Uma configuração experimental original para células de aquecimento em um prato de cultura usando radiação laser de onda contínua de 1,94 μm é introduzida aqui. Utilizando este método, as respostas biológicas das células epiteliais do pigmento da retina (RPE) após diferentes exposições térmicas podem ser investigadas.
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Artigo de método
Laser de Thulium de onda contínua para aquecimento de células cultivadas para investigar efeitos térmicos celulares
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um método original para o aquecimento de células cultivadas usando um laser de túlio de onda contínua de 1,94 μm para avaliação biológica é introduzido aqui. A radiação do laser de Thulium é fortemente absorvida pela água, e as células no fundo do prato de cultura são aquecidas através da difusão térmica. Uma fibra a laser com um diâmetro de 365 μm é ajustada a cerca de 12 cm acima da placa de cultura, sem qualquer óptica, de modo que o diâmetro do feixe laser seja quase equivalente ao diâmetro interno da placa de cultura (30 mm). Ao manter uma quantidade consistente de meio de cultura em cada experiência, é possível irradiar as células com um aumento de temperatura altamente reprodutível.
Para calibrar o aumento de temperatura e sua distribuição em um prato de cultura de células para cada ajuste de potência, a temperatura foi medida durante 10 s de irradiação em diferentes posições e no nível celular. A distribuição de temperatura foi representada usando um software de gráficos matemáticosPrograma, e seu padrão no prato de cultura estava em forma Gaussiana. Após irradiação a laser, diferentes experiências biológicas podem ser realizadas para avaliar as respostas celulares dependentes da temperatura. Neste manuscrito, é introduzida a coloração da viabilidade ( isto é, distinguindo células vivas, apoptóticas e mortas) para ajudar a determinar as temperaturas limiares para apoptose celular e morte após diferentes pontos no tempo.
As vantagens deste método são a precisão da temperatura e do tempo de aquecimento, bem como a sua alta eficiência no aquecimento de células em um conjunto de cultura de células inteiras. Além disso, permite estudar com uma grande variedade de temperaturas e durações do tempo, que podem ser bem controladas por um sistema operacional computadorizado.
Introdução
Compreender respostas biológicas de células dependentes da temperatura é de grande importância para tratamentos de hipertermia com sucesso. A fotocoagulação a laser retinal com um laser térmico, usado em oftalmologia, é um dos tratamentos a laser mais estabelecidos em medicina. A luz visível, principalmente de comprimentos de onda verde para amarelo, é utilizada no tratamento com laser retiniano. A luz é altamente absorvida pela melanina nas células epiteliais do pigmento da retina (RPE), que formam a monocamada celular mais externa da retina. Houve um interesse recente entre médicos e pesquisadores em irradiação térmica muito leve (fotocoagulação sub-visível) como u....
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Protocolo
1. Cultura celular RPE
- Isolamento de células RPE de olhos porcinos
- Obtenha os olhos porcinos recém-enucleados do matadouro local. Mantenha-os frescos (4 ° C) e em um ambiente escuro.
- Remova os tecidos extracelulares com tesoura e remova os olhos em uma solução anti-séptica durante 5 min.
- Coloque os olhos em solução salina tamponada com fosfato esterilizado sem cálcio e magnésio (PBS (-)) até o uso.
- Usando um bisturi, penetre na esclerótica em cerca de 5 mm posterior ao limbo corneano. Respeite toda a parte anterior do olho cortando com tesoura todo o caminho, paralelo ao limbo corneano.
- Remo....
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Resultados
Distribuição de temperatura após diferentes configurações de energia
Todos os desenvolvimentos de temperatura para cada irradiação única foram monitorados na calibração de temperatura. A partir destes dados, a temperatura máxima no ponto medido foi obtida e definida como T max (° C). Conforme mostrado na Figura 3A , o programa foi executado no ponto de tempo em que o prato de cultura foi c.......
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Discussão
Ao discutir as respostas celulares biológicas relacionadas à temperatura, não só a temperatura, mas também a duração do tempo do aumento da temperatura, é importante, uma vez que a maioria dos processos bioquímicos dependem do tempo. Particularmente no campo da hipertermia induzida por laser em oftalmologia, devido ao curto intervalo de tempo, de milissegundos a segundos, é difícil investigar os efeitos térmicos celulares com um controle preciso da temperatura. Portanto, é desejável uma instalação de irradiação a laser .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF) (concessão nº 13GW0043C) e de um Escritório Europeu de Pesquisa e Desenvolvimento Aeroespacial (EOARD, concessão nº FA9550-15-1-0443)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes | |||
| Dulbecco' s Águia Modificada' s Glicose média - alta | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Adicione (2)-(4) antes de usar. Quente em 37 > C banho-maria antes de usar. |
| Solução antibiótica antibiótica (100 &vezes;) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Contendo 10.000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina e 25 μ g Anfotericina B em 1mL. Adicione 5,5 ml em frasco médio de 500 ml (1) antes de usar. |
| Piruvato de sódio (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Adicionar 5,5 mL em frasco médio de 500 mL (1) antes de usar (concentração final: 1 mM) |
| Soro suíno | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Adicionar 50 mL em 500 mL de garrafa média (1) antes de usar (final: 10%) |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Tripsina do pâncreas suíno | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Kit ELISA de quanticina VEGF humano | R& D System | DVE00 | |
| Oxiselect Kit de Ensaio de Glutationa Total | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Kit de Detecção de Células Apoptóticas/Necróticas/Saudáveis | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Nome | Empresa | Número do Catálogo | Comentários |
| EquipamentosLaser de | |||
| túlio | Starmedtec GmbH | Protótipo | 0-20 W |
| 365 mm de diâmetro do núcleo de fibra | COMPONENTES DO LASER Alemanha | CF01493-52 | |
| Termopar | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Placa de aquecimento | MEDAX | ||
| Leitor de microplacas ( espectrofluorômetro) | Dispositivo molecular | Spectramax M4 | |
| QIAGEN | TissueLyser LT | ||
| Microscópio de fluorescência | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| programa de software matemático | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| plataforma de design de sistema | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
Referências
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al.
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Reimpressões e permissões
