Fluorescerende orthotope Muis Model van pancreaskanker

Samenvatting

Een procedure om groen fluorescerende eiwit-expresserende pancreaskankercellen (PANC-1 GFP) orthotopisch in de pancreas van Balb-c Ola Hsd-Fox1nu muizen te implanteren om tumorprogressie en metastase te beoordelen, wordt hier gepresenteerd.

Samenvatting

Alvleesklierkanker blijft één van de kankers waarvoor de overleving niet aanzienlijk in de afgelopen decennia is verbeterd. Slechts 7% van de gediagnosticeerde patiënten langer dan vijf jaar te overleven. Om te begrijpen en bootsen de micro pancreas tumoren, hebben we gebruik gemaakt van een murine model van orthotope alvleesklierkanker dat niet-invasieve beeldvorming van tumorprogressie maakt in real time. Pancreaskanker cellen die groen fluorescent proteïne (GFP PANC-1) werden gesuspendeerd in basaalmembraan matrix, hoge concentratie (bijvoorbeeld Matrigel HC) met serumvrij medium en vervolgens geïnjecteerd in de staart van de pancreas laparotomie. De celsuspensie in de hoge concentratie basaalmembraan matrix wordt een gelachtige substantie eenmaal op kamertemperatuur; derhalve geleert wanneer het in contact komt met de alvleesklier, waardoor een afdichting op de injectieplaats en het voorkomen van lekkage cel. tumorgroei en metastase naar andere organen worden bewaakt in levendedieren met behulp van fluorescentie. Het is kritisch voor de juiste filters voor excitatie en emissie van GFP. De stappen voor het orthotope implantatie worden beschreven in dit artikel, zodat onderzoekers gemakkelijk de procedure in naakt muizen kunnen repliceren. De belangrijkste stappen van dit protocol zijn de voorbereiding van de celsuspensie, chirurgische implantatie, en het gehele lichaam fluorescerende in vivo beeldvorming. Dit orthotope model is ontworpen om de effectiviteit van nieuwe therapieën op de primaire en metastatische tumoren te onderzoeken.

Inleiding

Alvleesklier kanker wordt gediagnosticeerd met een verhoogde frequentie in vergelijking met andere vormen van kanker en is het ^4e belangrijke oorzaak van sterfte aan kanker in de Verenigde Staten. Vanaf het moment van diagnose, meer dan 90% van de patiënten sterven binnen vijf jaar ^1,2. Op dit moment, chirurgische verwijdering van de tumor is de enige remedie voor pancreaskanker, maar minder dan 20% van de patiënten komen in aanmerking voor een operatie ondergaan, vooral omdat op het moment van de diagnose van de ziekte is in een vergevorderd stadium en is uitgezaaid ^3,4. Het ontbreken van specifieke symptomen maakt pancreaskanker een stille ziekte; een aantal van de symptomen zijn buikpijn, rugpijn, verlies van eetlust, geelzucht en misselijkheid; die gemakkelijk kan worden geïnterpreteerd als gemeenschappelijke spijsvertering ziekten ^4. Daarom is het belangrijk om nieuwe farmacologische hulpmiddelen om te helpen bij de diagnose en behandeling van pancreatische kanker.

Het gebruik van dierlijke modellen laat ons toe om de biologie van Pancré begrijpenATIC kanker en geeft inzicht in het toepassen van deze kennis voor de mens. Orthotope xenograft modellen van pancreaskanker realistisch omdat tumoren groeien in het orgaan van oorsprong ^5. In tegenstelling tot heterotopische modellen, waarbij cellijnen of tumorfragmenten subcutaan worden geïmplanteerd, orthotopische modellen maakt de recreatie van de tumor micro-omgeving en bootst de interactie van tumorcellen met zijn omgeving ^6. De xenograft model hier beschreven is afgeleid van tumoren uit de menselijke alvleesklierkanker cellijn PANC-1 GFP, die genetisch is gemanipuleerd om het groen fluorescerend eiwit (GFP) uit te drukken. GFP detectie maakt voor een niet-invasieve beeldvorming en bewaking van tumorgroei en metastase ^7. Tumorontwikkeling treedt snel, spontaan en lijkt op die van primaire tumoren van menselijke alvleesklierkankerpatiënten ^8. Orthotope modellen een meer nauwkeurige voorspelling van geneesmiddelefficiëntie in reactie op therapeutische middelen, terwijlnabootsen van de tumor micro-omgeving.

Zoals hierboven vermeld, dit diermodel maakt fluorescentiedetectie van tumorgroei en metastase in real time. Fluorescentiedetectie maakt een directe / levende imaging vergeleken met luminescentie. Met fluorescentie het uitgezonden licht is een gevolg van een excitatie van een andere licht van een kortere golflengte; dat in luminescentie, het uitgezonden licht is het resultaat van een chemische reactie en kan geen sterke emissie ^9. Bovendien hele lichaam in vivo fluorescentie beeldvorming is niet schadelijk voor het dier kunnen onderzoekers tumorgroei tijd te volgen in reactie op therapeutische behandelingen.

Protocol

De hieronder beschreven protocol wordt uitgevoerd onder leiding en goedkeuring van de Animal Care en gebruik Comite Western University's. Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, regelgeving en regelgevende instanties.

1. Cultuur van de Cel

1. Bereiding van compleet medium
   1. Via een Klasse II biologische veiligheidskast, compleet medium bereid door aseptisch foetaal runderserum (FBS) en penicilline streptomycine (P / S) om een ​​fles 500 ml RPMI medium. Meng voorzichtig door zwenken. De eindconcentratie van elk supplement 10% FBS en 1% P / S (v / v). Bijvoorbeeld, aanvullen 500 ml medium met 56 ml FBS en 6 ml P / S.
   2. Plaats compleet medium in een waterbad bij 37 ° C.
2. Ontdooien en uitdragen van Cellen
   1. Ophalen PANC-1 GFP cellen van vloeibare stikstof. Ontdooi de flacon door voorzichtig schudden in een waterbad bij 37 ° C.
      Notitie:(- 3 min ongeveer 2) ontdooien moet snel zijn.
   2. Label T-75 kolven voor gebruik met (a) cellijn naam, (b) passage nummer, (c) datum en initialen (d) onderzoeker.
   3. Veeg de flacon met 70% ethanol en overdracht flesje naar een bioveiligheid kast.
   4. Om de cellen te propageren, voeg 9,0 ml compleet medium aan een 15 ml conische buis. Met een 1,0 ml pipet voorzichtig breng de celsuspensie en suspendeer in 9 ml van compleet medium.
   5. Centrifugeer bij 125 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. Breng de conische flacon een bioveiligheid kast en zuig de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren.
   6. Suspendeer de pellet in 10 ml vers compleet medium door voorzichtig pipetteren de suspensie op en neer.
   7. Tel de cellen met een hemocytometer en plaat ze in T-75 kolven bij een dichtheid van 2,1 x 10 ⁶ cellen / kolf. Plaats kolf in een incubator bij 37 ° C en _5% CO2.
   8. Controleer de cellen dagelijks op het oog en onder de microscoop. Als griepid vernieuwing nodig is, aseptisch zuigen de complete groeimedium uit de fles en gooi. Voeg gelijk volume van vers compleet medium.
3. Het uitdragen van Cellen
   1. Aseptisch medium te verwijderen uit de kolf. Voeg 5 ml Dulbecco's fosfaat buffer zoutoplossing (DPBS) om cellen te spoelen en gooi.
   2. Maak de cellen van de fles door toevoeging van 3 ml 0,25% trypsine. Incubeer kolf met trypsine bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende 5 tot 10 minuten.
   3. Observeer cellen onder de microscoop (10x vergroting) en ervoor zorgen dat ze zijn rond en verdreven.
   4. Neutraliseren trypsine door toevoeging van een gelijk volume compleet medium en breken klonten door zachtjes en neer te pipetteren.
   5. Tel de cellen met een hemocytometer en het geschikte volume celsuspensie nieuwe kolven bij de in 1.2.7 genoemde celdichtheid dragen; voeg genoeg verse media, zodat het uiteindelijke volume is 10 ml per fles.
4. Cell Suspension Voorbereiding voor injectie
   Let op: Omdat het basaal membraan matrix, hoge concentratie, stolt bij KT, blijven alle materialen op het ijs. Plaats alle steriele pipet tips en flacons in de vriezer 's nachts, en blijf op het ijs tijdens het werken op de schorsing.
   1. Houd een fles RPMI media zonder toevoegingen op het ijs. Ontdooi de basaalmembraan matrix, hoge concentratie, volgens de instructies van de fabrikant. Bij voorkeur aliquot in kleinere flesjes voor meervoudige vries-dooicycli ¹⁰ voorkomen.
   2. Zuig media van alle kolven, en spoel af met 5 ml DPBS. Herhaal alle stappen van de vorige paragraaf naar stap 1.3.4.
   3. Breng de inhoud met een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 125 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. Transfer conische flacon bioveiligheid kast en resuspendeer pellet met 10 ml van DPBS.
   4. Voorzichtig pipet de schorsing op en neer te breken van de pellet. Aantal cellen met een hemocytometer.
   5. Centrifugeer opnieuw zoals uiteengezet in sTep 1.4.3. Aspireren supernatant en afhankelijk van het aantal cellen, voeg juiste verdunningsmiddel 3 x 10 ⁶ cellen geven in een volume van 50 pl. 1 (v / v) verhouding: het verdunningsmiddel een mengsel van serumvrij medium en hoge concentratie kelder membraan matrix in een 1 zijn.
   6. Vortex de schorsing voorzichtig en blijf op ijs te allen tijde. De schorsing is nu klaar voor injectie.
5. chirurgische Implantatie
   Let op: Zorg ervoor dat alle chirurgische materialen en instrumenten zijn steriel. Oefen aseptische technieken te allen tijde.
   1. Plaats een verwarming pad op de tafel en dek af met een steriel laken. Stel het anesthesieapparaat en zorgen voor alle benodigdheden zijn binnen handbereik.
   2. Plaats snuit van het dier in de anesthesie masker en het opzetten van de anesthesie tot 1 l / min zuurstof en 2,5% isofluraan.
   3. Voorzichtig schrobben de flank van het dier met jodium en spoelen met 70% ethanol. Herhaal dit drie keer.
   4. Bevestig dedier is volledig verdoofd door het afklemmen van de achterpoot. Het dier is volledig verdoofd en klaar voor de operatie als er geen reactie wordt waargenomen. Indien het dier flinches, zorgen voor voldoende anesthesie in de verdamper en dat het dier meer tijd om volledig te gaan onder narcose.
   5. Belasting ongeveer 200 ul van de celsuspensie in een 1,0 ml TB spuit met een 18 G naald (voorheen afgekoeld). Vervang de naald met een 27 G naald en terug te keren naar het ijs pas klaar voor gebruik.
   6. Zoek het algemene gebied van de milt (linker bovenste kwadrant van de buik) en met behulp van een tang neem de huid op de top van die regio. Met behulp van chirurgische schaar maken een incisie van ongeveer 1,0 cm tot een zak te maken. Evenzo neem de gladde spieren bovenop de milt en doorgesneden om toegang tot de buikholte.
   7. Voorzichtig pak de caudale einde van de milt en trek hem uit het lichaam. De alvleesklier is de milt worden bevestigd. Spreid de alvleesklier met een natte sterile Q-tip en zoek de staart van de alvleesklier.
   8. Lever de 50 pl injectie in de staart van de alvleesklier, laat de naald binnen voor 10 sec en langzaam draai de naald uit de alvleesklier. Een succesvolle implantatie zal zien als een oppervlakkige luchtbel zonder enige lekkage.
   9. Zet de alvleesklier en milt de buikholte. omsluiten eerst de spier en vervolgens omsluiten de huid los. Gebruik een 6-0 hechting of nieten aan de incisie te sluiten. Pijn te vermijden bij het dier toedienen ketoprofen subcutaan (SC) (5 mg / kg) gedurende 24 uur. Als alternatief, beheren buprenorfine sc (0,05-0,1 mg / kg) om de 12 uur over een 36 hr periode.
   10. Recover het dier verdoving en terug te sturen naar zijn kooi. Ook controleren op pijn. Dieren moeten worden voorzien pijn op het tijdstip van (of zelfs vóór - preventieve) operatie. Extra verlichting van de pijn moeten dieren die pijn volgens IACCUC-protocol of zoals voorgeschreven door de ten worden verstrektneigt dierenarts of aangewezen.
6. In vivo beeldvorming
   Opmerking: Afbeelding vastleggen werd uitgevoerd met een commercieel afbeeldingsysteem voorzien van een donkere kamer en de geschikte filters voor GFP beeldvorming. Afbeelding acquisitie werd uitgevoerd met behulp van een CCD-camera en een optisch systeem dat bestaat uit verwisselbare excitatie / emissie lenzen (excitatie: 455-495 nm; emissie: 513-557 nm). Helderveld beelden werden gevangen zonder filter 1 x 1 binning voor elk tijdstip. Excitatie van GFP gebruik gemaakt van een xenon multispectrale lichtbron. De dieren werden onder narcose gedurende het beeldvormende proces in stand gehouden door het verbinden van het anesthesieapparaat een gas anesthesie spruitstuk geïntegreerd in de donkere kamer van de imaging-systeem.
   1. Verdoven het dier zoals beschreven in 1.5.2. Een anesthesie masker is binnenin de donkere kamer commerciële grafische systeem om het dier onder verdoving te houden tijdens het belichtingsproceswerkwijze.
   2. Stel de juiste excitatie en emissie filters.
   3. Begin met het verkrijgen van een eerste afbeelding met alleen wit licht. Houd dezelfde positie van het dier gedurende de opnamesessie en overschakelen naar GFP filters om een ​​tweede opname te maken.
   4. Voor het beste resultaat overlappen beide beelden. Analyseer de afbeelding voor tl-gebied en intensiteit.

Resultaten

Deze methode beschrijft een chirurgische orthotope implantatie van fluorescerende menselijke alvleesklierkanker cellen, gericht op de voorbereiding van de cel suspensie voor injectie, de juiste verdoving voor knaagdieren, levering van celsuspensie via laparotomie, en het gebruik van fluorescerende in vivo beeldvorming van kleine proefdieren. De detectie van een groene fluorescentiesignaal (GFP signaal) tussen twee en drie weken na implantatie, biedt onderzoekers een visuele aanw...

Discussie

We beschrijven een orthotope muismodel van pancreaskanker die GFP tot expressie brengt, waardoor niet-invasieve bewaking van tumorgroei gebruik hele lichaam in vivo fluorescentie beeldvorming (figuur 1). Deze techniek kunnen we controleren de tumorontwikkeling direct (figuur 3); het kan een belangrijk instrument voor onderzoekers om de therapeutische werkzaamheid van nieuwe middelen tegen alvleesklierkanker te bestuderen. Een ander belangrijk aspect van dit model is dat GFP flu...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-077
Penicillin Streptomycin	Thermo Ficher Sci	15140-122
Matrigel HC basement membrane, high concentration	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Alcare of Foamed Antiseptic Handrub	Steris	639680
DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline)	Thermo Ficher Sci	21300025
TB Syringe 27 G 1/2	Becton Dickinson	305620
Isoflurane	Blutler Schein	50562
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
Surgical Scissors, 5.5" straight mayo	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP cell line	Anticancer, Inc
Small Animal Imaging System: iBox Scientia	UVP, LLC. Upland, CA.		Klein dier beeldvormingssysteem om de fluorescente tumor in levende dieren te observeren