여기에서 우리는 신선한 냉동 모두 뇌 조직에서 신경 앙상블 별점이 발현 분자 변화를 연구하는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 프로토콜을 제안한다. 동결 조직의 사용은 유용한 동물 피험자의 사용을 최대화하기 위해 다수의 세션을 통해 많은 뇌 영역의 FACS 분리 할 수있다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 신선한 및 냉동 쥐 뇌 조직 FOS를 발현하는 신경 세포의 유전자 발현 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신경 가소성 및 학습 행동의 분자 변화의 연구는 협회를 알게을 중재 신경 앙상블라고 띄엄 띄엄 분산 활성화 된 뉴런의 특정 세트의 연구에 전체 뇌 영역의 연구로 전환된다. (FACS)을 정렬 형광 활성 세포는 최근 성인 쥐의 뇌 조직에 최적화 신경 마커 NeuN과에 Fos 단백질, 강력하게 활성화 된 신경 세포의 마커에 대한 항체를 사용하여 활성화 된 뉴런의 분리를 허용하고있다. 지금까지에 Fos 발현하는 신경 세포와 다른 세포 유형은 긴 처리 일 길고 복잡한 행동 절차 후 평가하기 위해 뇌 샘플을 허용 매우 제한된 숫자를 수반 신선한 조직에서 분리 하였다. 이십일일 - 여기에서 우리는 등쪽 선조체의 신경과에 Fos mRNA의 별점이 발현의 수익률이 3 -80 ºC에서 동결 갓 해부 조직과 조직 사이의 유사한 것으로 나타났다. 또, 표현형 확인냉동 조직은 또한의 FACS 분리에 사용할 수 있음을 나타냅니다 신경의 평가 유전자 발현 (NeuN), 성상 세포 (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) 및 microgial (Iba1) 마커에 의한 NeuN 양성 및 NeuN 음성 분류 세포의 아교 세포 유형. 전반적으로, 이는 수집 해부 복수 FACS 세션을위한 뇌 조직을 고정 할 수있다. 이것은 종종 길고 복잡한 행동 절차를 거친 유용한 동물 대상에서 획득 된 데이터의 양을 최대화한다.
서론
학습하는 동안, 동물은 매우 구체적인 자극의 복잡한 세트 사이의 연결을 형성한다. 이것은 고해상도 정보 신경 앙상블이라 띄엄 띄엄 분산 된 뉴런의 특정 패턴 내의 변화에 의해 인코딩 될 것으로 생각된다. 신경 앙상블은 최근 강하게 행동이나 큐 노출시 활성화 된 예에 Fos, 아크 및 Zif268 및 신경 세포에서의 단백질 제품으로 즉시 초기 유전자 (IEGs)의 유도에 의해 확인되었다. 특히 상황과 큐 - 특정 배운 행동 1-4에 인과 역할을하는 것으로 나타났다 신경을 FOS는 발현. 따라서, 이러한 활성화에 Fos 발현하는 신경 세포 내에서 고유 분자 neuroadaptations은 중독과 외상 후 스트레스 장애 (PTSD) 5 정상적으로 학습과 이상 학습 장애 동안 형성된 협회를 알게 인코딩 신경 메커니즘에 대한 상위 후보입니다.
Fluore에서 scence 활성화 된 셀 정렬 (FACS)는 최근에 Fos 발현하는 신경 세포 내에서 고유 분자 neuroadaptations의 분석을 허용했다. 유세포 셀은 광 산란 특성에 따라 면역 세포를 특성화하고 분리 1960 -6,7- 개발되었다 정렬 및 긴 면역학 및 암 연구에 사용되었다....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 실험은 실험 동물 (16)의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 수행 하였다.
참고 : 달리 명시되지 않는 한 얼음에 보관 된 사용 낮은 결합 원심 분리기 튜브 아래의 모든 단계.
조직 컬렉션 전에 1. 준비
- 4 O C.에 원심 분리기를 설정
- 화재 폴란드어 감소 약 1.3의 직경, 0.8, 각 샘플에 대한 0.4 mm와 3 개의 유리 파스퇴르 피펫 세트.
- 감기 버퍼 1 ml에 포함 된 표시 1.7 ml의 튜브를 준비하고 얼음에 튜브를 유지.
- 매트릭스, 주걱과 절개를 수행 할 유리판 (또는 반전 유리 페트리 접시)를 슬라이스 뇌를 포함하는 얼음 트레이를 준비합니다. t을 눌러 모든 악기를 건조 유리 접시와 사용 조직 종이에 사전 진정 두 개 이상의 면도날발행물.
- 조직 수집 전에, 30 분 동안 실온 (RT)에서의 효소 용액을 해동.
2. 조직 수집 및 해부
- 조직 수집하기 전에 행동이나 약물 치료 90 분을 시작합....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
급성 필로폰 주사 후 한 쥐에서 신선한 냉동 등쪽 선조체 조직 FOS를 양성과에 Fos 음이 신경 세포를 정렬.
위에서 설명한 프로토콜은 필로폰 (5 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사 후 한 쥐의 등쪽 선조체 90 분 FOS를 양성과에 Fos 음이 신경 세포를 정렬하기 위해 사용되었다. 자신의 홈 케이지에서 순진한 쥐를 대조군으로 사용 하였다. 지느러미 선조체 조직이 처리 된 중 즉시 모음 (신선한 조직) 또는 냉동 및 1, 7, 21 일 -80 ºC에 저장 후 처리 후. 이러한 동결 시점의 결과는 서로 차이가 없었다 때문에 데이터 모았다.
악기에 정렬 조건을 설정하려면, 하나 홈 케이지 제어 또는 methampheta에서 (전술) 제어 샘플내 주입 그룹이.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
FACS는 어느 신선하거나 냉동 성인 뇌 조직의 신경 세포 및 다른 세포 유형을 정렬하기 위해 사용될 수있다. 서론에서 언급 한 바와 같이, 냉동 조직을 사용하는 능력은 중독 연구에 자기 관리 및 재발 연구 등 복잡하고 연장 된 행동 절차를받은 동물에서 샘플의 최적 활용을 할 수 있습니다. 2 시간 이상, 모든 동물이 필요합니다 - 이러한 행동 절차는 보통 1 소요됩니다 - 같은 날 13,18 테스트 할 (10 ~ 20 총). 그것은 뇌 해부, 세포 분리, permeabilization 및 immunolabeling를 포함 4 갓 해부 뇌 조직 샘플을 처리하기 위해 ~ 4 시간이 걸립니다. 30 분 - 처리 후, FACS에 의해 각각의 샘플을 분류하면 (20) 사이에 걸립니다. 용해 버퍼에 정렬 된 셀을 가열하고 최종 단계는 추가로 30 분을 필요로한다. 총 ~ 7 시간은 최종 RNA 함유 세포 용해 액 단계로 뇌 해부에서 필요합니다. 그러나, 전체 꼰 로프를 고정 할 수있게되었습니다NS 또는 갓 즉시 테스.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 NIDA 교내 연구 프로그램(Bruce T. Hope, Yavin Shaham)의 지원을 받았습니다.F.J.R.은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)이 후원하고 오크리지 과학교육연구소(Oak Ridge Institute for Science and Education)가 관리하는 NIDA 연구 참여 프로그램(Research Participation Program)에 임명되어 지원을 받았으며, CONICYT 및 Universidad de los Andes가 관리하는 Becas-Chile 장학금으로부터 추가 재정 지원을 받았습니다. 칠레 산티아고. 존스 홉킨스 FACS 핵심 시설은 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)로부터 P30AR053503 수상의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 브레인 매트릭스 | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | 관상 뇌 절편을 얻기 위해 |
| Hibernate A 저형광 | Brain Bits | HA-lf | Buffer A는 프로토콜의 해리에서 고정 단계까지 조직과 세포를 처리하는 데 사용됩니다 |
| 프로토콜의 Accutase | Millipore | SCR005 | 효소 용액은 trituration |
| 전에 조직의 효소 분해에 사용됩니다.Protein LoBind Tube 1.5 ml, 프로토콜 | 중 세포 손실 방지를 위한 | PCR clean Eppendorf | 22431081 |
| Cell Strainer, 40 µ m | BD Falcon | 352340 | - 세포 현탁액 |
| Cell Strainer, 100 µ m | BD Falcon | 352360 | 세포 현탁액을 필터링하기 |
| Falcon 5 ml 라운드 바닥 폴리스티렌 시험관 세포 여과기 스냅 캡 | BD Bioscience | 352235 | 통과하기 전에 세포 현탁액을 필터링하기 위해 |
| , 유리 | NIH 공급 | 6640-00-782-6008 | 조직 분쇄 |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, 클론 A60 (마우스 단클론) 항체 | EMD Millipore | FCMAB317PE | 뉴런을 감지하는 항체 |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | 세포 신호 전달 기술 | Fos 발현 세포를 검출하는 | 8677 |
| DAPI | Sigma | D8417 | 은 핵 |
| PicoPure RNA 분리 키트 | Applied Biosystems | KIT0204 | 이 키트에는 6.14단계를 위한 RNA 추출 버퍼가 포함되어 있습니다. RNA |
| 에서 cDNA를 합성하기 위해 | Superscript III 첫 번째 가닥 cDNA 합성 시스템 | Invitrogen | 18080-051 |
| . | cDNA | ||
| TaqMan Advance Fast Master | 응용 바이오시스템. | TaqMan 프로브를 사용하여 PCR을 수행하는 | 4444963 |
| Fos TaqMan 프로브 | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan 프로브/primers |
| NeuN TaqMan 프로브 | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | 뉴클레오티드 서열 |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | 신경 유전자 마커에 대한 | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG |
| NeuN 리버스 프라이머 | 응용 바이오시스템. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | 뉴클레오티드 서열 |
| Gfap TaqMan 프로브 | 응용 바이오시스템. | Rn00566603_m1 astrocityc 유전자 마커용 TaqMan 프로브/프라이머 | |
| iba-1 TaqMan 프로브 | 응용 바이오시스템. | Rn00574125_g1 마이크로글리아 유전자 마커용 TaqMan 프로브/프라이머 | |
| Gapdh TaqMan 프로브 | Applied Biosystems. | 참조/하우스키핑을 위한 | CTCATGACCACAGTCCA |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | 참조/하우스키핑을 위한 | GACAACTTTGGCATCGTGGAA |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | 참조/하우스키핑을 위한 | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA |
| Oligo2 TaqMan 프로브 | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | 희소돌기아교세포 유전자 마커를 위한 TaqMan 프로브/프라이머 |
| P1000 피펫터 | Rainin | 17014382 | 경증 조직 분쇄의 경우 3.1 및 3.3 단계, 세포 재현탁을 위한 6.7 단계에서 팁 직경이 큰 피펫으로 언급됩니다 |
| 7500 Fast Real-time PCR 시스템 | Applied Biosystems. | 정량 PCR | |
| FACSAria I 세포 분류기 | BD Biosciences | FACS 분류를 위한 |
참고문헌
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell ne....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
