이 원고의 목적은 인간 혈액 샘플에서 단핵구 및 과립구 식세포작용과 산화 폭발 활성을 측정하는 방법을 제시하는 것입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
과립구 및 단핵구 식세포작용 및 산화 버스트(OB) 활성 분석은 선천면역계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 이 분석을 운동 면역학 무기고에 추가하는 데 필요한 방법론을 제공합니다. 이 분석의 첫 번째 단계는 전혈(헤파린)의 두 가지 부분 표본("H" 및 "F")을 준비하는 것입니다. 그런 다음 디하이드로에티듐을 H 분취액에 첨가하고 두 분취액을 따뜻한 수조에서 배양한 후 냉수 수조를 합니다. 다음으로, 황색포도상구균(S. aureus)을 H 분취량에 첨가하고 플루오레세인 이소티오시아네이트로 표지된 S. aureus를 F 분취량(박테리아:식세포 = 8:1)에 첨가하고, 두 분취액을 따뜻한 수조에서 배양한 후 냉수 수분을 주입합니다. 그런 다음 각 분취액에 트리판 블루를 첨가하여 세포외 형광을 소멸시키고 세포를 인산염 완충 식염수로 세척합니다. 다음으로, 적혈구를 용해시키고 백혈구를 고정합니다. 마지막으로, 유세포 분석기와 적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 과립구 및 단핵구 식세포작용 및 OB 활성을 측정합니다. 이 분석법은 20년 이상 사용되어 왔습니다. 격렬하고 장시간의 운동 후에 운동 선수는 식균 작용이 현저하지만 일시적인 증가와 OB 활동의 장기적인 감소를 경험합니다. 운동 후 식세포작용(phagocytosis)의 증가는 염증과 상관관계가 있습니다. 정상 체중의 개인과 대조적으로, 과립구 및 단핵구 식세포작용은 과체중 및 비만 참가자에서 만성적으로 증가하며 C 반응성 단백질과 완만한 상관관계가 있습니다. 요약하면, 이 유세포 분석 기반 분석법은 식세포의 식세포작용 및 OB 활성을 측정하며 운동 및 비만으로 인한 염증의 추가 측정으로 사용할 수 있습니다.
서론
과립구 및 단핵구 식세포 / 산화 버스트 (OB) 활성 분석은 종종 장시간 집중 운동 다음 선천성 면역 기능에 대한 정보를 수집하는 데 사용되는 간단한 직선적 기술이다. 1-4 면역계의 반응을 연구 할 때 이들이 숙주 방어에서 중요한 역할을 감염 부위에 축적 한 최초의 면역 세포이기 때문에, 자극, 과립구 및 단핵구는 특히 중요하다. 5 호중구 과립구의 일종 손상된 근육시키다 최초 셀은 집중 운동 다음 티슈. 6 탐식 및 OB 활성 과립구 및 단핵구 기능 (7)의 가장 일반적인 방법이며 때문에 감염 과정 및 복구 프로세스 모두에서의 중추적 인 역할의 선천성 면역 세포 기능의 지표로서 바람직하다.
이 원고 utili에서 설명하는 분석ZES 기본적인 플로우 사이토 전혈 과립구 및 단핵구와 OB 탐식 활성의 정량적 측정을 제공한다. 이 분석은 시간 소모적 정제 과정없이 수행 될 수 있기 때문에 이러한 기술에서 전혈의 사용은 유리하다. 이러한 분석을 용이하게 연구 설계 및 실험실 기능의 다양성을 수용하기 위해 수정 될 수있다. 예를 들어, 리아 등. 그 호중구 OB 활동을 표시하는 유사한 기술을 이용 외상성 뇌 손상 후 증가되고 호중구 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고 : 모든 혈액 수집 절차는 애팔 래 치아 주립 대학 (ASU) 임상 시험 심사위원회 (IRB)에 의해 규정 된 지침에 따라 실시 하였다.
1. 분석 준비
- (특정 재료 / 장비의 표 참조), 수집 준비 및 절차에 지정된 재료를 구성 할 수 있습니다.
- 12 X 75mm 튜브 라벨.
- 라벨 각 참가자에 대한 두 개의 튜브 다음 식균 작용의 분석 및 OB 활동 분석을위한 하나의 튜브 (검정 잉크와 형광 염료에 대한 "F"[FITC]이 튜브 라벨)에 대해 하나의 튜브 (빨간 잉크와 함께이 튜브 라벨 " dihydroethidium에 대한 H "[HE).
참고 : 멸균 12 X 75mm 튜브의 사용은 의도하지 않은 세포 활성화 및 배경 잡음에 관련된 증가를 최소화하는 것이 좋습니다. - 합니다 (식균 작용 분석을 위해 FITC 제어를 하나의 튜브 : 분석 컨트롤에 대한 세 개의 튜브에 라벨을 검은 벨벳이 튜브에 라벨을K 잉크와 "F")는 OB 활동 분석을위한 하나의 튜브 (HE 제어 : 녹색 잉크로이 관 레이블 : 만 빨간 잉크와 "H") 및 음성 대조군에 대한 하나의 튜브 (혈액이 튜브에 라벨을 와 "혈액 만").
- 라벨 각 참가자에 대한 두 개의 튜브 다음 식균 작용의 분석 및 OB 활동 분석을위한 하나의 튜브 (검정 잉크와 형광 염료에 대한 "F"[FITC]이 튜브 라벨)에 대해 하나의 튜브 (빨간 잉크와 함께이 튜브 라벨 " dihydroethidium에 대한 H "[HE).
- 적어도 하루 분석....
- 12 X 75mm 튜브 라벨.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
장기간 집중적 인 운동은 자연 살해 세포 기능, 바이러스 성 감염에 대 식세포 사이토 카인 매개 응답 및 과립구와 단핵구의 식균 작용 및 OB 활동을 포함한 선천성 면역 기능에 심각한 영향을 보유하고 있습니다. 여러 연구는 근육 손상 및 신진 대사 요구에 의해 유도 된 염증을 반영하는 과립구와 단핵 탐식의 대폭 증가 후 운동을 나타냅니다. 반면, 과립구와 단핵구 OB 활동은 운동 후 감소 및 감염에 대한 감수성 증가의 한 면역 지표가 될 수있다. 예를 들어, 그림 1은 S.의 식균 작용을 보여줍니다 과립구에 의해 구균은 다음 날 아침에 정상에 복귀, 75 km의 자전거 한판 승부 (70 % VO 2MAX) 후 즉시 1.5 시간 증가된다. 단핵 세포의 식균 작용은 유사 운동이 수준에 의해 영향을 받는다. 2는 그림 과립구 OB 활동의 감소가 있음적어도 21 시.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 원고는 과립구 및 단핵구 함수의 두 개의 지표를 결정하기위한 단계적인 프로토콜을 제공한다. 우리는이 분석의 성공에 중요한 몇 가지 단계를 확인했다. 그러한 단계는 세균의 첨가 직전에 발생 빙욕 배양한다. 모든 샘플을 철저히 냉각 식세포 및 OB 활성에 대한 온도의 영향을 최소화한다. 다른 중요한 단계는 각각의 샘플에 대한 박테리아의 추가이다. 8 : 1 세균 : 식세포 비율이 최적의 결과를 생성한다; 그러나 다른 연구자들은이 비율이 적절한 결과를 산출하도록 수정 될 필요가 있는지 찾을 수있다. 또 다른 중요한 단계는 백혈구를 적혈구를 용균하고 해결하기 위해 RBC의 용균과 WBC 고정 시약의 사용이다. 이 같은 시약의 사용은 적혈구의 완전한 용해를 보장하고 안전하게 밤새 4 ℃에서 처리 된 샘플을 저장 한 후 다음날 흐름 cytometer 통해 실행할 연구자 수있다. 이전 작업 (미 출판) 인도어RBC의 용균 및 WBC 고정 데이터 무결성을 손상시키지 않고 많은 12 시간 고정하여 시료의 유동 세포 계측법을 지연시키는 축열.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는이 절차의 최적화 동안 그들의 도움을 잭 슈, 케이시 존, 린 Cialdella - 캄을 인정하고 싶습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12 x 75 mm 튜브, 캡 VWR | 20170-579 | 포함샘플당 2개의 튜브("H" 및 "F")와 배치당 3개의 튜브(분석 대조군의 경우, "F", "H" 및 "혈액만")가 필요합니다. | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| 병 상단 0.2 &마이크로; m 셀룰로오스 아세테이트 필터 (500ml 용량) | 피셔 사이언티픽 | 09-741-07 | |
| 포도당, 분말 | Life Technologies | 15023-021 | |
| 구연산(무수, 세포 배양 테스트, 식물 세포 배양 테스트) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| 구연산나트륨 삼염기성 이수화물 | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| 디하이드로에티듐(하이드로에티딘) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) 무수 | 생명 기술 | D12345 | |
| 황색포도상구균 ( 단백질이 없는 목재 균주 A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus ( 단백질이 없는 목재 균주 A) BioParticles, unlabeled | Life Technologies | S-2859 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| 7.2mg K2EDTA를 함유한 4.0ml 진공제, 분무 건조된 | VWR | BD367861 | 샘플당 1개의 K2EDTA 혈액 수집 튜브가 필요합니다. |
| 68 USP 단위의 리튬 헤파린을 함유한 4.0ml 진공 청소기, 스프레이 코팅된 | VWR | BD367884 | 샘플당 1개의 리튬 헤파린 혈액 채취 튜브가 필요합니다. |
| 쿨터 Ac· T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., 혈액학 분석기 |
| COULTER Ac· T 5diff 린스 | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac· T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac· T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac· T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac· T 5diff Cal Cal Becker | 7547175 | ||
| COULTER Ac· T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff 희석제 | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µ l 확장 길이 피펫 팁 | VWR | 37001-526 | |
| 절연 얼음 팬 | VWR | 89198-980 | 얼음물 목욕 용. |
| 개방형 금속 튜브 랙 | VWR | 60916-702 | |
| 태아 소 혈청 | Life Technologies | 26140-111 | |
| TQ-Prep 워크스테이션 | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., 자동 세포 용해 준비 워크스테이션 |
| ImmunoPrep 시약 시스템 Beckman | Coulter | 7546999 | i.e., RBC lyse/WBC fix 시약 시스템 |
| CXP 소프트웨어가 포함된 Cytomics FC500 MCL 유세포 분석 시스템 | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Sheath 유체 | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., 정렬 및 유체 검증 형광구 |
| FlowJo 소프트웨어 | FlowJo | i.e., 유세포 분석 소프트웨어 | |
| Excel 소프트웨어 Microsoft | Microsoft Excel | i.e., 전자 스프레드시트 프로그램 |
참고문헌
- Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725(2014).
- Knab, A. M., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
