Method Article

준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램

DOI:

10.3791/54355

⸱

August 6th, 2016

 ,  , 
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 유동 세포 계측법와 함께, T 세포 현상의 양 및 음의 선택을 모델링하는데 사용될 수 있고, 흉선 조각의 제조를 설명한다. 흉선 조각은 또한 흉선 세포 마이그레이션, 현지화의 현장에서 분석하도록하고, 면역 및 두 광자 현미경을 통해 시그널링 할 수있다.

Abstract

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기능, 자기 허용 T 세포 레퍼토리의 생성의 결과로 독특하고 고도로 조직화 된 흉선 미세 환경에서 흉선 선택 진행한다. T 계보의 헌신과 개발을 연구하는 체외 모델은이 과정에 귀중한 통찰력을 제공하고 있습니다. 그러나, 이러한 시스템은 T 세포의 발달에 필요한 완전한 입체 흉선 환경이 부족하고, 따라서, 생체 내 선택 흉선 불완전 근사치이다. 모델링 T 세포의 개발과 관련된 문제들 중 일부는 전체 T 세포 개발 흉선 선택을 지원 온전한 흉선 미세 제공 시츄 모델을 사용하여 극복 될 수있다. 흉선 슬라이스의 Organotypic 문화는 현장 기술에 기존의 보완. 흉선 조각은 흉선 피질과 수질 지역의 무결성을 보존하고 정의 발달 단계 또는 내인성 T (c)의 중첩 흉선 세포의 개발을 연구 할 수있는 플랫폼을 제공성숙한 흉선 미세 환경 내에서 ELL 학생. 마우스 당 20 ~ 슬라이스를 생성 할 수있는 능력이 주어 흉선 슬라이스 높은 처리량 실험 성 측면에서 고유 한 이점을 제시한다. 또한, 다양한 유전 적 배경에서 다른 흉선의 서브 세트 또는 다른 세포 집단을 오버레이 흉선 조각과 잠재력을 생성하는 상대적 용이성이 방법의 다양성을 향상시킨다. 여기에서 우리는 흉선 조각, 격리 및 흉선 세포의 오버레이 및 유세포 분석을위한 흉선 조각 해리의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 시스템은 흉선 세포 이주, 흉선 세포 - 실질 세포의 상호 작용 및 이광자 현미경 흉선 선택과 연관된 TCR 신호의 비 통상적 인 T 세포의 발달을 연구뿐만 아니라 가시화하도록 구성 될 수있다.

Introduction

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T 세포는 기능성 자기 저항성 T 세포 레퍼토리 1-3의 생성을 위해 여러 체크 포인트가 발생하는 시간 동안 흉선 발달 중간체 일련 구별. 긍정적 인 선택은 대뇌 피질의 흉선 상피 세포 (CTEC) 2,3에 주요 조직 적합성 복합체 분자 (MHC)에 의해 제공 온건 친 화성 펩타이드에 저와, 인식 할 수있는 T 세포 수용체 (TCR)와 흉선 세포의 생존을 촉진한다. 음의 선택 및 규제 T (T REG) 세포 개발은 MHC 2,4 제시 자체 펩타이드에 강력하게 대응 흉선 세포의 제거 또는 전환을 통해 자기 관용의 설립에 기여한다. 미성숙 한 CD4 + CD8 + 더블 양성 (DP)은 성숙한 T 세포의 소집단으로 선정 과정을 통과 차별화 TCR도를 발현하는 흉선 세포,있는 MHC 클래스 I가 제한 CD8 + 세포 독성 대부분입니다또는 MHC 클래스 차 림프 기관 1-3 이펙터 기능을 수행하는 흉선을 종료하기 전에 CD4 + 헬퍼 단일 양성 (SP) T 세포를 II 제한.

T 세포 개발의 복잡성을 추가 동적 이동과 간질 ....

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Protocol

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HOPITAL Maisonneuve - 로즈 몬트 - 모든 동물 연구를위한 프로토콜 센터 드 공들인에서 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.

흉선 조각의 제조 및 단일 세포 현탁액 1. 수확 마우스 흉선

  1. 자궁 경부 전위 다음 CO 2와 마우스를 안락사.
  2. 층류 후드에서 절개 보드 마우스 복부 측면을 고정. 70 % 에탄올로 마우스를 분무. 흉강을 입력하고 조직을 손상 에탄올을 방지하기 위해 거즈로 뿌리며 마치에 의해 초과 알코올을 제거합니다.
  3. 포셉 한 쌍의 흉골의 기지에서 피부를 들어 올려 피부를 통해 상처를합니다. 각 앞다리 위쪽으로 피부의 상처를 확장합니다.
  4. 흉곽에서 다이어프램을 분리하는 흉골의 기지에서 추가 컷을 확인합니다. 그런 다음 쇄골을 향해 흉곽의 각면을 잘라. 흉강을 노출 머리를 향해 흉곽을 뒤집습니다. 두 돌출부흉선은 심장의 상단에 거짓말.
  5. 집게, 마이크로 해부 가위를 사용하여 흉선 로브 주위의 결합 조직을 제거 및 / 또는 날카로운 곡선 가위. 아래에서 또는 결합 조직을 나머지를 통해 개별 로브를 들어 올릴 좋은 팁 곡선 포셉 한 쌍을 사용합니다.
    참고 : 직접 흉선을 파악하지 마십시오.
  6. PBS를 포함하는 15 ML 원뿔 ....

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Results

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이러한 양 및 음의 선택과 같은 T 세포 발달의 여러 측면의 흉선 슬라이스 지원 분석. 성공적인 실험 들어, 흉선 조각의 품질이 중요하다. 따라서, 흉선 슬라이스는 흉선 조직의 무결성을 보장하기 위해 검사되어야하고 흉선 슬라이스를 둘러싼 아가 그대로 (도 1a)된다. 아가로 오스는 흉선 조직으로 이전의 수의 상당한 감소를 유발 손상 될 때, 표면 장력이 저하 될 수있다. 따라서, 조직 손상이나 흠의 표시와 흉선 조각 / 아가로 오스의 눈물 (그림 1B) 폐기해야합니다.

TCR 트랜스 제닉 (Tg)가 마우스 인해 종종 polyc 위에 포지티브 선택 빈도를 증가마다 흉선 세포의 표면 상에 정의 된 기능적 TCR 발현에 흉선 선택 공부 채용lonal 인구. 양성 선별의 각.......

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Discussion

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여기에서 우리는 흉선 조각 및 유동 세포 계측법에 의해 중첩 사전 선택 MHC 클래스 I 제한 TCR 유전자 변형 흉선 세포의 효율적인 양성 및 음성 선택의 대표적인 결과의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 시스템은 작용제 항원 음성 선별 및 흉선 T에 등록 개발 11,12의 존재하에 예비 선택 DP의 흉선 (32)로부터 MHC 클래스 II 제한 CD4 + T 세포의 양성 선별을 지원하기 위해 유사한 성공 사용되었으며 36,38,39,43,44. 이 프로토콜은 유전자 변형 흉선 또는 간질 세포 집단뿐만 아니라 억제제, 정의 된 펩티드의 존재 또는 부재 흉선 선택 공부 변형 될 수있다. 흉선 조각은 또한 흉선 세포 하위 집합이 아닌 다른 세포 집단의 오버레이 의무가 있습니다. 예를 들어, 최근에 효율적 조직으로 이전 및 음성을 지원할 수 selectio 흉선 슬라이스에 중첩하는 수지상 세포를 나타내었다n 및 .......

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Disclosures

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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원고에 대한 의견을 제시해 주신 Marilaine Fournier님과 기술적 도움을 주신 Josée Tessier님께 감사드립니다. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1 #4175는 NIH의 NIAID 교환 프로그램을 통해 획득했습니다. 이 연구는 SickKids Foundation 및 CIHR-IHDCYN(NI15-002)의 보조금, CIHR-III(MOP-142254)의 운영 보조금, FRQS(Établissement de jeunes chercheurs) 및 Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation의 창업 자금으로 제공됩니다. HJM은 FRQS의 주니어 1 장학생, CIHR New Investigator(MSH-141967) 및 Cole Foundation Early Career Transition 상 수상자입니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
비브라톰라이카 바이오시스템즈VT1000S 
NuSieve GTG AgaroseLonza50080저융온 아가로스
임베딩 몰드 (잘림 - T12)폴리시언스1898622 mm x 22 mm 정사각형, 12 mm x 12 mm로 잘린
양면 준비 블레이드Personna74-0002
티슈 접착제3M 1469SB
0.4 &마이크로; m 세포 배양 인서트 BD Falcon353090테스트 된 여러 브랜드 중, 이들은 최고의
Dulbecco의 인산염 완충 식염수ThermoFisher21600-010
RPMI-1640 L- 글루타민Wisent350-000-CL
태아 소 혈청Wisent080-110열 비활성화
L-글루타민, 200 mMWisent609-065-EL 슬라이스 상단의 세포를 유지했습니다.
페니실린/스트렙토마이신, 100xWisent450-201-EL
2-메르캅토에탄올Alfa AesarA15890
15ml Tenbroeck 티슈 그라인더Wheaton357426
나일론 메쉬 필터구성 요소 공급U-CMN-255
마이크로 원심분리기 튜브 샘플 유봉Bel-ArtF19922-0000
40 & 마이크로; m 나일론 셀 스트레이너BD Falcon352340
펜치 이녹스 팁Dumont RS-5047세밀한 팁 곡선형 펜치, 크기 .17 x .10 mm
마이크로 펜치Dumont RS-5090 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
  2. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  3. Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N.

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