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VACUSIP, une méthode Inex améliorée pour Published: August 3, 2016 doi: 10.3791/54221
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 1
1Department of Marine Ecology, Centre d’Estudis Avançats de Blanes (CEAB-CSIC), 2Department of Marine Biology and Oceanography, Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC), 3The School of Marine Science, Ruppin Academic Center

Introduction

Suspensivores benthiques jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement des écosystèmes marins 1. En filtrant grands volumes d'eau 2,3, ils enlèvent et excrètent particules (plancton et détritus) et des composés dissous 1 (et les références qui y sont) et sont un important agent de benthique-pélagique couplage 4,5 et cycle des éléments nutritifs 6,7. La mesure précise les particules et les composés dissous enlevés et excrétés par suspensivores benthiques (tels que les éponges, les ascidies, les polychètes et bivalves) est fondamentale pour comprendre leur physiologie, le métabolisme et l'écologie alimentaire. Ensemble avec le pompage de mesures de vitesse, il permet également une quantification des flux d'éléments nutritifs médiées par ces organismes et leur impact écologique sur la qualité de l'eau ainsi que sur les processus à l'échelle de l'écosystème.

Le choix de la méthode appropriée de mesure de retrait et les taux de production de particules et de com dissouslivres par suspension filtreurs est cruciale pour obtenir des données fiables concernant leur activité d'alimentation 8. Comme l'a souligné Riisgård et d'autres, les résultats inappropriés méthodes de polarisation, fausser les conditions expérimentales, produire des estimations erronées de l'ingestion et l'excrétion de certaines substances, et peut conduire à une quantification erronée des flux de nutriments transformés par ces organismes.

Les deux méthodes les plus fréquemment employées pour mesurer les particules et les flux de nutriments dissous dans filtreurs impliquer soit incubation (techniques indirectes) ou la collecte simultanée de la température ambiante et de l'eau exhalé (techniques directes). Techniques d'incubation reposent sur ​​la mesure de la vitesse de variation de la concentration de particules et d' éléments nutritifs dissous dans de l'eau mis à incuber, et l' estimation des taux de production ou de retrait par rapport aux contrôles adéquats 8. Cependant, enfermant un organisme dans une chambre d'incubation peut modifier sa feeding et le pompage de comportement en raison de changements dans le régime d'écoulement naturel, en raison d'une baisse de l'oxygène et / ou de la concentration de la nourriture, ou en raison de l' accumulation de composés d'excrétion dans le 7,9 de l' eau d'incubation (et les références qui y sont). En plus des effets de confinement et de l' approvisionnement en eau modifié, un biais majeur des techniques d'incubation découle des effets re-filtration (voir par exemple 10). Bien que certains de ces problèmes méthodologiques ont été surmontés en utilisant le bon volume et la forme de la cuve d'incubation 11 ou avec l'introduction d'un système cloche recirculation in situ 12, cette technique sous - estime souvent retrait et les taux de production. Quantifiant le métabolisme des composés dissous tels que l' azote organique dissous (DON) et du carbone (COD) ou de nutriments inorganiques, est avérée être particulièrement sujettes à des biais causés par des techniques d'incubation 13.

À la fin des années 60 et au début des années 70, Henry Reiswig9,14,15 pionnier de l'application de techniques directes pour quantifier l' élimination des particules par des éponges géantes des Caraïbes, en échantillonnant séparément l'eau inhalée et exhalée par les organismes in situ. En raison de la difficulté d'appliquer la technique de Reiswig sur les petits suspensivores et dans des conditions sous - marines les plus difficiles, la majeure partie de la recherche dans ce domaine a été limité au laboratoire (in vitro) employant principalement des techniques d'incubation indirectes 16. Yahel et ses collègues réaménagées Reiswig de technique directe in situ pour travailler dans des conditions plus petite échelle. Leur méthode, appelée Inex 16, est basée sur l' échantillonnage sous - marine simultanée de l'eau par inhalation (In) et exhalé (Ex) par des organismes non perturbées. La concentration différente d'une substance (par exemple des bactéries) entre une paire d'échantillons (iNEX) fournit une mesure de la rétention (ou la production) de cette substance par l'animal. La technique Inex emploie tubes ouvertes etrepose sur le jet excurrente produit par l'activité de pompage de l'organisme étudié pour remplacer passivement l'eau ambiante dans le tube collecteur. Alors que Yahel et ses collègues ont appliqué avec succès cette technique dans l'étude de plus de 15 suspension différents alimenteurs taxa (par exemple, 17), la méthode est limitée par le niveau élevé de la pratique et l' expérience requises, par la taille minuscule de certains orifices de exhalant, et par les conditions de mer.

Pour surmonter ces obstacles, nous avons développé une technique alternative basée sur l'aspiration contrôlée de l'eau prélevée à travers des tubes minute (diamètre extérieur <1,6 mm). Notre objectif était de créer un dispositif simple, fiable et peu coûteux qui permettrait propre et contrôlée dans l' échantillonnage de l' eau in situ à partir d' un point très précis, tels que l'orifice exhalant des suspensivores benthiques. Pour être efficace, la méthode doit être non intrusive afin de ne pas affecter le régime d'écoulement ambiante ou modifier le behavior des micro-organismes étudiés. Le dispositif présenté ici est appelé VACUSIP. Il est une simplification du système SIP développé par Yahel et al. (2007) 18 pour l' échantillonnage de point de base-ROV dans la mer profonde. Le VACUSIP est beaucoup moins cher que le SIP original et il a été adapté pour le travail à base de SCAPHANDRE. Le système a été conçu selon les principes présentés et testés par Wright et Stephens (1978) 19 et Møhlenberg et Riisgård (1978) 20 pour les paramètres de laboratoire.

Bien que le système VACUSIP a été conçu pour des études in situ du métabolisme des suspensivores benthiques, il peut également être utilisé pour des études de laboratoire et où, un échantillon d'eau de source ponctuelle contrôlée et propre est nécessaire. Le système est particulièrement utile lorsque l' intégration sur des périodes prolongées (min-heures) ou en filtrations in situ sont nécessaires. Le VACUSIP a été utilisé avec succès au laboratoire Yahel depuis 2011, et a égalementété employé dans deux études récentes de flux de nutriments médiées par espèces d'éponges des Caraïbes et de la Méditerranée 21 (Morganti et al. soumis).

L'utilisation des échantillonneurs spécifiques, la durée d'échantillonnage prolongée, et les conditions sur le terrain, dans lequel VACUSIP est appliqué, entraîne certains écarts par rapport à des protocoles standards océanographiques pour la collecte, le filtrage et le stockage d'échantillons pour les analytes sensibles. Pour réduire le risque de contamination par le système VACUSIP ou le risque de modification de l'eau prélevée par l' activité bactérienne après la collecte, nous avons testé différentes dans les procédures de filtration et de stockage in situ. Dispositifs différents de filtrage, des navires de collecte, et les procédures de stockage ont été examinés afin de parvenir à la technique la plus appropriée pour l'analyse des inorganique dissous (PO 4 3-, NO x -, NH 4 +, SiO 4) et organique (DOC + DON) composés et ultra-plancton (<1081; m) et organique particulaire (POC + PON) échantillonnage. Afin de réduire davantage le risque de contamination, en particulier dans des conditions de terrain, le nombre d'étapes de manipulation est réduite au strict minimum. Le format visuel dans lequel la méthode est présentée est orientée pour faciliter la reproductibilité et de réduire le temps nécessaire pour appliquer efficacement la technique.

Présentation du système

À échantillonner dans l' eau in situ pompée à partir alimentateur suspension avec des orifices exhalants aussi petits que 2 mm, l'activité de pompage de chaque échantillon est d' abord visualisée en libérant filtré fluorescéine teint l' eau de mer à proximité de l'orifice (s) de substances volatiles et en observant son écoulement depuis l'ouverture de excurrente 16 (voir aussi la figure 2B en 18). L'eau inspiré et expiré par l'échantillon d'étude (incurrent et exhalant) sont ensuite échantillonnés en même temps que l'utilisation d'une paire de tubes minuscules installées sur manipulateur sur mesure ou sur deux de «arms "d'un trépied portable souple envers (Figure 1 et complémentaire vidéo 1). L'eau est inhalé par l'organisme d'étude est recueilli en positionnant soigneusement l'extrémité proximale d'un tube à l' intérieur ou à proximité de l'ouverture inhalant de l'organisme d'étude. Un identique tube est ensuite placé à l' intérieur de l'orifice exhalant. Cette opération nécessite bien soin d'éviter tout contact ou de perturbation de l'animal, par exemple, par la remise en suspension des sédiments. pour commencer l'échantillonnage, un plongeur perce une cloison dans le récipient collecteur avec une aiguille de seringue attachée à la l'extrémité distale de chaque tube, permettant à la pression externe de l'eau pour forcer l'eau prélevée dans le récipient à travers le tube d'échantillonnage. l'aspiration est initiée par le vide créé au préalable dans le flacon et par la différence de pression entre l'eau externe et le récipient d'échantillon évacué .

Afin d'assurer une collecte d'eau propre exhalé et d'éviter l'aspiration accidentelle de ambieau ent 16, le taux d'échantillonnage de l' eau doit être maintenue à un taux significativement plus faible (<10%) que le débit exhalant. Le débit d'aspiration est commandé par la longueur du tube et son diamètre interne (ID). Le petit diamètre interne assure également un volume mort négligeable (<200 pi par mètre de tube). Échantillonnage sur des périodes prolongées (minutes à quelques heures) permet d'intégrer la microrépartition inhérente à la plupart des substances d'intérêt. Pour veiller à ce que les échantillons soient correctement conservés dans des séances d'échantillonnage sous - marines prolongées, ainsi que pour le transport au laboratoire, une filtration in situ est recommandé pour les analytes sensibles. La sélection des navires d'échantillonnage, l'assemblage de filtration, et les tubes sont dictées par les organismes d'étude et la question de recherche spécifique. Le protocole décrit ci - dessous suppose que le profil métabolique complet est d'intérêt (pour un aperçu voir la figure 2). Cependant, la nature modulaire du protocole permet fou une modification facile à adapter les régimes plus simples, voire très différents échantillonnage. Pour un profil métabolique complet, le protocole d'échantillonnage doit comprendre les étapes suivantes: (1) Visualisation de l'écoulement; (2) L'échantillonnage ultra-plancton alimentation (plancton <10 um); (3) Échantillonnage nutriments inorganiques absorption et de l'excrétion (en utilisant les filtres en ligne); (4) Échantillonnage dissous l'absorption biologique et de l'excrétion (en utilisant des filtres en ligne); (5) l'alimentation des particules et de l'excrétion (en utilisant les filtres en ligne); (6) Répétez l'étape 2 (ultra-plancton alimentation en contrôle de la qualité); (7) Visualisation de l'écoulement.

Quand logistiquement possible, il est recommandé que les mesures de profils métaboliques sont combinés avec des taux de pompage (par exemple, le procédé de teinture vitesse avant, en 16), ainsi que des mesures de respiration. Ces mesures sont plus prises au début et à la fin de la session d'échantillonnage. Pour la mesure de la respiration, optodes sous-marines ou des micro-électrodes sont préférables.

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Protocol

1. Etapes préparatoires et de nettoyage Procédures

  1. Solution de nettoyage
    1. Porter un équipement de protection, une blouse de laboratoire, et des gants en tout temps. Effectuer ces étapes préparatoires dans un espace propre exempt de poussière et de fumée.
    2. Préparer une solution chlorhydrique 5-10% d'acide (HCl) avec des produits frais, de haute qualité, de l'eau distillée deux fois.
    3. Préparer un mélange de 5% de base très soluble de la solution de tensioactif anionique et non-ionique (Voir liste des matières) avec des produits frais, de haute qualité, de l'eau distillée deux fois.
    4. Stockez toutes les solutions en propre, lavé à l'acide des conteneurs.
  2. Les étapes préparatoires et les procédures de nettoyage (en laboratoire)
    NOTE: Si les composés du phosphore ne sont pas d'intérêt, le lavage HCl peut être remplacé par une qualité élevée de l' acide phosphorique (H 3 PO 4) lavage (8% H 3 PO 4 concentration finale).
    1. Porter un équipement de protection, une blouse de laboratoire, et des gants en tout temps.
    2. lavagel'appareil d'échantillonnage (à l'exclusion de l'acier inoxydable Swinney support en ligne de filtre) avec une quantité abondante d'eau de haute pureté. Laissez l'appareil trempage dans une solution de HCl 5-10% durant la nuit. Rincer à nouveau l'appareil avec un grand nombre de haute qualité de l'eau distillée deux fois.
    3. Laver les porte-filtres Swinney en acier inoxydable en ligne avec une quantité abondante d'eau de haute pureté. Laisser les supports de filtres de trempage dans 5% de mélange de base hautement soluble de la solution de tensioactifs anioniques et les tensioactifs non ioniques pendant une nuit. Rincez-les à nouveau avec un grand haute qualité de l'eau distillée deux fois.
    4. Sécher tout l'appareil d'échantillonnage, les envelopper dans du papier d'aluminium et de garder dans une boîte propre jusqu'à l'utilisation.
  3. Contrôle de la vitesse d'aspiration
    1. Contrôler la fréquence d'échantillonnage en ajustant la longueur et le diamètre intérieur de la tubulure d'admission en fonction de la profondeur de travail prévue et la température de l'eau. Utilisez l'équation suivante (dérivée de l'équation de Hagen-Poiseuille utilisé pour pleinement develmis au courant de la conduite laminaire) comme guide: L'équation 1 où F = débit (cm 3 min -1), AP = différence de pression (bar), r = tubulure d' admission de rayon interne (cm) K = 2,417 x 10 -9 (s -2), L = longueur du tube (cm ) V = viscosité de l' eau (g cm -1 s -1). Voir le tableau 1 pour plus de détails.
    2. Gardez le taux d'échantillonnage en dessous de 1% du taux de l'animal étudié de pompage.
      NOTE: L'utilisation de récipients sous vide, parfois avec un vide inconnu pose des complications supplémentaires. Par conséquent, un essai sur le terrain est fortement recommandé. À 10 m de profondeur et de ~ 22 ° C , l' eau de mer (40 PSU), une tubulure d' entrée de 50 cm avec un diamètre interne de 254 um délivre un débit d'aspiration moyen de 26 pi ~ s -1 (1,56 ml -1 min).
  4. Navires d'échantillonnage
    1. Pour les petits échantillons de volume (3-20 ml, par exemple, ultra-plancton cyt d'écoulementometry) utilisent des tubes en plastique stériles pré-aspirés.
      NOTE: des tubes en plastique stérile pré-aspirés sont couramment utilisés pour des tests sanguins standards chez les humains; assurez-vous d'utiliser les tubes stériles sans additifs. Ces tubes en plastique stériles aspirées sont mieux échantillonnés avec l'utilisation de porte-tube stérile à usage unique avec hors-centre Luer. Bien que cela soit l'appareil d'échantillonnage la plus sûre et la plus efficace, elle a un volume mort légèrement plus grand par rapport à une simple aiguille.
    2. Pour de plus grands échantillons d'eau tels que les nutriments et les matières organiques dissoutes, utiliser 40 ou 60 ml des flacons de verre qui répondent aux critères Environmental Protection Agency (EPA) pour les analyses organiques volatils. Ces flacons comprennent un bouchon en polypropylène avec une silicone septum PTFE-face.
    3. Pour encore plus grands volumes, utiliser des bouteilles de pénicilline avec des bouchons en caoutchouc ou flacons sous vide.
    4. Utilisez des flacons de polyéthylène haute densité (flacons en PEHD) pour les échantillons de silice.
    5. Pour augmenter le volume de l'échantillon et de réduire le risque de délogement d'arrêtlors de l'ascension, évacuer (vide) articles 1.4.2-1.4.4 avant la plongée avec une pompe à vide. Vide manuellement à l'aide d'une pompe à vide à la main ou encore en aspirant l'air avec une seringue. Cependant, pour de meilleurs résultats, une bonne pompe à vide est recommandé. lyophilisateurs standard fournit un vide élevé.
      REMARQUE: Portez une attention particulière lors de l'utilisation de grands flacons aspirés pour veiller à ce que le taux d'aspiration initiale plus rapide ne serait pas contaminer les échantillons d'eau expirés.
  5. Procédures de nettoyage du navire
    1. Pour les matières organiques dissoutes et NH 4 + analyse, utiliser de nouveaux flacons EPA pré-nettoyés.
    2. Rincer les flacons (verre et HDPE) pour l'analyse d'autres éléments nutritifs comme suit:
      1. Rincer les flacons (verre et HDPE) et les bouchons en polypropylène de haute qualité de l'eau distillée deux fois. Installez un nouveau septum de silicium.
      2. Faire tremper les flacons (verre et HDPE) dans 10% de HCl pendant au moins 3 jours et rincer avec suffisamment haute qualité de l'eau distillée deux fois.
      3. Brûler les flacons de verre à 450 ° C pendant 4 h et on laisse refroidir dans le four. Installez le bouchon, et l'envelopper dans une feuille d'aluminium jusqu'à utilisation.
  6. Filtres
    1. Utiliser des filtres en fibre de verre sans liant pour la filtration de tous les échantillons organiques dissous (par exemple, DOC, DON) et pour la collecte des matières organiques particulaires (par exemple, POC, PON). Emballer chaque filtre de verre dans une enveloppe en feuille d'aluminium séparé. Combustion à 400 ° C pendant 2 heures pour volatiliser les résidus organiques et de stocker dans un récipient propre et sec jusqu'à utilisation.
    2. Utiliser un filtre en fibres de verre sans liant comme ci - dessus, ou des membranes de polycarbonate de 0,2 um pour échantillonner des nutriments inorganiques (par exemple, PO 4 3-, de NO x -, NH 4 +). Nettoyer une fois celui-ci installé dans le porte-filtre comme cela est expliqué ci-après (1.7.3).
    3. Utiliser 0,2 um filtres membranes polycarbonate pour l'échantillonnage de silice. Nettoyez-les une fois Installed dans le porte-filtre comme cela est expliqué ci-après (1.7.3).
  7. Préparation de l' ensemble de filtration
    1. Filtrer le mélange de base très soluble de type anionique et une solution d'agent tensioactif non ionique et la haute qualité de l'eau distillée deux fois à travers un filtre de 0,2 um avant de les utiliser pour nettoyer l'ensemble de filtration.
    2. Ensemble de filtration pour les éléments nutritifs et les matières organiques dissoutes autres que la silice:
      1. Placer un filtre en fibres de verre sans liant imbrûlés à l'intérieur du porte-filtre Swinney nettoyé en ligne en acier inoxydable.
      2. Utilisez une seringue acide nettoyée pour exécuter 100 ml de 5% mélange de base très soluble de type anionique et une solution d'agent tensioactif non ionique, puis 100 ml d'eau de haute qualité à double distillée à travers l'ensemble.
    3. Ensemble de filtration pour SiO 4:
      1. Placer le filtre de polycarbonate à l'intérieur du porte-filtre en polycarbonate de nettoyage (porte-filtre PC).
      2. Utilisez une seringue acide nettoyée pour rnon 30 ml de HCl à 5% et 30 ml d'eau de haute qualité à double distillée à travers l'ensemble.
  8. Ensemble de système
    1. Assembler le système de travaux sous-marins utilisant PEEK (polyétheréthercétone) tubes d'un diamètre extérieur (OD) de 1,6 mm et un diamètre interne (ID) de 254 um ou 177 um.
    2. Utilisez un couteau ou PEEK cutter pour couper les tubes à la longueur requise.
    3. A son extrémité distale (latérale du conteneur de l'échantillon), monter chaque tube avec un raccord Luer mâle attaché à une aiguille de seringue. Assurez-vous que vous suivez les instructions du fabricant et d'aligner le côté plat de bleu flangeless virole avec l'extrémité du tube avant de serrer l'écrou vert.
    4. Fixez le tube de PEEK sur le trépied "bras" ou manipulateur intégré personnalisé à l'aide d'un ruban isolant.
    5. Fixer une aiguille de seringue à usage unique pour le connecteur Luer mâle. Gardez l'aiguille avec son capuchon de protection pour éviter les blessures. Indiquez clairement le code de vitesse d'échantillonnage et la couleur de tous les composants inhalée et exhalée (par exemple, vert = In, rouge = Ex).
    6. De même le code couleur des vaisseaux d'échantillonnage avec des ensembles de navires d'échantillonnage paires numérotées séquentiellement.

2. Underwater travail

  1. La préparation du site de travail
    1. Enquête et la sélection des échantillons préliminaire
      NOTE: En raison de la nature complexe du protocole d'échantillonnage sous-marin, en consacrant le temps nécessaire pour la préparation assurera une plongée d'échantillonnage efficace.
      1. Enquête sur le lieu de travail et de faire les préparatifs nécessaires à l'avance.
      2. Sélectionnez et marquer les organismes cibles appropriés qui peuvent être accessibles relativement facilement. Comme tous les organismes peuvent nécessairement être actifs au moment de la plongée d'échantillonnage, préparer plusieurs postes de travail que vous attendez de goûter.
    2. Installation des supports de base
      1. When travaillant sur le substrat stabilisé:
        1. Monter le clip de dégagement rapide originale du trépied flexible sur 1 kg de poids de plongée et simplement le placer à côté de l'animal cible.
      2. Lorsque vous travaillez sur des parois verticales:
        1. Monter les plaques de support de base pour le système VACUSIP, crochets pour engins accessoires, et des cintres pour le récipient collecteur plateau de support pendant la phase de préparation du site de travail (2.1.1).
        2. Lorsque trépieds portables flexibles sont utilisés, utiliser des boulons ou résine époxy à deux composants pour fixer des plaques 10x10 cm en PVC à côté de chaque animal cible. Chaque plaque a besoin d'avoir un trou pour fixer les clips de blocage rapide du trépied portable flexible.
        3. Une fois la résine durcie et les plaques de base sont solidement fixés au mur, vissez les clips de libération rapide, servant de point de fixation solide pour le trépied portable flexible pour le système VACUSIP.
  2. Installation du VaCUSIP
    1. Vérifiez si le spécimen est de pompage en libérant un colorant de fluorescéine filtré à côté de l'orifice inhalant et confirmer que le colorant est en train d' émerger à travers l'orifice exhalant comme décrit dans Yahel et al. (2005) 16.
    2. Installez l'appareil VACUSIP et placer le tube inhalant (IN) d'échantillonnage dans l'orifice inhalant ou juste à côté de lui (à moins de ~ 5 mm). Assurez-vous que le tube d'inhalation est pas à proximité d'un autre orifice exhalant.
    3. Diriger soigneusement le exhalant (EX) tube de prélèvement vers le osculum / siphon exhalant et insérez très doucement dans, jusqu'à ce qu'il soit positionné 1-5 mm à l' intérieur du osculum / siphon exhalant (voir Figure 1 et complémentaire vidéo 1). Prenez grand soin de ne pas entrer en contact avec ou autrement perturber l'organisme échantillonnée.
    4. Avant et pendant l'échantillonnage double vérifier l'emplacement des deux tubes.
    5. Après la vérification de l'échantillonnage si le spécimen est encore pompage comme described ci-dessus (2.2.1).
      NOTE: Parce que le mouvement d'un bras du trépied lors de la manipulation de l'autre pourrait se produire, assurez-vous de placer tout d'abord le tube de prélèvement de substances inhalées et d'autre part le tube exhalant, qui nécessite une manipulation plus précise. À la suite de cet ordre, même si la manipulation du tube d'échantillonnage exhalant pourrait provoquer le déplacement du tube inhalant, il ne sera pas affecter l'échantillonnage.
  3. Procédure d'échantillonnage sous - marine modulaire
    NOTE: En attente sur la question de recherche, chacune des étapes expérimentaux ci-dessous peut être réalisée comme une expérience autonome. Le profil métabolique protocole complet d'échantillonnage décrit ci - dessous est un processus long, nécessitant jusqu'à 8 heures par échantillon (pour un aperçu voir la figure 2 et le tableau 2). Comme les conditions et règlements de plongée diffèrent entre les sites d'échantillonnage, les régions et les institutions, les plans de plongée ne sont pas inclus dans ce protocole. Néanmoins, consacrer un soin extrême et métila planification culous au plan de plongée. Faites un soin particulier pour éviter la saturation et les profils yoyo de plongée. Lorsque cela est possible, il est conseillé d'effectuer ces expériences à faible profondeur (<10 m). recycleur à circuit fermé peut être très pratique pour ces systèmes d'échantillonnage prolongées.
    1. Avant le début de l'échantillonnage réelle, assurez-vous pas de traces visibles de résidus fluorescéine restent et que les sédiments en suspension ont été réglées ou ont flottait loin.
    2. Ultra-plancton, (pas de filtre est installé dans cette étape!)
      1. Utilisez l'aiguille pour percer le IN (inhalée) et EX (exhalé) aspirés tubes en plastique stériles septa. Vérifiez que l'eau coule dans le taux prévu et recueillir des échantillons d'eau 2-6 ml.
      2. Sur la récupération, conserver les échantillons dans une boîte froide sur la glace. Dans le laboratoire, préserver avec 1% de paraformaldéhyde + 0,05% de glutaraldéhyde de qualité EM (concentration finale), soit 0,2% de glutaraldéhyde de qualité EM. Congeler cryovials dans de l'azote liquide et conserver à -80 &# 176; C jusqu'à l'analyse.
    3. L' échantillonnage et le stockage du silicate
      1. Installer le porte-filtre PC inoxydable préalablement nettoyé en ligne contenant une membrane de polycarbonate de 0,2 um entre l'aiguille et le connecteur Luer mâle à l'extrémité distale du tube.
      2. Percer le bouchon septum des flacons de polyéthylène haute densité pré-nettoyée (flacons en PEHD) pour commencer l'échantillonnage. Vérifiez que les deux échantillonneurs dégoulinent et de recueillir 15 ml d'eau dans chaque flacon.
      3. Garder les échantillons réfrigérés (4 ° C) jusqu'à l'analyse. Si l'analyse ne peut pas commencer dans les deux semaines, magasin à -20 ° C. Pour l'analyse, assurez-vous que les échantillons sont décongelés à 50 ° C pendant au moins 50 min pour dissoudre les gels de silice.
        NOTE: La membrane peut être conservée pour la microscopie ou analyse de l'ADN selon les besoins.
    4. Dissous inorganiques (PO 4 3-, NO x -, NH 4 +)
      1. Remplacer til Ensemble de filtre à PC équipé d'un porte-filtre de pré-nettoyage en ligne en acier inoxydable qui contient un filtre en verre de pré-combustion.
      2. Avant l'échantillonnage, veiller à ce qu'au moins 20 ml d'échantillons d'eau de mer ont été passés à travers le système de filtration à l'aide de l'ensemble de l'EPA, les flacons en polyéthylène haute densité ou tout autre récipient sous vide pour commencer l'aspiration. Mesurer le volume de l'eau recueillie avant d'être mis au rebut.
      3. Percer le bouchon septum des flacons de verre EPA appropriées pour commencer l'échantillonnage, vérifiez que les deux échantillonneurs dégoulinent, et de recueillir 25-30 ml pour le nitrate et l'analyse du phosphate.
      4. Passer à de nouveaux flacons de verre EPA pour l'analyse de l'ammoniac, vérifier que les deux échantillonneurs dégoulinent, et de recueillir 20 ml dans chaque flacon.
      5. Gardez les échantillons dans une boîte froide sur la glace et conserver à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
        NOTE: Si seulement le filtrat est intéressant, les filtres de seringues jetables peuvent être utilisés pour les étapes 2.3.3 et 2.3.4.
    5. Organiques dissous (DOC + DON) échantillonnage et storing
      NOTE: Conserver les échantillons aussi droit que possible tout au long de la manipulation de telle sorte que l'échantillon de l'eau ne vient pas en contact avec le septum en silicone.
      1. Continuer à utiliser l'ensemble de filtre en acier inoxydable et de recueillir 20 ml d'échantillons d'eau de mer dans de nouvelles fioles en verre EPA, comme décrit ci-dessus.
      2. Lors de la récupération, conserver les échantillons dans une boîte froide sur la glace. Dans le laboratoire, utiliser une pipette de pré-combustion Pasteur en verre pour fixer les échantillons avec de l'acide orthophosphorique (ajouter 5-6 gouttes de 25% d'acide de qualité trace de métal dans un échantillon de 20 ml, concentration finale de 0,04%) ou de l'acide chlorhydrique (ajouter 2 gouttes de trace métallique de grade concentré acide dans un échantillon de 20 ml, concentration finale de 0,1%) et conserver au réfrigérateur.
      3. Garder les échantillons réfrigérés (4 ° C) jusqu'à l'analyse. Si les échantillons ne sont pas analysés dans la semaine de la collecte, le stockage à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
    6. Matière organique particulaire (POC, PON, POP)
      1. Continuez à utiliser le stainless Ensemble de filtre en acier et d'un filtre d'au moins 500 ml d'eau de mer dans un flacon de 250 ml sous vide sous vide. Remplacer flacons si nécessaire.
      2. Sur la récupération, utiliser une seringue remplie d'air pour évacuer toute l'eau de mer restant dans le porte-filtre, l'envelopper dans du papier d'aluminium, et les stocker dans une boîte froide sur la glace. Dans le laboratoire, retirer les filtres des porte-filtres et stocker à -20 ° C jusqu'à l'analyse.

Figure 1
Figure 1. Un exemple d'installations correctes du VACUSIP: (A) d' échantillonnage du ascidie Polycarpa mytiligera (golfe d'Aqaba, Mer Rouge) en utilisant un manipulateur intégré personnalisé avec le code couleur utilisé vert pour inhalation et jaune pour les échantillons d'eau expirés (photo par Tom Shelizenger et Yuval Yacobi); (B) échantillonner les oroides éponge Agelas (NW MéditerranéeMer) avec une largeur de oscule de 3 mm, en utilisant le dispositif VACUSIP. Le code couleur utilisé est jaune pour inhalation et rouge pour les échantillons d'eau expirés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Vue d' ensemble de la technique VACUSIP décrit dans la section de protocole. Le travail de laboratoire est représenté dans des boîtes jaunes, le travail de terrain dans des boîtes bleues. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1. Les taux d'échantillonnage moyenne globale (ml min -1) obtenus avec différents conteneursutilisés pour les collections d'eau et différents niveaux de vide: les flacons ne sont pas aspirés (aucun); EPA des flacons en verre et les flacons en PEHD ont été aspirés la moitié de leur volume (½ volume); des tubes stériles en matière plastique ont déjà été aspirées par le fabricant. Travailler à 5-8 m de profondeur, la température de l'eau de 18-22 ° C, en utilisant des tubes en PEEK de 79 cm de longueur et de 25 um de diamètre interne.

Tableau 2
Tableau 2. Vue d'ensemble du récipient d'échantillonnage, l' assemblage fixateur de filtre en ligne, le stockage et les méthodes d' analyse décrites dans la section du protocole. Les composés analysés sont: l' abondance ultra-plancton (plancton <10 um), le silicate (SiO 4), phosphate (PO 4 3-), nitrite + nitrate (NO 2 - + NO 3 -), la matière organique dissoute (DOM), ammonium (NH 4 +) et la matière organique particulaire(POM). Tous les navires d'échantillonnage ont silicium septum et sont aspirés avant l'échantillonnage. Les fixateurs sont les suivants : le paraformaldéhyde + glutaraldéhyde (Glut + Parafor), d' acide orthophosphorique (H 3 PO 4) et de l' acide chlorhydrique (HCl). Les ensembles de filtres en ligne sont utilisés: porte-filtres de polycarbonate et polycarbonate membrane 0,2 um filtres (PC filtre titulaire + membrane PC) et porte-filtres en acier inoxydable et des filtres en fibre de verre sans liant GFF.

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Representative Results

Optimisation des méthodes de collecte d'eau de mer

Sélection des flacons de collection et de la procédure de nettoyage

récipients collecteurs VACUSIP compatibles doivent avoir une cloison qui permet un échantillonnage à être engagée par perçage par une aiguille de seringue. Ils doivent résister à la pression sous-marine élevée (2-3 bars à la plongée sous-typiques des profondeurs de travail), et doivent tenir un vide. Beaucoup (mais toutes les marques non) des flacons approuvés par l'EPA pour l'analyse des composés organiques volatils répondent à ces critères. flacons pré-nettoyés approuvés pour DOC et de l'analyse DON sont également disponibles. Pour tester la pertinence de ces flacons pour la collecte et l'analyse des éléments nutritifs et d'optimiser les procédures de nettoyage, de haute qualité de l'eau distillée deux fois a été recueilli dans des tubes en polypropylène nettoyés à l'acide (tubes PP), nouvellement acheté, dans unflacons de polyéthylène haute densité cid nettoyés (flacons en PEHD), et dans des flacons de verre EPA, toutes équipées d'un polytétrafluoroéthylène (PFTE) bouchon de septum. Les flacons en PEHD et des tubes en polypropylène ont été nettoyés comme décrit dans la section 1.5.2 ci-dessus, ainsi que les flacons de verre EPA ont été nettoyées par le fabricant.

La quantité de NH 4 + trouvé dans des flacons de verre EPA était relativement minime (≤ 0,1 pmol L -1) et dépend de la double distillée qualité standard de l' eau de haute qualité. En revanche, NH 4 + des concentrations significativement augmenté (jusqu'à 3 et 7 fois, respectivement) et présentent une plus grande variabilité dans des tubes en polypropylène nettoyés à l' acide et dans des flacons en polyéthylène haute densité (Anova F (5,53) = 7,183, p < 0,001, figure 3). Il n'y avait aucun effet de double contact de l'eau distillée de haute qualité avec le septum de silicium sur l'analyse d'ammonium.

Comparaison des nouveaux flacons de verre par rapport à des flacons de verre nettoyés / recyclés

Pour tester si des flacons en verre EPA pourraient être utilisés pour l' analyse des éléments nutritifs plus d'une fois, les NO x -, PO 4 3-, et NH 4 + concentrations dans des échantillons d'eau de mer prélevés dans de nouveaux flacons de verre EPA ont été comparées à celles recueillies dans des flacons de verre usagés EPA. Les nouveaux flacons en verre de l'EPA ont été préalablement nettoyés par le constructeur, tandis que les flacons de verre recyclées ont été nettoyées de la manière décrite ci-dessus (1.5.2). Flacons recyclés avaient une concentration significativement plus élevée de + NH 4, jusqu'à 1,5 fois le niveau trouvé dans de nouveaux flacons en verre (test t, p <0,001, n = 5). Aucune différence significative n'a été trouvée dans les NO x - et PO 4 3- contenu entre les échantillons prélevés dans des flacons recyclés et les échantillons prélevés dans le nouveau verreflacons (figure 4).

Collecte de silicate et des procédures de stockage

Pour déterminer le meilleur récipient d'échantillonnage pour l'analyse de silicate, de haute qualité de l'eau bidistillée ont été recueillies en (flacons en polyéthylène haute densité) non nettoyé et dans des tubes en polypropylène acide (tubes PP), dans des flacons en polyéthylène de haute densité nettoyés à l'acide, et dans des flacons de verre EPA. La concentration en silicate attendu était proche de zéro, de sorte que les valeurs qui ont dévié de la concentration attendue ont été considérés comme contaminés. La concentration en silicate significativement différente entre les échantillons prélevés dans les différents flacons (ANOVA, F (3,19) = 210,047; p <0,001), par la plus faible concentration de SiO 4 dans les flacons en PEHD nettoyés à l' acide. Des flacons en verre borosilicate ont contaminé les échantillons, à la concentration finale de SiO 4 augmentant jusqu'à 7 pmolL -1 (figure 5).

Sélection d' un appareil de filtration pour la matière organique dissoute (DOM) et analyse des éléments nutritifs

Pour déterminer quel appareil de filtre produit le plus bas en blanc dans l'analyse des organique dissous (DOC et DON) et de nutriments inorganiques (NO x -, NH 4 +, PO 4 3-), porte-filtres en acier inoxydable ont été comparés à polycarbonate en ligne Swinney porte-filtres. À chaque type de porte-filtre, nous avons testé les deux membranes de polycarbonate et de pré-combustion filtre en fibre de verre. La combinaison de l'acier inoxydable porte-filtre en acier et brûlé filtre en fibre de verre, à condition que les découpes les plus bas, tandis que le Swinney porte-filtre en polycarbonate équipé d'une membrane en polycarbonate clair contaminé les échantillons jusqu'à 9 fois. L'augmentation des volumes de lavage a pas résoudre ce problème (figure 6).

Figure 3
Figure 3. concentration d'ammonium (pmol L -1, ± écart - type moyen) recueillies avec différents flacons: (1) HDPE flacon non nettoyés; (2) Nettoyé flacon de HDPE; (3) HDPE Nettoyé flacon + Parafilm; (4) flacon de verre EPA; (5) en verre EPA flacon + Parafilm; (6) Nettoyé PP tube. Le Parafilm a été placé pour vérifier si la cloison de silicium peut contaminer les échantillons d'eau. Pour chaque traitement 9 échantillons de haute qualité de l'eau distillée deux fois ont été analysés. Les échantillons ont été analysés frais. Des différences significatives ont été trouvées entre les quatre navires d'échantillonnage (ANOVA, F (5,53) = 7,183, p <0,001, test de puissance = 0,992). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 4
Figure 4. Ammonium (NH4 +), nitrite + nitrate (NOx -) et phosphate (PO 4 3-) concentrations (pmol L -1, ± écart - type moyen) d'échantillons d'eau de mer prélevés dans la nouvelle (foncé) et recyclés / nettoyés flacons en verre (blanc) de l'EPA. L'eau de mer a été recueilli à l'Aquaria Zone expérimentale de l'Institut des sciences de la mer et a été filtré avec porte-filtre en acier inoxydable et filtre en verre. Les échantillons d'eau ont été analysés frais. L'astérisque (*) indique que la différence est significative (test t, p <0,001, n = 5, test de puissance = 1). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5. Concentration Silicate (pmol L -1, ± écart - type moyen) en haute qualité de l'eau distillée deux fois collectés dans différents flacons: tubes PP nettoyés à l'acide, des tubes en PP, flacons en PEHD nettoyés à l'acide, de nouveaux flacons en verre EPA. Des différences significatives ont été trouvées entre les quatre matériaux de l'échantillonneur (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0,001, test de puissance = 1). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Examiner l'effet des ensembles de filtration différents et laver les volumes sur le nitrite + nitrate (NO x - pmol L -1). Les échantillons pour NO x - ont été obtenues en filtrant les échantillons d'eau de mer avec de l' acier inoxydable (SS fsupport ilter) ou polycarbonate en ligne porte-filtres Swinney (porte-filtre PC) équipés soit d'une membrane de polycarbonate (filtre PC) ou un filtre pré-combustion en fibre de verre. Pour les filtres de PC, différents volumes (10, 30, 60, 90 et 120 ml) de HCl à 5% et de haute qualité de l'eau distillée deux fois ont été utilisés pour le lavage de l'ensemble de filtre, le volume de lavage est indiquée entre parenthèses dans la légende de la figure. Les valeurs sont exprimées en tant que moyenne ± écart type (n = 5). L' eau de mer a été recueilli à l'Aquaria Zone expérimentale de l'Institut des sciences de la mer et les échantillons ont été analysés frais après la filtration. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Exemple de résultats expérimentaux: par inhalation (IN, noirconcentrations d'échantillons d'eau cercle) et expirés (EX, triangle rouge) associé (pmol L -1) de différentes substances traitées par l'éponge Chondrosia reniformis dans la mer Méditerranée: (A) ammonium (NH 4 +); (B) nitrite + nitrate (NOx -); (C) phosphate (PO 4 3-); (D) de silicate (SiO 4); (E) dissous du carbone organique (DOC); (F) dissous l' azote organique (DON); (G) de carbone organique planctoniques (de LPOC); (H) de l' azote organique planctoniques (LPON). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
La figure 8. Un exemple d'un cytom d'écoulementanalyse de spectrométrie d'échantillons d'eau appariés tirés de l'eau par inhalation (A, C, E, G) et exhalé (B, D, F, H) par l'éponge Chondrosia reniformis: (A, B, C, D) populations de phytoplancton; (E, F, G, H) des bactéries hétérotrophes. Dans AB et EF l'échantillonnage était propre et précis (tous les groupes planctoniques ont été efficacement conservés). CD et GH sont des exemples de contamination de l'eau exhalé, montrant faible élimination de tous les groupes planctoniques. Syn:. Synechococcus sp, pico: picoeukariotes autotrophes, nano: nanoeukaryotes autotrophes, haute: bactéries hétérotrophes à haute teneur en ADN, faible. Bactéries hétérotrophes à faible teneur en ADN S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figur supplémentairee 1. Cellule de rétention efficacité des différents planctoniques proies par la palourde Chama pacifica: Prochlorococcus sp. (Pro), Synechococcus sp. (Syn), pico-eucaryotes (Pico EUK), nano-eucaryotes (Nano EUK). Les barres d'erreur = 95% CI. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 1. Échantillonnage l'ascidie mytiligera Polycarpa utilisant un manipulateur intégré personnalisé avec le code couleur utilisé vert pour inhalation et jaune pour les échantillons d'eau expirés. tubes d'échantillonnage (PEEK, ID 54 um, 75 cm de long) sont soigneusement placés dans les exhalants et inhalés siphons de la ascidie. Que l' eau est aspiré dans des tubes sous vide à un débit d'environ 1 ml min -1. Dans cette démonstration fluorescéine colorant est utilisé pour visualiser le jet exhalant. Notez que le tube d'échantillonnage exhalant est placé bien wimince jet exhalant. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Les étapes préparatoires

Flacons de collection pour DOM et à l' analyse des éléments nutritifs

Comme les navires collecteurs peuvent interagir avec des micro-constituants dissous et les parois de l' échantillonneur peut être un substrat pour la croissance des bactéries 30-34, différents flacons pour DOM et la collecte des éléments nutritifs ont été testés. Borosilicate est pas recommandé pour la silice quantification 33,35, puisque les bouteilles en verre peuvent augmenter la concentration initiale de la silice jusqu'à deux fois si les échantillons ne sont pas rapidement gelés 30. Nos résultats démontrent que l'utilisation de flacons EPA préalablement nettoyées en résulte des ébauches de faible concentration du COD, DON, et d'éléments nutritifs inorganiques, en particulier pour l'ammonium.

La filtration et le stockage du DOC

La filtration est un nécessaire et, dans de nombreux cas, est la première étape d'analyse en chimie marine etmicrobiologie. Bien qu'il soit possible de filtrer les échantillons après le prélèvement dans le laboratoire, cette procédure ne soit pas recommandé pour les travaux in situ, où les échantillons sont recueillis sous l' eau, souvent dans des régions éloignées lieux, heures ou jours loin des installations de laboratoire appropriées. L'utilisation de produits en ligne, la filtration in situ minimise la manipulation des échantillons et réduit ainsi le risque de contamination. Dans la filtration in situ élimine également la plupart des bactéries et réduit le risque que la composition de l' échantillon sera modifiée par le métabolisme bactérien lors de l'échantillonnage prolongé et de transport temps. L'ensemble de filtration augmente le volume mort de l'appareil d'échantillonnage, et peut également être une source de contamination. Une sélection des plus petits porteurs possibles de filtres (par exemple, en ligne Swinney porte-filtre 13 mm) et un tube de PEEK minute (par exemple, 254 um ID) réduit le volume mort et le risque de contamination par l' eau ambiante.

Si le filtre approprié est pasutilisés ou si elle n'a pas été soigneusement lavé, des artefacts et la contamination des échantillons d'eau sont susceptibles de se produire 32,36-39. Les études sur l' analyse du COD ont montré que les filtres et les porte-filtres en composés organiques (polycarbonate et PFA-PTFE) peut entraîner la contamination de DOC sévère 32,37, en particulier lorsqu'ils ne sont pas complètement rincée avec une haute qualité à double eau distillée 38. Le présent protocole et les résultats suivent ces lignes directrices et indiquent également que les détenteurs de filtre en polycarbonate doivent être évités.

Dans le travail in situ et l' interfonctionnement

Le système VACUSIP est une technique d'échantillonnage direct qui facilite l'étude du métabolisme des suspensivores non perturbées dans leur environnement naturel et la quantification de leur rôle écologique dans le système. Pour les plongeurs expérimentés et équipés, l'application de la méthode VACUSIP est simple et ne nécessite que peu trAining. Expériences Inex VACUSIP sont conçus pour une 'analyse statistique-design within' (c. -à- jumelé ou répété l' analyse de mesure), donc le contrôle de la plupart des artefacts analytiques , y compris élevés blancs. L'utilisation de l'aspiration contrôlée assure des taux d'échantillonnage lents et réglables, empêchant ainsi toute contamination accidentelle de l'eau exhalée avec de l'eau ambiante. Lorsque cela est possible, la sélection des sites de travail avec une faible turbidité actuelle et faible est recommandée et garantir des résultats plus propres et plus précis. Le temps d'échantillonnage prolongé (minutes à quelques heures) permet l'intégration de la haute microrépartition qui caractérise la couche limite benthique. Toutes ces caractéristiques assurent que lorsqu'il est correctement appliqué la méthode VACUSIP est très robuste, fournissant des résultats fiables et reproductibles, même lorsque vous travaillez avec un petit nombre de répétitions. Un exemple des résultats typiques obtenus à partir d' une éponge méditerranéenne et des espèces de myes Indo-Pacifique est représentée sur la figure 7 et complémentaire Figure 1.

Comme toute technique, l'VACUSIP est pas exempte de pièges potentiels. Le problème le plus fréquent est la contamination de l'échantillon d'eau exhalé avec de l'eau ambiante. Les raisons de ces artefacts comprennent le taux d'aspiration élevée, dislodgments tube, et le comportement des animaux. Une bonne sélection de la fréquence d'échantillonnage correcte dépend des estimations antérieures du débit exhalant. Ces estimations peuvent être obtenues en utilisant la méthode de vitesse colorant avant 16. Idéalement, le taux d'aspiration doit être maintenue en dessous de 1% du taux de pompage (par exemple, 1 ml min -1 pour une 6 L heure -1 débit de pompage). Pour éviter la contamination par l'eau ambiante, le taux d'échantillonnage ne doit jamais être supérieure à 10% du taux de pompage.

Pour contrôler le taux d'échantillonnage, la longueur et le diamètre interne de la tubulure d'admission doivent être ajustées en fonction de la profondeur de travail prévu et la température de l'eau. L'équation de Hagen-Poiseuille (voir la section 1.3.1 ci-dessus) peut être utilisé comme un guide. Cependant, cette équation doit être considérée comme une approximation de premier ordre depuis et AP baisse du taux d'échantillonnage avec le temps d'échantillonnage et en ligne filtration ajoute des incertitudes. L'utilisation de récipients sous vide, parfois avec des pressions de vide inconnus, introduit de nouvelles complications. Un exemple de la façon dont le taux d'échantillonnage varie en fonction de différents récipients sous vide avec un vide différent, est indiquée dans le tableau 1.

La réduction du taux d'échantillonnage est facilement réalisé en ajustant la longueur du tube et ID, sans limitations techniques à cette réduction (taux de quelques microlitres par heure d'échantillonnage sont possibles). Néanmoins, les expérimentateurs doivent être conscients de la fréquence d'échantillonnage lente dictée par cette limitation pour les animaux avec un taux de pompage lent et pour les petits organismes ou des spécimens. L'implication immédiate du taux d'échantillonnage lent est le volume limité de l'eau qui peuvent être collectées au cours d'une seule sessi d'échantillonnagesur. Ce faible volume limitera le nombre d'analyses et de répétitions qui peuvent être exécutés avec ces échantillons, et donc de limiter également les informations qui peuvent être obtenues à partir de ces populations.

Tube délogement peut être facilement repéré et l'échantillonnage peut être interrompu ou redémarré, à condition qu'un plongeur maintient une surveillance constante. En revanche, l'arrêt du pompage lors de l'échantillonnage ne sont pas toujours faciles à détecter. Cela est vrai non seulement pour les éponges, mais aussi pour les tuniciers, bivalves et polychètes. En fait, contrairement à la croyance commune, les événements dans lesquels une ascidie ou un bivalve arrêté de pompage ont été documentés sans changement visible dans la géométrie du siphon (Yahel, données non publiées). En outre, dans certains cas, les tuniciers peuvent maintenir le pompage actif sans maillage sécrétion (qui est, pas de filtration se déroule).

Le contrôle de la fréquence d'échantillonnage est critique. À cet égard, VACUSIP vaut mieux que d'autres méthodes, en particulier lorsque les animaux de l'étude sont relatively petite ou quand ils pompent lentement. Seringues sont particulièrement difficiles à contrôler 2. Par exemple, Perea-Blazquez et ses collègues (2012a) 40 ont utilisé une seringue pour prélever l'eau exhalée par plusieurs espèces d'éponges tempérées et étonnamment n'a pas trouvé un schéma général d'ingestion / excrétion de nutriments particuliers (NO 2 -, NO 3 -, NH 4 +, PO 4 3-, SiO 4). L'absence d'une tendance claire est probablement le résultat d'une contamination des échantillons exhalés avec de l'eau ambiante en raison de l'utilisation de la seringue. La contamination est évidente à partir de la très faible efficacité de rétention des pico plancton rapporté par Perea-Blázquez et ses collègues (2012b) 41 pour leurs éponges: 40 ± 14% des bactéries hétérotrophes et 54 ± 18% de Synechococcus sp. A titre de comparaison, en utilisant la VACUSIP, Mueller et coll. (2014) 21 ont rapporté une efficacité d'élimination des bactéries hétérotrophes de72 ± 15% en Siphonodictyon sp. et 87 ± 10% en Cliona delitrix.

Pour vérifier la qualité de l'échantillon et veiller à ce qu'aucune contamination de l'eau ambiante se produit, nous vous recommandons fortement d'analyser d'abord les échantillons pico et nano plancton à l'aide de cytométrie de flux. Cette analyse rapide, fiable et pas cher fournira de l'information immédiate de la qualité de l'échantillon. Il est très fréquent pour certains taxons de proies telles que Synechococcus sp. à enlever à près de 90% d' efficacité 14,42 par les éponges et les ascidies. Des écarts significatifs de cet indice de référence suggèrent que la contamination aurait pu se produire (figure 8).

Pour l'échantillonnage fiable et propre, assurez-vous que la conception satisfait aux expériences sept règles simples: (1) effectuer une étude préliminaire (y compris le pompage des estimations de taux) et bien préparer le chantier; (2) connaître les animaux étudiés; (3) vérifier que l'échantillon étudié a une ouverture exhalant bien défini unend endroit accessible; (4) vérifier que l'échantillon étudié est le pompage avant et après chaque prélèvement d'échantillons; (5) placer le tube pour la collecte de l'eau exhalé légèrement à l' intérieur de l'ouverture exhalant (figure 1); (6) utiliser le taux d'échantillonnage <10% du débit d'exhalant, 1% est fortement recommandé; (7) définissent un critère de qualité et d'omettre les paires soupçonnés Inex.

Suite à ces règles simples, le système VACUSIP offre une méthode pratique et fiable de mesurer le degré d'activité processus de suspensivores particules et les composés dissous dans des conditions naturelles, ce qui permet des estimations précises et comparables qui peuvent être utilisés pour évaluer le rôle fonctionnel des filtreurs dans différents écosystèmes autour le monde.

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Acknowledgments

Nous remercions Manel Bolivar pour son aide dans le travail de terrain. Nous sommes reconnaissants au "Parc Natural del Montgrì, les Illes Medes i el Baix Ter" pour leur soutien à nos autorisations de recherche et d'échantillonnage. Le manipulateur sous-marin a été conçu par Ayelet Dadon-Pilosof et fabriqué par M. Pilosof. Ce travail a été soutenu par le projet de gouvernement espagnol CSI-Coral [numéro de subvention CGL2013-43106-R à RC et MR] et par une bourse de FPU de «Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD)" à TM. Ceci est une contribution de la biogéochimie marine et le groupe Changement de recherche mondial financé par le gouvernement catalan [numéro de subvention 2014SGR1029] et de l'ISF subvention 1280-1213 et BSF subvention 2.012.089 G. Yahel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GorillaPod, Original Joby GP000001 flexible portable tripod 
Flangeless Ferrule IDEX Health & Science  P-200X 1/16" in Blue/pk
Male Nut IDEX Health & Science P-205X  1/16" in Green/10 pk
Female to Female Luer IDEX Health & Science  P-658
Female-Male Luer IDEX Health & Science  P-655
Peek Tubing (254 µm ID) IDEX Health & Science  1531 1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used.
Two component resin epoxy IVEGOR 9257 Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA Vials Cole -Parmer 03756-20 40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09).
HDPE Vials Wheaton 986701 (E78620) 20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive Greiner bio-one 455001 pre-vacuum by the manufacturer 
Septum Sample Bottles Thomas Scientific 1755C01 250 ml glass bottles 
Septum Cap 1 Wheaton W240844SP (E7865R) 22-400 for HDPE vials 
Septum Cap 2 Wheaton W240846 (1078-5553) 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42).
In-line stainless steel Swinney Filter holders Pall 516-9067 13 mm of diameter
PTFE Seal Washer Pall  516-8064 ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters Pall  516-9126 binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm
Polycarbonate Filter Holders Cole -Parmer 17295 13 mm of diameter
Isopore Membrane Filters Millipore GTTP01300 13 mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 70 Solution  Decon Labs 1002 highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution 
Sterile Syringe Filters VWR International Eurolab S.L. 514-0061P 25 mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein Sigma-Aldrich (old ref.28802) 46955-100G 100 g
Holdex, disposable,sterile Greiner bio-one 450263 sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles IcoGammaPlus 5160 0.7 mm x 30 mm
Cryovials Nalgene Nalgene V5007(Cat. No.5000-0020) 2 ml
Cryobox carton  Rubilabor M-600 145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid Sigma 79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1%
Paraformaldehyde Sigma P6148 500 g
Glutaraldehyde Merck 8,206,031,000 25%, 1 L
Hand Vacuum Pump  Bürkle  5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Morganti, T., Yahel, G., Ribes, M., Coma, R. VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders. J. Vis. Exp. (114), e54221, doi:10.3791/54221 (2016).

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