Er zijn ook technische beperkingen door het gebruik van agressieve fixatieven, heavy metal kleuring en ongelijke doordringing van chemicaliën bij veel vormen van elektronenmicroscopie. Andere beperkingen kunnen voortvloeien uit de plastic inbedding van weefselmonsters. Lege gebieden hars en dun lood structuren behouden elektronen tijdens beeldvorming, bundelafbuiging en drift (beeld kromtrekken) en kunstmatig laden signalen (bijv. Donkere kernen en bloedvatlumen), die zowel van invloed op de resolutie veroorzaken. Beam schade aan de hars bevordert ook ongelijk snijden, en daarom, beeldvorming vereist gewoonlijk plakjes 50 - 100 nm van het blok-face te snijden, die niet-isotrophic voxels in de datasets. Andere beperkingen voor sommige toepassingen zijn onder meer dat de secties worden vernietigd en kan nadien niet worden herzien,welke gebruikers kunnen dwingen om het verzamelen van hoge resolutie beelden van de gebieden die nuttige gegevens niet kunnen bevatten.
Een groot voordeel is dat het SBFSEM automatiseert het snijden en beeldvorming blokken weefsel doordat een aangepaste microtoom in een laagvacuüm SEM kamer 32,33. Omdat de beelden rechtstreeks uit het blok-face voorafgaand aan elke snede worden verkregen, worden de problemen van de sectie rimpels, compressie en verlies tijdens de behandeling aanzienlijk vermeden, hoewel puin depositie en kromtrekken als gevolg van te blokkeren-face opladen bijdragen aan een aantal beeldverlies en vervorming . Voorts worden de verkregen ruwe datasets beelden reeds uitgelijnd en vereisen slechts micrometer schaal registratie overzenden drift geschikt om vatbaar voor de meeste analyses worden. Door de geautomatiseerde snijbeweging, zodra het vacuum gestabiliseerd, grote hoeveelheden weefsel worden afgebeeld zonder significante betrokkenheid operator. Er zijn vele voordelen van het gebruik van dezetechnologie uitvoeren morfologische en kwantitatieve studies over organellen en intracellulaire structuren. Een voordeel is het verkrijgen van de informatie over 3D structuur van mitochondria binnen een redelijke tijd. De beschikbaarheid van open source reconstructie software pakketten zoals Reconstruct 47, TrakEM 48 en Knossos 49-51 hebben deze technologie een krachtig analytisch hulpmiddel, waar gedetailleerde 3D ultrastructuur van neuronale netwerk van experimentele diermodellen direct vergeleken kunnen worden gemaakt. De semi-automatische en volledig automatische beeldanalyse komt 52 waarschijnlijk sterk mechanistische gegevens bij dieren waar de mitochondriale morfologie, functie en / of biogenese zullen naar verwachting worden beïnvloed. Eerder SBFSEM analyse werd sterk gehinderd door lagere resolutie, hebben echter nieuwere monstervoorbereiding technieken met verbeterde kleuringen 40 aanzienlijk de resolutie in een mate verbeterd dat zelfs een enkele synaptische vesicle kan eenvoudig worden opgelost. Bij deze resolutie ultrastructurele defecten in mitochondria als vacuolisatie, membraan verstoring en verlies van cristae gemakkelijk kan worden waargenomen, en de verdeling van defecte mitochondriën in de cel kan worden vastgesteld 38,39. De hoge resolutie van deze techniek een belangrijk voordeel boven lichtmicroscopie waarbij de resolutie beperkt tot ~ 200 nm XY-as en ~ 500 nm in Z-as. Mitochondriën zijn dus net aan de resolutie limiet van lichtmicroscopie 53. Hoewel de mitochondria met afmetingen beneden de resolutie limiet nog kan worden gevisualiseerd door lichtmicroscopie, de afmetingen niet betrouwbaar kan worden gemeten. Belangrijker is dat mitochondria die worden gescheiden door een afstand beneden de resolutielimiet van een lichtmicroscoop niet worden opgelost door lichtmicroscopie. Een ander voordeel is dat de mitochondriale structurele analyse kan worden uitgevoerd binnen het kader van het weefsel, zonder isolatie van het organel. Dit kan allaag voor een passende vergelijking in het weefsel op basis van mitochondriale lokalisatie, voor bijvoorbeeld axonale vs. somatische en / of dendritische mitochondria. Een bijkomend voordeel is dat het gewoonlijk mogelijk om te bepalen of de mitochondriën neuronale of neuroglial in lokalisatie door de processen definieert een organel zoals gliale filamenten en glycogeen voor astrocyten of oligodendrocyten voor myeline. De processen van neuronen en neurogliacellen vaak in de nabijheid en met 2D zoals benaderingswijzen TEM kan het moeilijk zijn toewijzen Betrouwbaar welke processen neuronale en die neuroglial zijn.
Concluderend, de SBFSEM technologie zorgt stapels seriële beelden die weefselgebieden 20 - 1000 urn in grootte met ultrastructurele resolutie van 5 - 10 nm of hoger, waarbij de centrale zenuwstelsel cellen en organellen zoals mitochondriën toestaat af te beelden, gemeten en gereconstrueerd . In dit artikel hebben we provided aantal praktische benaderingen om gebruik van deze technologie. Toekomstige toepassingen omvatten het analyseren van de structuur van de mitochondriën verspreiding in verschillende diermodellen van neurologische ziekten zoals neurologische en neurodegeneratieve ziektemodellen en analyse van de verschillende subcellulaire ultrastructures zoals endoplasmatisch reticulum, kern en / of lysosomen in gehele cellen of weefsels, onder gezonde en ziektetoestanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
| Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
| Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
| Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
| Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
| Tannic Acid | EMS | 21700 | |
| Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
| Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
| Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
| Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
| Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
| EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
| Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
| Ethanol | EMS | 15055 | |
| Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
| Embedding Mold | EMS | 70907 | |
| Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
| Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
| Razor | EMS | 72000 | |
| Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
| Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
| In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
| Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
| Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
| ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
| http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
| http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
| http://fiji.sc/TrakEM2 | |||
References
- Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
- Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
- Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
- Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
- Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
- Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
- Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
- Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
- Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
- Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
- Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
- Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
- Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
- DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
- DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
- Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
- Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
- Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
- Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
- Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
- Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
- Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
- Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
- Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
- Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
- Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
- Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
- Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
- Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
- Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
- Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
- Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).
