Ce manuscrit présente un protocole détaillé pour la fabrication d’une plate-forme émergente de culture d’hépatocytes tridimensionnels, l’échafaudage à cristaux colloïdaux inversés et les techniques concomitantes pour évaluer le comportement des hépatocytes. Les pores contrôlables en taille contrôlée, l’interconnectivité et la capacité à conjuguer les protéines de la matrice extracellulaire à l’échafaudage du poly(éthylène glycol) (PEG) améliorent les performances des cellules Huh-7.5.
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Article de méthode
Fabrication de Inverted colloïdal cristal Poly (éthylène glycol) Échafaudages: Une cellule plate-forme en trois dimensions de la culture pour l'ingénierie tissulaire du foie
Dans cet article
Résumé
Résumé
La possibilité de maintenir la fonction des hépatocytes in vitro, dans le but de tester la cytotoxicité des xénobiotiques, l' étude de l' infection virale et le développement de médicaments ciblant le foie, nécessite une plate - forme dans laquelle les cellules reçoivent des signaux biochimiques et mécaniques appropriées. systèmes d'ingénierie tissulaire du foie récents ont utilisé trois dimensions (3D) échafauds composés de hydrogels synthétiques ou naturelles, compte tenu de leur rétention d'eau élevée et leur capacité à fournir les stimuli mécaniques nécessaires par les cellules. Il y a eu un intérêt croissant dans le cristal colloïdal (CPI) échafaudage inversé, un développement récent, qui permet à l'organisation spatiale élevée, homotypique et l'interaction des cellules hétérotypique, ainsi que la matrice (ECM) interaction cellulaire extracellulaire. Nous décrivons ici un protocole pour la fabrication de l'échafaudage ICC à l'aide de poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA), et le procédé de lixiviation des particules. En bref, un treillis est composé de particules microsphériques, après quoi un pré-polymela solution r est ajoutée proprement polymérisé et les particules sont ensuite éliminés, ou lessivés, à l' aide d' un solvant organique (par exemple le tétrahydrofuranne). La dissolution des résultats du réseau dans un échafaudage très poreuse avec des tailles et des interconnectivités qui permettent aux médias d'atteindre plus facilement les cellules interstitielles contrôlées. Cette structure unique permet une grande surface spécifique pour les cellules à adhérer à ainsi que la communication facile entre les pores, et la capacité de revêtir la CPI échafaudage PEGDA avec des protéines montre également un effet marqué sur la performance des cellules. Nous analysons la morphologie de l'échafaudage ainsi que la cellule d'hépatocarcinome (Huh-7.5) le comportement en termes de viabilité et de la fonction pour explorer l'effet de la structure de la CPI et les revêtements ECM. Dans l'ensemble, ce document fournit un protocole détaillé d'un échafaudage émergent qui a de larges applications dans l'ingénierie tissulaire, en particulier le foie ingénierie tissulaire.
Introduction
Le foie est un organe hautement vascularisé avec une multitude de fonctions, y compris la désintoxication du sang, le métabolisme des xénobiotiques et la production de protéines sériques. Le tissu hépatique a trois dimensions (3D), la microstructure complexe, comprenant plusieurs types cellulaires, les canalicules biliaires, sinusoïdes, et des zones de composition différente biomatrice et différentes concentrations en oxygène. Compte tenu de cette structure complexe, il a été difficile de créer un modèle correct du foie in vitro 1. Cependant, il y a une demande croissante de fonctionnement des modèles in vitro d' hébergement ....
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Protocole
1. ICC Échafaudages Fabrication (Figure 1)
- Préparer le polystyrène (PS) lattices (diamètre = 6 mm; 8-13 couches de perles).
- Pour préparer le moule, couper les pointes hors de 0,2 ml microtubes bouillir à l'épreuve au niveau de 40 pi. Adhérer au sommet des coupe-tubes à 24 x 60 mm 2 microscope glisse en verre de couverture avec de la colle imperméable à l' eau.
- Mettez les sphères PS (diamètre = 140 um) contenues dans une suspension de l'eau dans un flacon de 20 ml, soigneusement la pipette sur la suspension de l'eau et ajouter 18 ml de solution à 70% d'éthanol dans le flacon. Mettre la solution de sphère dan....
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Résultats
Les résultats représentatifs pour la caractérisation structurale de l'échafaudage de la CPI et la comparaison de l'efficacité de chaque CPI échafaudage condition dans la culture des hépatocytes sont présentés et expliqués ci-dessous. Les conditions CPI d'échafaudage utilisés dans ces résultats sont enduits de collagène de 0 pg / ml (nu), 20 pg / ml (collagène 20), 200 ug / ml (collagène 200), et 400 ug / ml (collagène 400) et le premier huh-7,5 cellulaire nombre de semis est .......
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Discussion
Échafauds d'ingénierie tissulaire évoluent rapidement pour fournir tous les indices physiques et biochimiques nécessaires pour régénérer, maintenir ou réparer les tissus pour l'application de remplacement d'organes, d' étudier la maladie, le développement de médicaments, et beaucoup d' autres 57. Dans le foie ingénierie tissulaire, les hépatocytes humains primaires perdent rapidement leurs fonctions métaboliques, une fois isolés du corps, créant ainsi un grand besoin d'échafaudages d&#.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à divulguer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le soutien d'une recherche nationale Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) et le Programme de recherche concurrentiel (NRF-CRP10-2012-07).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube PCR de 0,2 ml | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Colle |
| Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Dépend du fournisseur. Il a été acheté dans un magasin local. | |
| Diapositives en verre | VWR | 631-1575 | Dimensions : 24&fois ; 60 mm2 |
| sphères en polystyrène | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diamètre = 140 µ ; m; 3x104 particules par millilitre et distribution granulométrique de 1,4 % |
| Éthanol | Merck | 1.00983.1011 | absolu pour l’analyse EMSURE ; Diluer à 70 % avec de l’eau Milli-Q |
| Bain à ultrasons | Elma | S10H | Four d’équipement |
| Nabertherm | N7/H | Équipement | |
| 200 µ ; l pointe de pipette | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Agitateur à bascule | VWR | 444-0142 | |
| Polyéthylène glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4 kDa ; l’acrylation des monomères PEG et la purification du précipité résultant produisent un macromère PEGDA avec Mw = 4,6 ; Centrifugeuse kDa |
| Beckman Coulter | 392932 | équipement | |
| Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3,4 kDa |
| 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyéthoxy)-2-méthylpropiophénone | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Équipement |
| Microcentrifugeuse | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Film de paraffine | Parafilm M ; | #PM996 | Maintenu à 9" avec une intensité de 10,84 po mW/cm2 |
| Projecteur UV Bluewave 200 | Blaze Technology ; | 120008, 122300 | |
| Tétrahydrofurane (THF) | Merck | 107025 | |
| Agitateur orbital | Heidolph | 543-123120-00-5 | |
| Collagène de type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | De rat. 1x, sans CaCl2 & MgCl2 ; pH = 7,2 |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16 % p/v aq. 10 x 10 ; ml |
| Paraformaldéhyde | VWR | 43368.9M | Équipement |
| Freezone 4.5 lyophilisateur | Labconco | 7750020 | Equipment |
| Coucheuse par pulvérisation cathodique | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Équipement |
| Microscope électronique à balayage | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anticorps primaires anti-souris contre le collagène de type I | Abcam | ab6308 | |
| Anticorps secondaire anti-souris conjugué à Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Plaque, culture tissulaire 24 puits, fond plat (Nunclon) ; | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 2,5 g/L Glucose avec L-Gln | Lonza | 12-604F | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Pénicilline-Streptomycine (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| 100 mm Boîtes de culture non traitées Corning | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0,25 % trypsine-EDTA | Gibco | 25200-056 | Équipement ; 37 ° ; C, 5 % d’humidité |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubateurs | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Kit de viabilité/cytotoxicité pour cellules de mammifères | Life Technologies | L3224 ; | |
| CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Réactif à sel monosodique (MSR) |
| Lecteur de microplaques Infinite 200 PRO ; | Tecan | ||
| Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anticorps primaires anti-souris (contre le CYP3A4, l’albumine) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850 ; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 marqué Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Chloroforme | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC eau | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop Spectrophotomètre 2000c | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Transcription inverse Supermix ; | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR select Master Mix pour CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Amorces (à choisir) | |||
| Système en temps réel CFX96, Thermocycleur tactile C-1000 | Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH ; |
Références
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Abboud, G., Kaplowitz, N.
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Réimpressions et autorisations
