مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

ملخص

الانقسام الحي أمر بالغ الأهمية لكل كائن حي وغالبا ما تؤدي العيوب إلى السرطان واضطرابات النمو. باستخدام بروتوكول التصوير هذا وسمك الزرد كنظام نموذجي ، يمكن للباحثين تصور الانقسام في كائن فقاري حي والعديد من العيوب التي تنشأ عندما تكون العمليات الانقسامية معيبة.

الملخص

الانقسام أمر بالغ الأهمية للنمو العضوي والتمايز. عملية ديناميكية للغاية ويتطلب أمرت الأحداث لتحقيق التكثيف السليم لونين، التعلق أنيبيب الحيز الحركي، العزل الصبغي، والانقسام السيتوبلازمي في فترة زمنية صغيرة. أخطاء في عملية حساسة يمكن أن يؤدي إلى الأمراض التي تصيب البشر، بما في ذلك العيوب الخلقية والسرطان. الأساليب التقليدية التحقيق الحالات المرضية الإنقسامية الإنسان غالبا ما تعتمد على أنظمة زراعة الخلايا، التي تفتقر إلى علم وظائف الأعضاء الطبيعي والتنموي / السياق الأنسجة محددة المفيد عند دراسة الأمراض التي تصيب البشر. هذا البروتوكول يتغلب على العديد من العقبات من خلال توفير وسيلة لتصور، مع ارتفاع القرار، وديناميات كروموسوم في النظام الفقاريات، الزرد. هذا البروتوكول سوف بالتفصيل النهج التي يمكن استخدامها للحصول على صور ديناميكية تقسيم الخلايا، والتي تشمل: النسخ في المختبر، وتربية الزرد / جمع ودمج الجنين، والوقت الفاصل بين التصوير. تحسين وmodifيتم استكشاف أيضا ications من هذا البروتوكول. باستخدام H2A.F / Z-EGFP (تسميات لونين) وmCherry-CAAX (تسميات غشاء الخلية) الأجنة حقن الرنا المرسال، الانقسام في AB-النوع البري، auroraB ^{hi1045، وhi2865} esco2 هو تصور الزرد متحولة. عالية الدقة التصوير الحي في الزرد يسمح احد لمراقبة mitoses متعددة لقياس إحصائيا العيوب الإنقسامية وتوقيت تطور الإنقسامية. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ مراقبة الجوانب النوعية التي تحدد العمليات غير لائقة الإنقسامية (أي عيوب congression، missegregation من الكروموسومات، الخ) ونتائج الكروموسومات غير لائق (أي عدم توازن الصبغيات، تعدد الصيغ الصبغية، النويات، وما إلى ذلك). هذا الاختبار يمكن تطبيقها على مراقبة الأنسجة التمايز / التنمية وغير قابلة للاستخدام الزرد متحولة وكلاء الدوائية. تصور كيف عيوب في الانقسام تؤدي إلى السرطان والتنموية اضطرابات سوف كثيراتعزيز التفاهم من التسبب في المرض.

المقدمة

الانقسام هو الحاسم الخلوي ضروري عملية النمو، والتمايز، وتجديد في الكائن الحي. على إعداد دقيق وتكرار الحمض النووي في الطور البيني، وكانت سببا في الخلية للقسمة. وبدأت المرحلة الأولى من الانقسام، الطور، من خلال تفعيل السيكلين B / Cdk1. يتميز الطور الأول من التكثيف من مادة الكروماتين في الكروموسومات. يحدث المغلف انهيار النووي في الانتقال بين الطور الأول وطليعة الطور التالي. في طليعة الطور التالي، جسيم مركزي، ومركز نواة للتشكيل المغزل، والبدء في الهجرة إلى أقطاب المعاكس في حين تمتد الأنابيب الدقيقة بحثا عن التعلق الحيز الحركي. عند الإلحاق، والتحويلات لوضع حد على التعلق أنيبيب وقوات التوتر توجيه الكروموسومات تشكيل لوحة الطورية ^1....

البروتوكول

1. النسخ في المختبر

1. خطي pCS2-H2A.F / Z-EGFP و / أو ناقلات pCS2-mCherry-CAAX من تقييد نوتي هضم انزيم ^31. باستخدام الحمض النووي الريبي في عدة نسخ في المختبر، وتوليد 5 "المنتجات مرنا توج من كل قالب، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
2. تنقية مرنا توج باستخدام طقم تنقية. اتبع تعليمات الشركة الصانعة. أزل مع ريبونوكلياز خالية H ₂ O.
3. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي الامتصاصية في 260 نانومتر باستخدام مطياف....

النتائج

يوضح الشكل (2) القدرة على مراقبة العديد من الانقسامات الخلوية باستخدام طريقة عرض حقل واسع من AB البرية من نوع الذيل الزرد. يتم تصوير أكثر من سبع خلايا الإنقسامية في إطار زمني 14 دقيقة (فيلم 1). خلال العامين ساعة الوقت طبعا، تم القبض على أكثر من 40 أحداث الإنقسامية. في المتوسط، لوحظت 50 تقسيم الخلايا في AB و 30 تقسيم الخلايا في أور ب الأجنة ^{م / م} (الشكل 2B). لحساب .......

المناقشة

استخدام هذا الأسلوب يسمح احد لاستنتاج انهيار النووي المغلف، وتشكيل لوحة الطورية بواسطة إرفاق ملفات-أنيبيب الحيز الحركي، والفصل بين الصبغي الشقيقة لتشكيل لجنتين خلايا جديدة في الجسم الحي وبطريقة تعتمد على الوقت. القدرة على مراقبة الانقسام في الزرد هو مفيد على عينات الثابتة وأنظمة زراعة الخلايا ليتم تصوير الخلايا في علم وظائف الأعضاء الطبيعي، والأنسجة شفافة والذي يسمح لالبروتينات الفلورية لاستخدامها، وتطوير سريع نسبيا، والوقت الفاصل بين التصوير يمكن الحصول عليها. ويقتصر است.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ناقلات pCS2	هدية من K. Kwan		للحصول على البلازميد ذي الأهمية
NotI-HF إنزيم تقييد	New England BioLabs	R3189S	لتقييد هضم مجموعة البلازميد
mMessage SP6	Life Technologies	AM1340	ل in vitro < / em>
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	لتنقية mRNA
100 × 15 مم أطباق بتري	فيشر FB0875712 العلمي		لإسكان الأجنة قالب
الحقن المجهري	محلي الصنع		لحمل الأجنة أثناء الحقن المجهري
Agarose II	Amresco	0815-25G	لتضمين الأجنة
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521-10G	لتخدير الأجنة
كلوريد الصوديوم	Sigma-Aldrich	S9888	بالنسبة لمياه الجنين (E3 Blue) ، مذاب في UltraPure H2< / sub>O
كلوريد البوتاسيوم	Sigma-Aldrich	P3911	لمياه الجنين (E3 Blue) ، مذاب في UltraPure H2< / sub>O
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات	سيجما-ألدريتش	C8106	لمياه الجنين (E3 Blue) ، مذاب في UltraPure H2< / sub>O
كبريتات المغنيسيوم	فيشر Scientific	M7506	لمياه الجنين (E3 Blue) ، مذاب في UltraPure H2< / sub>O
Methylene Blue Hydrate	Sigma-Aldrich	MB1	لمياه الجنين (E3 Blue) ، مذاب في UltraPure H2< / sub>O
أنبوب ثقافة 100 مم	فيشر ساينتفيك	50-819-812	للأجار الذائب
35 مم غطاء زجاجي أسفل طبق ثقافة   ؛	ماتيك كورب	P35G-0-20-C	رقم 0 ، زجاج 20 مم ، لتضمين الأجنة
# 5 ملاقط	Dumont	72701-D	للأجنة المفككة
21 G 1 1/2 إبرة قياس	Becton Dickinson	305167	لتحديد موضع الأجنة في مجهر تشريح أجار
	نيكون AZ100		لفحص الأجنة وتضمينها ، فإن أي نطاق تشريح سيقوم بعمل
مجهر متحد البؤر	نيكون A1 +		لبرنامج التصوير بفاصل زمني
البؤر	عناصر NIS AR 4.13.00		للحصول على الصور ومعالجتها

نسخ متحد