Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

इमेजिंग एकल कोशिका संकल्प पर भ्रूण और प्रसव के बाद दिल को मंजूरी दे दी

Published: October 7, 2016 doi: 10.3791/54303
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Abstract

पूरे दिल स्तर पर एकल प्रतिरूप ट्रेसिंग और विश्लेषण हृदय विकास के दौरान हृदय पूर्वज सेल व्यवहार और भेदभाव का निर्धारण, और सामान्य और असामान्य हृदय morphogenesis के सेलुलर और आणविक आधार के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकते हैं। पूर्वव्यापी एकल प्रतिरूप विश्लेषण के हाल उभरती प्रौद्योगिकियों एकल कक्ष संकल्प पर हृदय morphogenesis के अध्ययन संभव बनाते हैं। हालांकि, ऊतक अस्पष्टता और इमेजिंग गहराई के रूप में दिल की रोशनी बिखरने एकल कक्ष संकल्प पर बाधा पूरे दिल इमेजिंग बढ़ जाती है। इन बाधाओं, एक पूरे भ्रूण समाशोधन प्रणाली है कि दिल दोनों रोशनी और पता लगाने के लिए अत्यधिक पारदर्शी विकसित किया जाना चाहिए प्रदान कर सकते हैं काबू पाने के लिए। सौभाग्य से, पिछले कई वर्षों में, इस तरह की स्पष्टता के रूप में पूरे जीव समाशोधन प्रणाली, SCA ले, SeeDB, ClearT, 3DISCO, घन, DBE, BABB और संधि के लिए कई तरीके सूचित किया गया है। इस प्रयोगशाला कार्ड के सेलुलर और आणविक तंत्र में रुचि रखता हैआईएसी morphogenesis। हृदय के विकास के दौरान कम लेबल कोशिकाओं को ROSA26-कंफ़ेद्दी प्रणाली, हाल ही में, हम एकल कोशिका वंश ROSA26-CRE ERT2 के माध्यम से अनुरेखण की स्थापना की। हम पूरे माउंट धुंधला दिल के अंदर छवि एकल क्लोन करने के साथ संयोजन में भ्रूण स्पष्ट को एससीए le और घन (स्पष्ट है, अबाधित ब्रेन इमेजिंग कॉकटेल और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण) सहित कई पूरे भ्रूण-समाशोधन के तरीके में रूपांतरित किया। दिल सफलतापूर्वक एकल कक्ष संकल्प पर imaged किया गया था। हमने पाया है कि SCA ले भ्रूण दिल साफ कर सकते हैं, लेकिन प्रभावी ढंग से प्रसव के बाद दिल को साफ नहीं किया जा सकता है, जबकि घन प्रसव के बाद दिल साफ कर सकते हैं, लेकिन नुकसान ऊतक भंग द्वारा भ्रूण दिल। यहाँ वर्णित विधियों हृदय morphogenesis, जो, बारी में, जन्मजात हृदय दोष के सेलुलर और आणविक आधार प्रकट कर सकते हैं के दौरान एक भी क्लोन संकल्प पर जीन समारोह के अध्ययन की अनुमति होगी।

Introduction

कार्डिएक morphogenesis एक अनुक्रमिक घटना है कि दिल के विशिष्ट क्षेत्रों में हृदय पूर्वज कोशिकाओं के चार अलग अलग प्रकार के spatiotemporal संगठन की आवश्यकता है, और यह भी इस प्रक्रिया आर्केस्ट्रा कार्यात्मक दिल 1,2 फार्म करने के लिए कई आनुवंशिक विनियामक नेटवर्क की आवश्यकता है। कार्डिएक विनिर्देश, भेदभाव, patterning, और चैम्बर परिपक्वता हृदयजनित प्रतिलेखन कारक 3 द्वारा विनियमित रहे हैं। आनुवंशिक उत्परिवर्तन या हृदय पूर्वज कोशिकाओं में इन कारकों में से posttranscriptional विपथन या तो भ्रूण मारक या जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) 4 में परिणाम सकता है। हृदय morphogenesis के अध्ययन के तीन आयाम (3 डी) में निहित संरचनात्मक विवरण और एकल लेबल हृदय पूर्वज सेल वंश हृदय विकास के दौरान अनुरेखण हृदय morphogenesis की समझ को बढ़ावा देंगे की एक समझ की आवश्यकता है। उच्च संकल्प खंड आधारित टोमोग्राफी तरीकों की एक संख्या वीं में विकसित किया गया हैअतीत की छवि अंग संरचना 5,6 करने के लिए कुछ दशकों ई; हालांकि, इन तरीकों महंगा, विशेष उपकरणों, व्यापक श्रम की आवश्यकता होती है, और एकल कक्ष के प्रस्ताव पर विस्तृत संरचनात्मक संगठन की कमी में अंतिम बड़ा छवि 7.8 खंगाला।

एकल कोशिका के स्तर पर 3 डी इमेजिंग बड़ा विवो 7 में पूर्वज सेल भेदभाव और सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक साधन प्रदान करता है। हालांकि, ऊतक प्रकाश बिखरने 3 डी में कोशिकाओं और संरचनाओं इमेजिंग गहरी बरकरार दिल के अंदर करने के लिए प्राथमिक बाधा बनी हुई है। लिपिड प्रकाश बिखरने का एक प्रमुख स्रोत है, और लिपिड और / या लिपिड और उनके आसपास के क्षेत्रों के बीच अपवर्तनांक अंतर का समायोजन को हटाने के हैं ऊतक पारदर्शिता 8 बढ़ाने के लिए संभावित दृष्टिकोण हैं। पिछले कई वर्षों में, ऊतक समाशोधन तरीकों की एक संख्या विकसित किया गया है, जो ऊतक अस्पष्टता और रोशनी बिखरने को कम करने, BABB (बेंजाइल अल्कोहल और लोबान benzoat की तरहई मिश्रण) और DBE (tetrahydrofuran और dibenzylether); लेकिन इन तरीकों में, प्रतिदीप्ति शमन एक मुद्दा 8-10 बनी हुई है। विलायक आधारित ऐसी SeeDB (फ्रुक्टोज / thioglycerol) और 3DISCO (क्लोराइड / dibenzylether) के रूप में हाइड्रोफिलिक तरीकों, फ्लोरोसेंट संकेतों की रक्षा, लेकिन पूरे अंग पारदर्शी 7,8,11 प्रस्तुत करना नहीं है। इसकी तुलना में, स्पष्टता ऊतक समाशोधन विधि अंग पारदर्शी renders, लेकिन यह लिपिड 8,12 दूर करने के लिए एक विशेष वैद्युतकणसंचलन डिवाइस की आवश्यकता है, संधि (निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक) है, जो भी हाइड्रोजेल embedding 7,13 आवश्यकता के रूप में करता। सभी उपलब्ध ऊतक समाशोधन के तरीकों के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए, रिचर्डसन और Lichtman, एट अल में 1 टेबल को देखें। 7।

2011 में, हामा एट अल। Serendipitously एक हाइड्रोफिलिक मिश्रण 'SCA ले' की खोज (यूरिया, ग्लिसरीन और ट्राइटन X-100 मिश्रण) माउस मस्तिष्क और भ्रूण Transpar कि rendersईएनटी, जबकि पूरी तरह से लेबल क्लोन 14 से फ्लोरोसेंट संकेतों के संरक्षण। यह एक subcellular संकल्प पर कई मिलीमीटर और neuronal आबादी और अनुमानों का बड़े पैमाने पर पुनर्निर्माण की गहराई पर बरकरार मस्तिष्क की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। Susaki एट अल। आगे SCA ले सुधार किया aminoalcohols जोड़कर और 'घन' (स्पष्ट, अबाधित ब्रेन इमेजिंग कॉकटेल और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण) ऊतक समाशोधन विधि है, जो फॉस्फोलिपिड solubilization में वृद्धि हुई है, कम समाशोधन समय विकसित की है, और बहुरंगा फ्लोरोसेंट इमेजिंग 8 के लिए अनुमति दी। वर्तमान अध्ययन में, कार्डियोजेनेसिस दौरान दिल के अंदर SCA ले के लाभ और घन ऊतक समाशोधन तकनीक और उच्च संकल्प 3 डी ऑप्टिकल सेक्शनिंग, व्यक्तिगत क्लोन लेने के Rosa26Cre ERT2 15, R26R-कंफ़ेद्दी 16, αMHC-Cre 17, cTnT-CRE का उपयोग कर पता लगाया गया 18, Nfatc1-Cre 19, और Rosa26-mTmG (mTmG) 20 माउस लाइनों। विधि पूरे माउंट धुंधला (WMS) के संयोजन ऊतक समाशोधन तरीकों आगे लेबल क्लोन में अन्य प्रोटीन का धुंधला के लिए और एक 3 डी बड़ा संदर्भ में उनके व्यवहार के अध्ययन के लिए अनुमति के साथ पहले से 21,22 विकसित की है। ऊतक समाशोधन और WMS के संयोजन हृदय विकास के दौरान विभिन्न जीन और प्रोटीन की भूमिका को बेहतर ढंग से समझ, और जन्मजात हृदय दोष के एटियलजि के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान अन्य पूर्वज सेल भेदभाव, सेलुलर व्यवहार, और अंग morphogenesis घटनाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों की देखभाल के लिए एनआईएच गाइड करने के लिए और प्रयोगशाला पशु का प्रयोग अनुसार संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) अल्बेनी मेडिकल कॉलेज में ने मंजूरी दे दी है और प्रदर्शन किया गया।

1. समाधान तैयारी

नोट: Rosa26Cre ERT2 15, R26R-कंफ़ेद्दी 16, αMHC-Cre 17, और Rosa26-mTmG (mTmG) 20 माउस लाइनों व्यावसायिक रूप से खरीदे गए थे cTnT-Cre 18 अलबामा विश्वविद्यालय में डॉ जिओ से एक उपहार था Nfatc1-CRE।। चिकित्सा 19 के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज में डॉ बिन झोउ से एक उपहार था। चूहे कम से कम 60 सेकंड द्विपक्षीय thoracotomy, शिरच्छेद या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से मौत सत्यापन के भौतिक साधन के द्वारा पीछा के लिए एक बंद कक्ष में कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना द्वारा euthanized थे।

  1. Tamoxifen तैयार करें। सूरजमुखी के बीज ओय के 10 मिलीलीटर में Tamoxifen के 10 मिलीग्राम भंगएल। एक बार जब यह पूरी तरह से भंग कर रहा है, विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) तैयार करें। ना 2 HPO 4 (1.41960 छ), के.एच. 2 4 पीओ (0.24496 छ), सोडियम क्लोराइड (8.0669 ग्राम) और KCl (0.20129 छ) आसुत जल का 1 एल में भंग और 7.4 पीएच को समायोजित करें।
  3. पीबीएस की 100 मिलीलीटर में बीच -20 के 100 μl भंग द्वारा पीबीएस में बीच -20 समाधान 0.1%: PBST तैयार करें।
  4. बफर अवरुद्ध तैयार करें। युक्त 0.2% बीच 20 PBST की 100 मिलीलीटर में बीएसए की 3 ग्राम भंग करके 3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) अवरुद्ध समाधान करें।
  5. घन 1 (अभिकर्मक 1) तैयार करें। मिक्स 25 भार% यूरिया, 25 भार% एन, एन, एन ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine और 15% wt DH 2 ओ में ट्राइटन X-100
  6. घन 2 (अभिकर्मक 2) तैयार करें। 50 भार% सुक्रोज, 25 भार% यूरिया, 10 भार% 2, 2 ',' 2 'मिक्स - nitrilotriethanol और 0.1% (वी / वी) DH 2 ओ में ट्राइटन X-100
  7. SCA ले A2 तैयार: 4 एम यूरिया, 10% w / v ग्लिसरॉल और 0.1% w / v ट्राइटन X-10DH 2 ओ 0 7.7 पीएच को समायोजित करें।
  8. DH 2 ओ में 8 एम यूरिया और 0.1% w / v ट्राइटन X-100: तैयार SCA ले बी 4 8.7 पीएच को समायोजित करें।
  9. तैयार SCA ले 70: 4 एम यूरिया, 70% w / v ग्लिसरॉल और 0.1% w DH 2 ओ में एक / वी ट्राइटन X-100

2. Tamoxifen प्रेरण, भ्रूण अलगाव और फिक्सेशन

  1. Tamoxifen प्रेरण और भ्रूण अलगाव
    1. भ्रूण विकास के दिन E7.75 33 पर Tamoxifen के 10 माइक्रोग्राम / जी के साथ एक घुमावदार खिला ट्यूब को मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल (Acup 13-12007), gavage महिला R26Cre ERT2 कंफ़ेद्दी चूहों (R26Cre ERT2 नर चूहों द्वारा खामियों को दूर) का उपयोग करना। भ्रूण दिन 9.5 (E9.5) या E10.5 में सीओ 2 और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ मादा चूहों euthanize।
    2. माउस मौत के सत्यापन के बाद (धारा 1 नोट देखें), कैंची के साथ माउस उदर गुहा खोलने के लिए और गर्भाशय सींग काटना, कैंची और चिमटी, और फिर की मदद से गर्भाशय ट्यूब परतों को हटानेगर्भाशय ट्यूब 23,24 से भ्रूण पट्टा।
      1. पीबीएस (7.4 पीएच) युक्त एक पेट्री डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण। विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, चिमटी की मदद से गैर-भ्रूण परतों (जरायु, जर्दी थैली और भ्रूणावरण) को हटा दें।
    3. चिमटी और कैंची का प्रयोग, जैसा कि पहले 22 सूचना जीनोटाइपिंग के लिए महिला माउस और भ्रूण पूंछ नमूने एकत्र। एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करना, एक 48 अच्छी तरह से थाली 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर युक्त एक अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक भ्रूण हस्तांतरण।
    4. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत, एक कैमरा के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप के माध्यम से GFP / आरएफपी / CFP सकारात्मक भ्रूण की पहचान। पील दूर पेरीकार्डियम चिमटी का उपयोग और GFP / आरएफपी / CFP फिल्टर के साथ दिल के दोनों किनारों पर फ्लोरोसेंट क्लोन की संख्या निर्धारित करने के लिए घुमावदार चिमटी की मदद से दिल / भ्रूण को घुमाएगी। कोई कटौती की जरूरत है।
  2. GFP / आरएफपी / CFP सकारात्मक भ्रूण की पहचान करने के बाद, जल्दी भ्रूण दो बार (2 मिनट प्रत्येक) 1x पीबीएस के साथ वीं में धोनेई 48 कमरे के तापमान (आरटी) पर एक थाली प्रकार के बरतन पर अच्छी तरह से थाली। इस अतिरिक्त रक्त निकाल देंगे।
  3. भ्रूण / भ्रूण दिल आरटी पर 4% paraformaldehyde (पीएफए) का उपयोग ठीक करें। निर्धारण समय भ्रूण उम्र और ऊतक आकार पर निर्भर करता है। E9.5 के लिए आरटी पर 2 घंटे के लिए भ्रूण को ठीक। देर से भ्रूण चरण भ्रूण अब निर्धारण समय है, जो भी प्रसव के बाद दिल के लिए 24 घंटा के लिए लंबे समय तक किया जा सकता है की आवश्यकता होती है।
    चेतावनी: Paraformaldehyde विषैला होता है, त्वचा, आंखों और श्लेष्मा झिल्ली के साथ संपर्क से बचें।
  4. निर्धारण के बाद, भ्रूण / दिल 48 अच्छी तरह से थाली में दो बार 1x पीबीएस के साथ (प्रत्येक 10 मिनट) आरटी पर एक थाली प्रकार के बरतन पर धो लें। इस भ्रूण / दिल से अतिरिक्त पीएफए ​​हटा। भ्रूण तो आगे पूरे माउंट धुंधला और ऊतक समाशोधन के लिए कार्रवाई कर रहे हैं।

3. पूरा पर्वत धुंधला

नोट: इस प्रकार के रूप पीएफए ​​निर्धारण के बाद भ्रूण / दिल पूरे माउंट धुंधला के अधीन है।

  1. एक 48 अच्छी तरह से थाली 1 मीटर का उपयोग करने में भ्रूण / दिल permeabilizeआरटी पर थाली प्रकार के बरतन पर 2 घंटे के लिए 0.1% PBST के एल।
  2. permeabilization के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर, अवरुद्ध बफर के 1 मिलीलीटर में भ्रूण / दिल विसर्जित 2 घंटा या रात भर के लिए एक थाली प्रकार के बरतन पर लिए।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली प्रकार के बरतन पर 48 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध 0.3 मिलीलीटर में: endothelial सेल विशिष्ट एंटीबॉडी PECAM (CD31), पतला (100 1) के लिए भ्रूण / दिल विसर्जित कर दिया।
  4. थाली प्रकार के बरतन पर PBST का उपयोग कर 5 बार, 30 मिनट प्रत्येक आरटी पर भ्रूण / दिल धो लें। इस ऊतक से अतिरिक्त गैर विशिष्ट बाध्य प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली प्रकार के बरतन पर 48 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध 1 मिलीलीटर में: एलेक्सा स्त्राव 647 बकरी विरोधी चूहा माध्यमिक एंटीबॉडी में भ्रूण / दिल, पतला (1000 1) विसर्जित कर दिया।
  6. दोहराएँ कदम 3.4 माध्यमिक एंटीबॉडी धोने के लिए।
  7. थाली प्रकार के बरतन पर आरटी पर 1 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​के साथ भ्रूण / दिल पोस्ट को ठीक करने और पीबीएस 5 मिनट प्रत्येक के साथ दो बार धो लें।
  8. परमाणु दाग ​​4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (एक एकाग्रता पर PBST में पतला के साथ भ्रूण / दिल दागआरटी पर थाली प्रकार के बरतन पर 10 मिनट के लिए 0.01 मिलीग्राम / एमएल) का राशन। 5 मिनट प्रत्येक के दो पीबीएस washes के साथ पालन करें।

4. भ्रूण / साथ Sca एल ई या घन विधि दिल क्लियरिंग

नोट: पूरे माउंट धुंधला के बाद, भ्रूण / दिल तो SCA ले या घन ऊतक समाशोधन विधि के अधीन है। विधि का चुनाव ऊतक आकार और भ्रूण उम्र पर निर्भर करता है। E11.5 या पहले की उम्र भ्रूण, उपयोग Sca एल ई ऊतक समाशोधन विधि के लिए, पुराने भ्रूण या प्रसव के बाद दिल के लिए घन ऊतक समाशोधन विधि पसंद किया जाता है।

  1. स्केल ऊतक क्लियरिंग विधि
    1. 1 कभी कोमल 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए (हाथ से) झटकों के साथ एक जगमगाहट शीशी में Sca एल ई ए 2 समाधान के मिलीलीटर (एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा) के साथ भ्रूण / दिल सेते हैं।
    2. Sca एल ई ए 2 ऊष्मायन के बाद, anot के लिए कभी-कभी कोमल झटकों के साथ ही शीशी में 4 डिग्री सेल्सियस पर Sca एल ई बी 4 समाधान के 1 एमएल के साथ भ्रूण / दिल सेतेउसकी 48 घंटा।
    3. एक और 48 कभार कोमल झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर साथ 1 मिलीलीटर Sca एल ई 70 घंटे के लिए भ्रूण / दिल सेते हैं। 90% ग्लिसरॉल का उपयोग कर माउंट भ्रूण (धारा 5.1 देखें)।
  2. घन ऊतक क्लियरिंग विधि
    1. पूरे भ्रूण / दिल घन समाशोधन के लिए, कभी कभी कोमल 37 डिग्री सेल्सियस 7 पर 48 घंटे के लिए झटकों के साथ घन 1 के 1 मिलीलीटर में प्रत्येक भ्रूण / दिल विसर्जित कर दिया। 48 घंटे के बाद, ताजा घन अभिकर्मक 1 का एक ही मात्रा के साथ समाधान की जगह है, और कभी-कभी हाथ से झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 48 घंटे के लिए नमूना सेते हैं।
    2. कोमल हाथ के साथ झटकों के साथ कमरे के तापमान पर घन 1 में इलाज दिल / 1x पीबीएस कई बार साथ भ्रूण धो लें। इस अतिरिक्त घन 1 समाधान निकालता है।
    3. पीबीएस के साथ घन 1 बाहर धोने के बाद, कभी कभी कोमल हाथ के साथ झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए घन 2 समाधान (प्रति भ्रूण / दिल 1 ग्राम) में भ्रूण / दिल विसर्जित कर दिया। इस भ्रूण / दिल ग्लिसरॉल का उपयोग करते हुए बढ़ते इस प्रकार है (धारा 5 देखें.2)।

5. नमूना बढ़ते और इमेजिंग

नोट: मंजूरी दे दी भ्रूण या में Sca एल ई 70 या घन 2 समाधान अंगों में क्रमश: 70 और स्केल इमेजिंग माध्यम के रूप में घन 2 समाधान के साथ सीधे imaged किया जा सकता है। हालांकि, समाशोधन अभिकर्मकों के लिए भ्रूण नमूने के जोखिम पर विचार करता है, तो नमूने तुरंत imaged हैं नहीं किया है, लेकिन लंबे समय तक संग्रहित, नीचे प्रोटोकॉल के बाद 90% ग्लिसरॉल में नमूने की दुकान।

  1. सीधे विसर्जित SCA ले 4 डिग्री सेल्सियस तक इमेजिंग में 90% ग्लिसरॉल और दुकान के 1 मिलीलीटर में नमूना मंजूरी दे दी।
  2. 1x पीबीएस के साथ घन इलाज नमूना धो दो बार, 5 मिनट प्रत्येक और क्रमिक रूप से 30 मिनट के लिए 30%, 50%, 70% और 90% ग्लिसरॉल समाधान प्रत्येक के 1 मिलीलीटर के साथ नमूना सेते हैं।
  3. इमेजिंग के लिए, एक confocal दो फोटोन क्षमताओं से लैस माइक्रोस्कोप के साथ 90% ग्लिसरॉल और छवि क्लोन की एक न्यूनतम राशि के साथ गिलास नीचे पेट्री डिश के लिए नमूना हस्तांतरण।
  4. छवि दिल या भ्रूण एक 10X / 0.3 एनए के साथ ग्लिसरॉल में, एक 25x / 0.8 एनए विसर्जन, या एक 40X / 1.2 एनए पानी सुधारात्मक उद्देश्य लेंस। छवि DAPI एक सुसंगत टाइटेनियम से 2 फोटॉन उत्तेजना का उपयोग: नीलम गिरगिट लेजर। माइक्रोस्कोप और उद्देश्य लेंस की पसंद प्रयोगों, सुपर संकल्प के लिए जैसे के उद्देश्य पर निर्भर करेगा, एक प्रकाश चादर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

मंजूरी दे दी भ्रूण दिल इमेजिंग

हड्डीवाला दिल गठन एक spatiotemporally विनियमित morphogenic प्रक्रिया है और संगठन और चार अलग-अलग स्रोतों से 1 पूर्वज कोशिकाओं के भेदभाव पर निर्भर करता है। हृदय वर्धमान के पहले हृदय क्षेत्र से प्रकोष्ठों उदर midline की ओर गुना एक रेखीय दिल ट्यूब के रूप में होगा। दूसरे दिल क्षेत्र से कोशिकाओं, शुरू में पहली बार दिल क्षेत्र के रहने वाले dorsomedially, बाद में, ग्रसनी और स्प्लैनकिंक mesoderm को सरकाना जहां वे रैखिक दिल ट्यूब के पूर्व मौजूदा पाड़ की ओर पलायन से। दूसरे दिल क्षेत्र की कोशिकाओं सही वेंट्रिकल, बहिर्वाह पथ (ओ एफ टी) मायोकार्डियम करने के लिए और कुछ अंतर्हृदकला 25-28 के लिए योगदान देगा। कार्डिएक तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (CNCC), postotic rhombomeres 6, 7 और 8 से होने वाले, दुम ग्रसनी की ओर पलायन और महत्वपूर्ण योगदान देगाओ एफ टी में चिकनी मांसपेशियों परत और endocardial तकिये के लिए बात यह। उन्होंने यह भी aorticopulmonary पट 29,30 के गठन के लिए योगदान करते हैं। चौथे आबादी समर्थक epicardial अंग (पीईओ) से व्युत्पन्न epicardial कोशिकाओं के होते हैं, और fibroblasts, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और संभवतः अन्य हृदय सेल प्रकार 31 में योगदान देता है। Epicardium कोरोनरी संवहनी विकास, हृदय विकास और morphogenesis 21 को नियंत्रित करता है।

हृदय morphogenesis के बारे में सबसे महत्वपूर्ण अवधारणा है कि दिल के विकास, असामान्य सेल प्रवास के दौरान / चार पूर्वज सेल आबादी के भेदभाव विकृतियों या जन्मजात हृदय दोष 4,22,32, जो दुनिया में जन्म दोष की संख्या एक कारण है में परिणाम होगा । सेलुलर और आणविक स्तर पर हृदय morphogenesis के तंत्र का निर्धारण CHDs के लिए निदान और संभावित उपचार में सुधार की ओर एक आवश्यक कदम है।इसलिए, यह एकल कक्ष संकल्प के साथ पूरे दिल के स्तर पर दिल morphogenesis की प्रक्रिया छवि के लिए महत्वपूर्ण है। उस लक्ष्य को हासिल करने के लिए हमें हृदय विशिष्ट ट्रोपोनिन टी के नियंत्रण (cTnT) है, जो विशेष mTmG संवाददाता लाइन के साथ, cardiomyocytes 18 में व्यक्त किया जाता है के तहत Cre लाइन पार करके cardiomyocytes लेबल। E8.5 में भ्रूण काटा और PECAM cardiomyocytes से endocardial और endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए दाग रहे थे। भ्रूण तो SCA ले द्वारा मंजूरी दे दी थी और दिल imaged किया गया था। मायोकार्डियम mTmG रिपोर्टर की cTnT संचालित Cre की मध्यस्थता पुनर्संयोजन के कारण GFP द्वारा चिह्नित किया गया है, और अंतर्हृदकला PECAM (चित्रा 1 ए और पूरक मूवी 1) के साथ चिह्नित किया गया। Cardiomyocytes एक एकल कोशिका संकल्प (चित्रा 1 ए) में देखा जा सकता है। इस तरह के आदिम वेंट्रिकल और बार बार के रूप में imaged हिस्से के दिल संरचनाओं, स्पष्ट रूप से 3 डी फिर से का उपयोग कर 3 डी पुनर्निर्माण के बाद पहचाना जा सकता हैनिर्माण सॉफ्टवेयर (चित्रा 1 बी और पूरक मूवी 2)।

मंजूरी दे दी भ्रूण दिल के एकल क्लोन इमेजिंग

कार्डिएक morphogenesis पूरे दिल स्तर 22 में हृदय वंश भेदभाव और अलग-अलग सेल संगठन पर निर्भर करता है, और इस तरह, यह अलग प्रकार के हृदय सेल करने के लिए छवि एक कार्डियक पूर्वज सेल भेदभाव के लिए आवश्यक है और एकल कक्ष के प्रस्ताव पर भी छवि सेल आकृति विज्ञान के लिए। उस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, Rosa26Cre ERT2 15 R26R-कंफ़ेद्दी 16 को पार कर गया था, और गर्भवती महिला एक कम एकाग्रता में tamoxifen के साथ gavaged था। 48 घंटे के बाद, भ्रूण E9.5 पर काटा गया था, और पूरे PECAM के लिए दाग माउंट, और फिर पूरे दिल imaged किया गया था। हमने पाया कोशिकाओं का केवल एक ही क्लस्टर ओ एफ टी के लिए स्थानीय था, है, और इस क्लोन 8 कोशिकाओं आधारित ओ थाn खंगाला छवि और लगातार वर्गों (आंकड़े 2A, 2 बी और पूरक मूवी 3), यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं को एक ही पूर्वज सेल से निकाली गई है। सेलुलर आकृति विज्ञान और ऐसे सेलुलर प्रसार और पलायन के रूप में सेलुलर व्यवहार कोशिकाओं (2A चित्रा) की अंतिम स्थिति से अनुमान लगाया जा सकता है। हम यह भी E9.5 और E10.5 पर भ्रूण दिल स्पष्ट घन विधि लागू किया, और पाया कि अभिकर्मक 1 के साथ ऊष्मायन के केवल 24 घंटे के बाद भी, भ्रूण आसानी से भंग कर रहे थे और ऊतक संरचना पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ा था (नहीं दिखाया डेटा )।

प्रसव के बाद मंजूरी दे दी है और देर से भ्रूण दिल की इमेजिंग

हम दोनों Sca एल ई और घन प्रसव के बाद दिल को साफ करने के लिए आवेदन किया। αMHC-CRE के जीनोटाइप के साथ p2 दिलों; mTmG (αMHC-CRE विशेष cardiomyocytes में व्यक्त किया जाता है <sup> 17) के साथ 48 घंटे के लिए Sca एल ई मंजूरी दे दी थी, लेकिन दिल पीबीएस के साथ इलाज केवल (नहीं दिखाया डेटा) की तुलना में किसी भी अधिक पारदर्शिता प्रदर्शित नहीं किया था, यह दर्शाता है कि Sca एल ई समाशोधन प्रसव के बाद दिल के लिए प्रभावी नहीं है। P2 के दिलों को 48 घंटा और 96 घंटे के लिए अभिकर्मक 2 के लिए घन अभिकर्मक 1 के साथ मंजूरी दे दी थी, वे बहुत दिलों 48 घंटे के लिए अभिकर्मक 1 और 48 घंटे के लिए अभिकर्मक 2 के साथ मंजूरी दे दी है और अधिक से अधिक पारदर्शी थे। इमेजिंग गहराई काफी अभिकर्मक 2 ऊष्मायन के 96 घंटा (पूरक फिल्म 4 और 5) के साथ वृद्धि हुई थी यह दर्शाता है कि घन अभिकर्मकों के साथ अब ऊष्मायन पारदर्शिता को बढ़ावा देता है और इमेजिंग गहराई में वृद्धि के लिए प्रदान करता है। आकार और प्रत्येक cardiomyocyte के आकार झिल्ली स्थानीय GFP (चित्रा 3 ए), जो अतिवृद्धि की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता द्वारा की पहचान की जा सकती है।

हम यह भी मंजूरी दे दी Nfatc1-CRE; कंफ़ेद्दी (कंफ़ेद्दी महिला Nf के साथ खामियों को दूर कियाatc1Cre पुरुष) E17.5 दिल (Nfatc1-Cre 48 घंटा और 48 घंटे के लिए अभिकर्मक 2 के लिए घन अभिकर्मक 1 के साथ हृदय endocardial कोशिकाओं 19) में व्यक्त किया जाता है। दिलों को पारदर्शी हैं, और GFP, YFP, सीएफपी और आरएफपी सहित फ्लोरोसेंट प्रोटीन endocardial कोशिकाओं और उनके ली गई कोशिकाओं लेबल की उम्मीद कर रहे थे; हालांकि, केवल GFP और YFP पूरे दिल के माध्यम से imaged किया जा सकता है (आंकड़े 3 बी, 3 सी और पूरक सिनेमा 6 और 7), और सीएफपी और आरएफपी नहीं पाया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया। PECAM के लिए धुंधला (Alexia स्त्राव 647) (नहीं दिखाया डेटा) भी पता नहीं किया जा सकता है, सुझाव है कि घन अभिकर्मक quenches CFP, आरएफपी और इस प्रोटोकॉल में एंटीबॉडी संयुग्मित fluorophore।

आकृति 1
चित्रा 1:। इमेजिंग सैक / ई भ्रूण दिल को मंजूरी दे दी (क) एक सेशनएक E8.75 दिल (cTnT-CRE; mTmG) की राजनैतिक टुकड़ा दिखाया गया है। वी: वेंट्रिकल; ओ एफ टी: बहिर्वाह पथ। (बी) 110.4 माइक्रोन की कुल गहराई के साथ 93 लगातार ऑप्टिकल स्लाइस की खंगाला दिल संरचना को दर्शाता है। ए में स्केल बार = 20 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: के SCA / ई एकल क्लोन इमेजिंग भ्रूण दिल को मंजूरी दे दी (ए) ROSA26-CRE ERT2 के जीनोटाइप के साथ एक E9.5 दिल से एक क्लोन से एक ऑप्टिकल खंड;। ROSA26-कंफ़ेद्दी। एक cardiomyocyte के एक सेलुलर फलाव करने के लिए तीर अंक। (बी) 10 ऑप्टिकल स्लाइस और 36 माइक्रोन की कुल गहराई के साथ E9.5 दिल की ओ एफ टी क्षेत्र में खंगाला क्लोन दिखाता है। ए में स्केल बार = 20 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
। चित्रा 3: घन को मंजूरी दे दी प्रसव के बाद और देर से भ्रूण दिल इमेजिंग (ए) αMHC-CRE के जीनोटाइप के साथ एक p2 दिल से एक ऑप्टिकल अनुभाग दिखाता है; mTmG; ROSA26-कंफ़ेद्दी, ऑप्टिकल वर्गों के सभी अनुपूरक मूवी 5. (बी) में दिखाया जाता है Nfatc1-CRE के जीनोटाइप के साथ एक E17.5 दिल से एक अनुभाग दिखाता है। (सी) 630 माइक्रोन की कुल गहराई के साथ 106 ऑप्टिकल स्लाइस से खंगाला दिल संरचना को दर्शाता है। स्केल बार = ए में 20 माइक्रोन और बी में 100 माइक्रोन है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ईएनटी "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> फिल्म 1
। अनुपूरक फिल्म 1: SCA ले इमेजिंग भ्रूण दिल को मंजूरी दे दी (सही डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) ; दिल लुमेन के लिए दिल की सतह से 1 मूवी एक SCA ले के ऑप्टिकल वर्गों E8.75 दिल (mTmG cTnT-सीआरई) में इलाज चलता। गहराई 110.4 मीटर है और इसमें कुल 93 स्लाइस हैं।

फिल्म 2
पूरक मूवी 2:। SCA ले इमेजिंग भ्रूण दिल को मंजूरी दे दी (सही डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) Movie 2 1 मूवी में खंगाला दिल के 3 डी सतह तस्वीर दिखाता है, reconstruc3 डी पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के माध्यम से टेड। पीले निशान PECAM अभिव्यक्ति और हरे रंग का लेबल सभी cardiomyocytes।

मूवी 3
पूरक मूवी 3: SCA ले की एक एकल क्लोन इमेजिंग भ्रूण दिल को मंजूरी दे दी (सही डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। मूवी 3 ROSA26-CRE ERT2 के जीनोटाइप के साथ एक E9.5 दिल से एक क्लोन के वर्गों से पता चलता है।

मूवी 4
पूरक मूवी 4: घन को मंजूरी दे दी प्रसव के बाद दिल इमेजिंग (Right डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। मूवी 4 एक घन इलाज किया p2 के दिल के वर्गों से पता चलता (& #945; MHC-Cre; mTmG) दिल लुमेन के लिए दिल की सतह से। इस p2 दिल 48 घंटे के लिए घन अभिकर्मक 1, और 96 घंटे के लिए घन अभिकर्मक 2 के साथ मंजूरी दे दी थी।

मूवी 5
पूरक मूवी 5: घन को मंजूरी दे दी प्रसव के बाद दिल इमेजिंग (Right डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। मूवी 5 एक दिल है कि अभिकर्मक 48 घंटा और अभिकर्मक घन 2 48 घंटे के लिए के लिए घन 1 के साथ मंजूरी दे दी गई है। गहराई फिल्म 4 में खंड प्रति 6 माइक्रोन से 136 माइक्रोन है और मोटाई 76 माइक्रोन है फिल्म 5 में खंड प्रति 6 माइक्रोन के साथ।

मूवी 6
पूरक मूवी 6: घन को मंजूरी दे दी देर Embry इमेजिंगonic दिल (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) मूवी 6 एक घन इलाज किया E17.5 दिल (Nfatc1-CRE; ROSA26-कंफ़ेद्दी) के वर्गों से पता चलता है। दिल लुमेन के लिए दिल की सतह से। गहराई अनुभाग प्रति 6 माइक्रोन से 630 माइक्रोन है।

मूवी 7
पूरक मूवी 7: घन को मंजूरी दे दी देर भ्रूण दिल इमेजिंग (Right डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। मूवी 7 मूवी 6 में दिल के 3 डी सतह चित्र, 3 डी पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के माध्यम से खंगाला पता चलता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

भ्रूण अलगाव में एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है। E9.5 भ्रूण बहुत नाजुक है और आकार में छोटे हैं, इसलिए अतिरिक्त देखभाल अलगाव के दौरान भ्रूण / दिल संरचनाओं को नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए। गैर-भ्रूण अतिरिक्त भ्रूण / दिल घेर परतों ध्यान विशेष रूप से पूरे भ्रूण जब इमेजिंग हटाया जाना चाहिए। यह भ्रूण के ऊतकों के अंदर गहरे एंटीबॉडी और समाशोधन मिश्रण प्रवेश की अनुमति देता है, और भी पृष्ठभूमि संकेत को हटाने जब इमेजिंग में मदद करता है। PECAM के खिलाफ एंटीबॉडी, acetylated α ट्यूबिलिन और इंटीग्रिन β1 सहित कई एंटीबॉडी की जांच की गई और सभी को सफलतापूर्वक पता चला रहे थे 33 (डेटा) नहीं दिखाया। यह दर्शाता है कि आणविक ईमानदारी, अखंडता और सेलुलर प्रतिजन संगतता इस समाशोधन प्रक्रिया के दौरान बाधित नहीं कर रहे थे।

एक चौड़े मुंह हस्तांतरण पिपेट (टिप) में कटौती का उपयोग कर भ्रूण / दिल स्थानांतरण। इस से निपटने के दौरान नुकसान से बचा जाता है। GFP / YFP / आरएफपी / CFP अभिव्यक्ति पैटर्न और एनक्लोन के भूरा रंग ध्यान से दिल में दर्ज किया जाना चाहिए दिल के प्रति एक क्लोन या किसी अन्य अंगों लेबल करने के लिए उचित खुराक निर्धारित करने के लिए। Tamoxifen (10 माइक्रोग्राम / छ) की कम खुराक के कारण, कभी कभी दिल किसी भी क्लोन शामिल नहीं करता है या किसी क्लोन का पता लगाने के लिए मुश्किल है। इसलिए, यह जर्दी थैली का उपयोग करने के लिए अगर भ्रूण किसी भी GFP / YFP / आरएफपी / CFP क्लोन है निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है।

भ्रूण या दिल का निर्धारण ओवर-निर्धारण एक उच्च पृष्ठभूमि में परिणाम होगा, जबकि अंडर निर्धारण गरीब धुंधला में परिणाम होगा के रूप में एक महत्वपूर्ण कदम है। यह एक थाली प्रकार के बरतन पर आरटी पर 2 घंटे के लिए E8.5-E10.5 पूरे भ्रूण को ठीक करने की सिफारिश की है। E11.5-E15.5 भ्रूण के लिए है, जबकि सिफारिश ध्यान से दिल को अलग और आरटी पर 2 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​के साथ इसे ठीक करने के लिए है। दिल के आसपास के पूरे भ्रूण प्रसंस्करण यदि परतों को दूर करने के लिए सुनिश्चित करने के बाद, E11.5- E13.5 भ्रूण भी आरटी पर 3-4 घंटे के लिए तय किया जा सकता है, लेकिन है कि वृद्धि की ऊतक समाशोधन समय की आवश्यकता है। E16.5-P1 (प्रसव के बाददिन 1) दिल एक थाली प्रकार के बरतन पर आरटी पर 3-4 घंटे के लिए तय कर रहे हैं। जब पूरे भ्रूण फिक्सिंग, सामने और हिंद अंग के रूप में वे दिल इमेजिंग में बाधा हटा दिया जाना चाहिए।

नमूने नमूना सुखाने को कम करने की जगमगाहट शीशियों में घन और SCA ले के साथ व्यवहार किया जाना चाहिए। हम 37 डिग्री सेल्सियस पर घन ऊतक समाशोधन विधि के साथ नमूनों की बेहतर समाशोधन मनाया है, जबकि SCA ले समाशोधन बेहतर 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है। इमेजिंग के बाद, नमूने घन 2 या SCA ले 70 में अल्पकालिक संग्रहित किया जा सकता है। नमूने हमेशा प्रतिदीप्ति विरंजन को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जाना चाहिए।

भ्रूण के ऊतकों और अंगों कम लिपिड और बाह्य मैट्रिक्स बयान है, जो कम समाशोधन समय में यह परिणाम है। दूसरी ओर, वे समाशोधन अभिकर्मकों की चपेट में हैं। समाशोधन अभिकर्मकों ऊतक संरचना और प्रतिजन की अखंडता को प्रभावित कर सकता है, CFP, आरएफपी और एंटीबॉडी conju के शमन में जिसके परिणामस्वरूपGated fluorophore। इसलिए, अब निर्धारण बार शमन रोकने सकता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन का शमन भी रूप में पहले से 34 की सूचना दी रसायनों के लिए उनकी संवेदनशीलता और पीएच के कारण हो सकता है। अन्य रासायनिक व्यंजनों, पीएच, fixatives, और ऊष्मायन लंबाई फ्लोरोसेंट प्रोटीन का शमन कम करने के लिए पता लगाया जाना चाहिए।

पूरे अंग या ऊतक transparentizing समाशोधन की विधि बड़ा 3 डी इमेजिंग क्रांति ला दी है। हृदय morphogenesis के लिए पिछले इमेजिंग विधि है, जो धारावाहिक वर्गों के मैनुअल 2 डी या 3 डी पुनर्निर्माण शामिल है, समय लेने वाली और साधन 5,6 की मांग की है। 3 डी मॉडलिंग के साथ संयोजन के रूप में उच्च संकल्प episcopic माइक्रोस्कोपी (HREM) माउस दिल के morphogenesis के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है और विकासशील माउस भ्रूण 35 में घरनदार वास्तुकला का उत्कृष्ट शारीरिक विवरण के लिए प्रदान करता है। हालांकि, HREM fluoresc की पहचान की अनुमति नहीं हैईएनटी प्रोटीन लेबल की कोशिकाओं या कोशिकाओं 35 के बाकी हिस्सों से एंटीबॉडी दाग कोशिकाओं। मौजूदा प्रोटोकॉल, कम से कम प्रयास और उच्च लागत प्रभावशीलता के साथ उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक भ्रूण दिल SCA ले या घन ऊतक समाशोधन तरीकों (- 3 आंकड़े 1) का उपयोग करने में फ्लोरोसेंट संकेतों संरक्षित है। (10 माइक्रोग्राम / छ) एक कम खुराक के साथ संयुक्त Tamoxifen की Cre पुनर्संयोजन घटनाओं प्रेरित और पूरे भ्रूण के अंदर और दिल में कुछ क्लोन उत्पन्न करने के लिए, इस प्रणाली का पता लगाने और एक हृदय पूर्वज सेल भेदभाव और सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विवो (2A चित्रा) 33। इसके अलावा, Cre मध्यस्थता जीन विलोपन या overexpression और रचनात्मक मध्यस्थता एकल कक्ष लेबलिंग के साथ संयुक्त, इस इमेजिंग प्रणाली हृदय morphogenesis दौरान समारोह या पूर्वज सेल भेदभाव और सेलुलर व्यवहार पर समारोह के लाभ के आनुवंशिक नुकसान का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, और इस तरह एक मजबूत प्रदान करता है सेंट करने के लिए उपकरणजन्मजात हृदय दोष के एटियलजि Udy।

दो-ऊतक समाशोधन सिस्टम SCA / ई और घन इस अध्ययन में इस्तेमाल विभिन्न समाशोधन क्षमता से पता चला है, जो आगे भ्रूण उम्र, ऊतक मोटाई और ऊतक समाशोधन समय की अवधि पर आधारित प्रणाली differentiates। प्रारंभिक चरण भ्रूण E9.5-E10.5 के लिए, SCA / ई प्रणाली न केवल साफ ऊतक प्रदान की गई है, लेकिन यह भी भ्रूण आकृति विज्ञान की रक्षा की और संरक्षित फ्लोरोसेंट का संकेत है, जबकि घन उपचार भ्रूण विघटन में हुई। यह और अतिरिक्त aminoalcohols का परिणाम घन समाधान 8 में ट्राइटन X-100 के एक उच्च एकाग्रता हो सकता है। पुराने दिल के लिए, SCA / ई प्रणाली भी एक लंबी ऊष्मायन समय के साथ पूरी तरह से ऊतक स्पष्ट करने में विफल रहा है। घन समाशोधन समाधान पुराने ऊतक से साफ (चित्रा 3) गाया। हालांकि, वृद्धि हुई ऊष्मायन समय कमजोर संकेतों और केवल संरक्षित अंतर्जात GFP में हुई है, जबकि आरएफपी, सीएफपी और एंटीबॉडी संयुग्मित संकेतोंखो गए थे। इस कारण से, समाशोधन अभिकर्मकों और बेहतर ऊष्मायन समय का एक और अधिक अनुकूलित नुस्खा फ्लोरोसेंट लेबल का अधिक से अधिक स्पेक्ट्रम के साथ छवि दिल या अंगों volumetrically करने की आवश्यकता होगी।

इस अध्ययन में यह दिखा दिया है कि एक विकासशील दिल की endocardial / endothelial सेल मार्कर PECAM की एक पूरी माउंट धुंधला के साथ लेबल कर सकते हैं, का पता लगाने, और छवि एकल हृदय क्लोन संयोजन में। इस प्रणाली में PECAM और DAPI के पूरे माउंट धुंधला न केवल एक दिल के अंदर प्रकार की कोशिकाओं और लेबल की कोशिकाओं के सेल आकृति विज्ञान की पहचान में मदद करता है, लेकिन यह भी हृदय morphogenesis दौरान प्रतिरूप पैटर्न, प्रवास और व्यवहार के अध्ययन की अनुमति देता है। चित्रा 2A में हम बार बार में 8 कोशिकाओं के साथ एक क्लोन मनाया। लेबलिंग समय के संदर्भ में इस क्लोन में सेल वर्तमान की संख्या का प्रयोग, सेल प्रसार दर आसानी से गणना की जा सकती है। इस एक ही प्रणाली का उपयोग एक अन्य अध्ययन में हम उन्मुख कोशिका विभाजन पैटर्न और migr पहचानtrabeculation प्रक्रिया 33 के दौरान एकल cardiomyocyte की व्यावहारिक पैटर्न। spatiotemporally लेबल हृदय पूर्वज सेल भेदभाव पर समारोह या समारोह के लाभ के आनुवंशिक नुकसान के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन, प्रतिरूप पैटर्न और सेलुलर व्यवहार संभव है, और आनुवंशिक में जन्मजात हृदय दोष के एटियलजि के अध्ययन में मदद मिलेगी और एक 3 डी संदर्भ में आणविक स्तर पर। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के अन्य अंग प्रणालियों में morphogenesis के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2′,2′’-nitrilotriethanol  Sigma Aldrich 90279
4% Paraformaldehyde in PBS Affymetrix 19943
BSA Fischer Scientific  BP16000
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine  Sigma Aldrich 122262
Phosphate Buffer Saline Sigma Aldrich P5368-10PAK
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Urea Sigma Aldrich U-1250
Sucrose Sigma Aldrich 84097
Glycerol Sigma Aldrich G8773
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Sunflower seed oil Sigma Aldrich S5007
Tween 20 Sigma Aldrich P1379
PECAM (CD31) BD Pharmingen  550274
Alexa Fluor 647  Invitrogen A-21247
DAPI nuclear stain Sigma Aldrich D9542
37oC Incubator Thermoscientific Fischer Heratherm, Compact Microbiological Incubators
48 well plates Cell Treat 229148
Analytical Balance Metler Toledo PB153-S/FACT
Confocal microscope Zeiss Zeiss 510 confocal microscope
Disecting Microscope Unitron Z850
Fluorescent microscope Zeiss Observer. Z1
Germinator 500 Glass Bead Sterilizer CellPoint Scientific GER-5287-120V
Light Source SCHOTT ACE I
Pair of Scissors Fine Science Tools 14084-08
Petri dish 60 mm x15 mm  TPP Techno Plastic Products AG 93060
Rocker II  Platform Rocker Boekel Scientific 260350
Scintillating tubes Fischer Scientific  03-337-26
Transfer pipette Samco Scientific 202
Tweezers Fine Science Tools 11251-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
  2. Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
  3. Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
  4. Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
  6. Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  8. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  9. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
  10. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  11. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  14. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  15. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  16. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  17. Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
  18. Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
  19. Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
  20. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  21. Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
  22. Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
  23. Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , Academic Press. London. (1992).
  24. Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
  25. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  26. Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
  27. Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
  28. Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
  29. Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
  30. Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Developement. 127, 1607-1616 (2000).
  31. Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
  32. Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
  33. Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
  34. Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
  35. Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 116 पूरे दिल समाशोधन पूरे दिल इमेजिंग वंश ट्रेसिंग हृदय विकास
इमेजिंग एकल कोशिका संकल्प पर भ्रूण और प्रसव के बाद दिल को मंजूरी दे दी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaikh Qureshi, W. M., Miao, L.,… More

Shaikh Qureshi, W. M., Miao, L., Shieh, D., Li, J., Lu, Y., Hu, S., Barroso, M., Mazurkiewicz, J., Wu, M. Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution. J. Vis. Exp. (116), e54303, doi:10.3791/54303 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter