Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Summary

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Abstract

In het laatste decennium is er een opleving in het gebruik van plantaardige protoplasten die variëren van model soort tot soort gewas, voor de analyse van signaaloverdracht, transcriptionele regulatorische netwerken, genexpressie, genoom-editing, en gen-silencing is geweest. Bovendien is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de regeneratie van planten uit protoplasten, die nog meer belangstelling voor het gebruik van deze systemen voor plantengenomics heeft gegenereerd. In dit werk is een protocol ontwikkeld voor de automatisering van protoplastisolatie en transformatie van een 'Bright Yellow' 2 (BY-2) tabak schorsing cultuur met behulp van een robot platform. De transformatie procedures zijn gevalideerd met een oranje fluorescerend eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) onder controle van de bloemkoolmozaïekvirus 35S-promoter (35S). OFP expressie in protoplasten werd bevestigd door epifluorescentie microscopie. Analyses omvatte ook protoplast efficiëntie van de productie methoden waarbij propidium jodide. Tenslotte werden goedkope food-grade enzymen die voor de protoplast isolatiewerkwijze, omzeilen de noodzaak van lab-klasse enzymen die kosten prohibitief in high-throughput geautomatiseerde protoplastisolatie en analyse. Op basis van het protocol ontwikkeld in dit werk, kan de volledige procedure van protoplastisolatie transformatie worden uitgevoerd in minder dan 4 uur, zonder enige inbreng van de operator. Terwijl de ontwikkelde in dit werk protocol werd gevalideerd met de BY-2 celkweek, moeten de procedures en methodes vertaalbaar naar alle planten schorsing cultuur / protoplast-systeem, dat de versnelling van het gewas genomics onderzoek moet mogelijk te maken.

Introduction

In de afgelopen jaren is er een belangrijke impuls gelegd aan het ontwerp van transgene gewassen voor verschillende ziekten ¹ te overwinnen, schenken herbicide weerstand ^2, overleggen droogte ^3,4 en zouttolerantie ⁵ geweest, herbivorie ⁶ te voorkomen, te verhogen biomassaopbrengst ⁷ en celwand weerspannigheid verlagen ^8. Deze trend is geholpen door de ontwikkeling van nieuwe moleculaire technieken voor het genereren van transgene planten, waaronder genoom-bewerk, CRISPR Talens en ^9, en silencing tot dsRNA ^{10, 11} miRNA en siRNA ^12. Hoewel deze techn....

Protocol

1. De vaststelling van Suspension Cell Cultures

1. Bereid vloeibare BY-2 media door het toevoegen van 4,43 g Linsmaier & Skoog basale media, 30 g sucrose, 200 mg KH _{2PO 4} en 200 ug van 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur (2,4-D) aan 900 ml gedestilleerd water en pH 5,8 met 0,1 M KOH. Na het aanpassen van de pH, aan te passen uiteindelijke volume tot 1000 ml met gedestilleerd water en autoclaaf. Media kunnen tot 2 weken bewaard bij 4 ° C.
2. Inoculeren een 250 ml Erlenmeyer fles met 100 ml vloeibaar BY-2 media en één stuk BY-2 callus (> 1 cm in diameter) gekweekt op vaste BY-2 medium (vloeistof BY-2 medium met de toevoeging van 1% agar) en....

Results

In de huidige studie, de verdubbelingstijd percentage BY-2 varieerde 14-18 uur afhankelijk van de temperatuur waarbij de kweken werden geïncubeerd, in overeenstemming met eerdere rapporten van een gemiddelde lengte van de celcyclus van 15 uur. Met deze verdubbeling rate, een 1: 100 werd beginnen entstof gebruikt om culturen te initiëren, wat leidt tot culturen met een hematocriet (PCV) van 50% in 5-7 dagen. In het huidige protocol, waarin kweken werden gekweekt in 200 ml medium, een PCV .......

Discussion

De hierboven beschreven protocol is met succes gevalideerd voor protoplastisolatie, telling, en transformatie met behulp van de door-2 tabak schorsing celkweek; echter, kon het protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar alle planten schorsing cultuur. Op dit moment heeft protoplastisolatie en transformatie gerealiseerd in tal van planten, met inbegrip van maïs (Zea mays) ^10, wortel (wilde peen) ^32, populier (Populus euphratica) ^33, druif (Vitis vinifera)

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbitor RS Microplate mover	Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler	Agilent
Synergy H1 Multi-mode Reader	BioTek
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser	BioTek
Teleshake	Inheco	3800048
CPAC Ultraflat Heater/cooler	Inheco	7000190
Vworks Automation Software	Agilent		Software used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum Software	Thermo Scientific		Task scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Software	Biotek		Software used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted Microscope	Olympus
Zyla 3-Tap microscope camera	Andor
ET-CY3/TRITC Filter Set	Chroma Technology Corp	49004
Rohament CL	AB Enzymes	sample bottle	low-cost cellulase
Rohapect UF	AB Enzymes	sample bottle	low-cost pectinase
Rohapect 10L	AB Enzymes	sample bottle	low-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal Medium	Phytotechnology Laboratories	L689
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	Phytotechnology Laboratories	D295
propidium iodide	Sigma Aldrich	P4170
Poly(ethylene glycol) 4000	Sigma Aldrich	95904-250G-F	Formerly Fluka PEG
Propidium Iodide	Fisher Scientific	25535-16-4	Acros Organics
CaCl2	Sigma Aldrich	C7902-1KG
Sodium Acetate	Fisher Scientific	BP333-500
Mannitol	Sigma Aldrich	M1902-1KG
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
KH2PO4	Fisher Scientific	AC424205000
KOH	Sigma Aldrich	P1767
Gelzan CM	Sigma Aldrich	G1910-250G
6-well plate	Thermo Scientific	103184
96-well 1.2 ml deep well plate	Thermo Scientific	AB-0564
96 well optical bottom plate	Thermo Scientific	165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips	Thermo Scientific	9405 163
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Sigma Aldrich	P4504-1KG
MES	Fisher Scientific	AC17259-5000
MgCl2	Fisher Scientific	M33-500