Summary
Arteriële stijfheid is een belangrijke factor bij hart-en vaatziekten en pulsgolfsnelheid (PWV) kan als een surrogaat index voor arteriële stijfheid worden beschouwd. Dit protocol beschrijft een beeld processing algoritme voor het berekenen van PWV in muizen op basis van echografie beeldverwerking die van toepassing zijn op verschillende arteriële sites is.
Abstract
Arteriële stijfheid kan worden geëvalueerd door het berekenen pulsgolfsnelheid (PWV), dat wil zeggen, de snelheid waarmee de pulsgolf reist in een leiding vat. Deze parameter wordt steeds onderzocht in kleine knaagdiermodellen waarin het wordt gebruikt voor het beoordelen van veranderingen in vasculaire functie van het specifieke genotypen / of behandelingen voor het karakteriseren van cardiovasculaire ziekte progressie. Dit protocol beschrijft een beeldverwerkingsalgoritme die leidt tot niet-invasieve arteriële PWV metingen bij muizen met alleen ultrasone (US) beelden. De voorgestelde techniek is gebruikt om abdominale aorta PWV beoordelen muizen en leeftijdsgebonden veranderingen te evalueren.
Abdominale aorta US scans verkregen uit muizen onder verdoving middels gasvormige specifieke US apparaat uitgerust met hoogfrequent US probes. B-modus en Pulse-Wave Doppler (PW-Doppler) beelden worden geanalyseerd om een diameter van respectievelijk verkrijgen en gemiddelde snelheid momentane waarden,. Daartoe worden randdetectie en bodemaanpassing technieken toegepast. De single-beat gemiddelde diameter en snelheid golfvormen tijdaangepaste en gecombineerd om het diameter velocity (lnD-V) loop te bereiken. PWV waarden worden verkregen uit de helling van het lineaire gedeelte van de lus, die overeenkomt met de vroege systolische fase.
Met deze benadering, anatomische en functionele informatie over de muis abdominale aorta niet invasief verwezenlijkt. Waarbij de verwerking van echografiebeelden alleen kan het een nuttig instrument voor de niet-invasieve karakterisatie van verschillende arteriële sites in de muis qua elastische eigenschappen vertegenwoordigen. De toepassing van de onderhavige techniek kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere vasculaire gebieden, zoals de halsslagader, waardoor de mogelijkheid om een multi-site arteriële stijfheid beoordeling te verkrijgen.
Introduction
Muizenmodellen steeds toegepast voor het onderzoeken van cardiovasculaire ziekte (CVD) en vooral gebruikt in longitudinale studies die de karakterisering van verschillende stadia van ziekteontwikkeling 1 mogelijk. Elastische eigenschappen van grote slagaders zijn aan andere ziekten lijden vanuit een technisch oogpunt, kan arteriële stijfheid worden beoordeeld door het meten polsgolfsnelheid (PWV), die de snelheid waarmee de puls golf reist in een leiding vat 2 vertegenwoordigt. Vanwege de klinische relevantie is het steeds gemeten zelfs in preklinische diermodellen kleine 3.
Verschillende technieken zijn beschikbaar voor het beoordelen PWV in muizen. Invasieve benaderingen zijn gebaseerd op het gebruik van katheter-tip drukopnemers. PWV wordt beoordeeld door het verwerven druksignalen op twee verschillende arteriële plaatsen en verdelen van de afstand tussen de twee meetgebieden sieten tegen de tijd verschuiving tussen de signalen 4. Het belangrijkste nadeel in verband met dergelijke technieken is dat zij offeren van dieren voor de beoordeling van de afstand tussen de twee meetpunten en dus kan niet worden gebruikt in longitudinale studies. Om deze beperking te overwinnen, niet-invasieve benaderingen, gebaseerd op verschillende beeldvormende technieken ontwikkeld. Eerdere studies hebben PWV evaluaties bij muizen verkregen met de transittijd methode en snelheid-gecodeerde magnetische resonantie beeldgegevens en 5 gepulste Doppler signalen 6 vermeld. Echter, de PWV waarde verkregen met deze methoden is een regionale evaluatie van de arteriële stijfheid. In feite, het vertegenwoordigt een gemiddelde waarde, goed voor verschillende slagaders in termen van omvang en elastische eigenschappen. Bovendien, dit soort van evaluaties vereist de beoordeling van de afstand tussen de twee metingen sites die een bron van fouten die kunnen influence het eindresultaat.
PWV kan worden beoordeeld aan de hand van de diameter-velocity (lnD-V) lus 7. Deze methode is gebaseerd op de gelijktijdige evaluatie diameter en stroomsnelheid waarden in een geselecteerd vat. Volgens deze benadering wordt de lnD V-lus verkregen door het uitzetten van de natuurlijke logaritme diameterwaarden vs gemiddelde snelheidswaarden en PWV wordt geschat door het berekenen van de helling van het lineaire gedeelte van de verkregen lus overeenkomt met de vroege systolische fase. Wat betreft de praktische toepassing van deze methode, hebben eerdere werken reeds gerapporteerde resultaten over de toepassing in een in vitro opzet systeem 7 en het gebruik ervan voor de beoordeling van zowel carotis femorale PWV bij mensen 8.
Het belangrijkste doel van deze studie is een gedetailleerde beschrijving van een beeld processing algoritme dat een niet-invasieve arteriële PWV metingen in muizen met U biedt biedenAlleen S beelden. De voorgestelde benadering maakt de evaluatie van de lokale arteriële stijfheid door middel van het verwerken van zowel B-modus en gepulste Doppler Wave (PW-Doppler) beelden en kunnen worden toegepast bij slagaderen van belang, zoals de abdominale aorta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese richtlijn (2010/63 / EU) en de Italiaanse wet (D.Lvo 26/2014), en volgde principes van proefdier zorg. De lokale ethische goedkeuring Panel ingestemd met de studie.
1. Imaging Procedure
- Plaats de muis in een anesthesie inductie kamer gevuld met 2,5% isofluraan in 1 l / min zuivere zuurstof. Controleer of de diepte van de anesthesie door ongevoeligheid tot teen knijpen.
- Leg het dier op een temperatuur gecontroleerde bord in een liggende positie. Bevochtig de ogen van het dier met ogenzalf, teneinde te vermijden drooglopen. Leveren verdoving gasstroom (1,5% isofluraan) door het plaatsen van de neus van de muis in de speciale neuskegel. Pas indien nodig het percentage van isofluraan van geval tot geval, afhankelijk van het dier onder studie. Bevestig de raad van bestuur temperatuur van 40 ° C.
- Coat de vier poten van het dier met geleidende pasta en plak ze op de ECG elektroden ingebed in deboord. Meet de lichaamstemperatuur met een rectale sonde smeren met vaseline. Controleer of alle fysiologische metingen (ECG en ademhaling signaal evenals temperatuur) juist zijn overgenomen en weergegeven.
- Verwijder het haar chemisch uit de buik met ontharingscrème en smeer het met akoestische koppeling gel.
- Plaats de (13-24 MHz) US probe in de mechanische arm.
- Bevestig de Amerikaanse sonde evenwijdig aan het dier en zijn positie aan te passen om het lengteprofiel beelden van de abdominale aorta met het gebied van belang in het focale gebied te verkrijgen.
- Verzamel anatomische informatie.
- Klik op de knop waardoor de hoge framerate ECG-gated overname 9, kies dan een frame rate overname gelijk aan 700 fps en start de acquisitie. Opmerking: Zo anatomische beelden van het vaartuig bij één hartcyclus worden verkregen.
- Verzamel stroomsnelheid informatie. </ Strong>
- Met dezelfde scan projectie op het PW-Doppler knop, zet het monstervolume in het midden van het vat en afbeeldingen waarborgen dat de cine lus niet korter dan 3 s verwerven. Deze gegevens ontvangt gegevens handhaven van de hoekcorrectie zo klein mogelijk wordt aangepast van geval tot geval op basis van de Amerikaanse projectie verkregen.
- Verwijder het dier uit de temperatuurgecontroleerde board en wachten op volledig herstel.
LET OP: In onze ervaring dit duurt ongeveer 10 minuten. Niet verlaten en dierlijke onbeheerd totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven.
2. Post-Processing
- Export B-modus en PW-Doppler beelden als DICOM-bestanden en deze opslaan op een personal computer. Transformeer PW-Doppler DICOM bestanden naar .tiff beelden.
- Werkwijze B-modus beelden.
- Importeer het corresponderende DICOM-bestand met behulp van de speciale Graphical User Interface (GUI).
- Om contouren initialiseren, trek een lijn in de buurt van de muur van het vat (enkele klik voor het starten van het en dubbelklik voor het beëindigen van het) en dubbelklik op dicht bij de dichtbij muur. Een lijn parallel aan die dicht bij de muur verschijnt automatisch. Breng het algoritme op een enkel frame door op de knop "ANALYSE" knop.
- Controleer het resultaat. Als de randen correct geïdentificeerd (bijv., Hebben de evolutie van de geïnitialiseerde punten zowel het achterste en de voorste wand gevonden), toe te passen het algoritme over het geheel cine-loop door te klikken op de knop "GO". Als de randen niet correct geïdentificeerd, wist ze door te klikken op "Clear Contour" en initialiseren ze weer door het herhalen van punt 2.2.2.
Opmerking: Het algoritme is gebaseerd op randdetectie en bodemaanpassing technieken en is eerder in detail beschreven 10. - Het verkrijgen van het uiteindelijke resultaat door op de "record" knop en sla de corrEN ANTWOORD .mat file welke waarden onmiddellijk diameter met betrekking tot een enkele hartcyclus bevat.
- Open de GUI voor de lnD-V loop implementatie.
- Op de "velocity" knop om PW Doppler-beeld verwerking die leidt tot een enkele slag betekenen velocity curve starten.
- Identificeer de PW-Doppler trace en zoek de regel die overeenkomt met een snelheid gelijk aan nul door op de "WHITE LINE" knop.
- Voer snelheid kalibratie en tijd kalibratie met behulp van de 'Velocity "en" TIME "knop (in het deelvenster), respectievelijk. Door op deze knoppen maakt het mogelijk om een lijn waarvan de lengte overeenkomt met de kalibratiefactor ingebracht trekken.
- Selecteer handmatig een ROI met de fysiologische signalen met behulp van de "ROI PHYSIO" knop.
- Selecteer handmatig een ROI met de PW-Doppler trace door op de "ROI signaal" knop.
- Click op de "ANALYSE" knop en controleer of de envelop is geïdentificeerd. Als het resultaat niet bevredigend is, verander dan de drempel (door het intikken van de nieuwe waarde in de "Velocity Threshold" bewerkbare tekst veld) en druk nogmaals op de "ANALYSE" knop. Tune de drempel van geval tot geval, afhankelijk van de kwaliteit van de beelden. Druk op de "UITWERKING" knop.
- Zoek de R-toppen van het ECG-signaal en dus verdeel de snelheid enveloppe signaal door te klikken op de knop 'Update'. Kies beats die niet door lawaai beschadigd zijn of zich in de inspiratie fase door te klikken op de "KIES BEATS" knop. Zo krijgen één-slag betekenen snelheidsgolfvorm.
- Gebruik de Fast Fourier Transform methode om de geselecteerde beats interpoleren in het frequentiedomein en maken ze allemaal uit hetzelfde aantal punten, zoals beschreven in referentie 11. automatisch uit te voeren deze operatie door gewoon op de return toets op het toetsenbord van de computer zodra de beats zijn geselecteerd. Als de "gemiddelde snelheid" checkbox is aangevinkt de interne ritme gemiddelde snelheid signaal wordt bereikt door het verdelen van de maximale snelheid curve door twee, hypothese een parabolische snelheidsprofiel 12. Druk op de knop "OK".
- Klik op de "diameter" knop. Interpoleren de enkele-beat diameter golfvorm in het tijddomein om een signaal single-beat diameter met dezelfde sample frequentie als de één-beat snelheid signaal door op de "Interpolate" knop te verkrijgen. Klik op de knop "OK".
Opmerking: Om de enkelvoudige slag diameter en gemiddelde snelheid bochten met dezelfde samplefrequentie en hetzelfde aantal gegevenspunten worden geïnterpoleerd ze in het frequentiedomein. - Selecteer de "tweede afgeleide" benadering als de uitlijning methode (boven de grafiek weergeven van de golfvormen diameter en snelheid) en klik op de "UPDATE" button. De twee curves automatisch-time uitgelijnd met behulp van de tweede afgeleide methode 14 zijn.
- Bouw de uiteindelijke lnD-V lus door het uitzetten van de natuurlijke logaritme van de enkele-beat diameter waarden ten opzichte van de enkele-beat bedoel velocity waarden. Dit gebeurt automatisch wanneer de twee golfvormen worden uitgelijnd. Opmerking: De punten gelegen tussen de 5% en 90% van de maximale waarde van de één-slag betekenen velocity curve worden automatisch gevonden en een lineaire interpolatie op deze punten wordt aangebracht op de helling van het lineaire gedeelte van de lus evalueren.
- Bereken PWV volgens de volgende vergelijking 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De voorgestelde aanpak is toegepast op muizen abdominale aorta in een eerdere studie 11. De volgende afbeeldingen tonen de resultaten van de toepassing van de beschreven aanpak op echte muizen beelden. Deze gegevens zijn afkomstig van een enkel dier (wildtype muizen, 13 weken oud, stam: C57BL6, gewicht: 33 g) in het bijzonder figuur 1 representeert het resultaat van de analyse van de echografiebeelden. Randdetectie en bodemaanpassing technieken toegepast op B-modus beelden die met de hoge framerate ECG-gated modaliteit bieden de diameter golfvorm; anderzijds, de identificatie van de PW-Doppler signaalomhullende leidt tot de enkele slag betekenen velocity curve beoordeling. De evaluatie van de enkel-beat gemiddelde snelheid golfvormen omvat het gemiddelde van gegevens uit verschillende hartcycli. Voor de vermelde gegevens, de standaarddeviatie van de snelheid curves (berekend als het gemiddelde van de standaarddeviatie verkregen opelk tijdstip) is 0,0137 m / sec.
Single-beat diameter en de gemiddelde snelheid golfvormen worden geïnterpoleerd in zowel de frequentie en tijd domein en vervolgens tijdgekoppelde (Figuur 2A). De lnD-V lus wordt verkregen door het uitzetten van de natuurlijke logaritme diameter waarden versus de gemiddelde snelheidsmetingen, zoals getoond in figuur 2B. PWV wordt bepaald door berekening van de helling van het lineaire gedeelte van de lus, waarvan bekend is dat overeenkomt met de vroege systolische fase. Dit gedeelte wordt automatisch geïdentificeerd als die welke overeenkomt met de upslope van de gemiddelde snelheid curve. Deze cijfers geven aan dat de beeldverwerking verrichtingen die voor de uitvoering van de voorgestelde techniek leidt tot een definitieve lnD-V lus die vergelijkbaar is met deze verkregen bij toepassing van een soortgelijke benadering 7. Dit suggereert dat deze techniek een alternatief voor niet-invasieve PWV beoordeling in muizen kunnen vertegenwoordigen.
Figuur 1: Verwerking van B-modus en PW-Doppler Images. B-modus beelden (a) worden verwerkt met randdetectie en bodemaanpassing technieken. PW Doppler-beelden (b) worden verwerkt voor de identificatie van de omhullende signaal waaruit de één-slag betekenen snelheidsgolfvorm wordt verkregen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Implementatie van lnD-V Loop voor PWV berekening. Diameter en gemiddelde snelheid golfvormen verkregen van B-modus en PW-Doppler beeldverwerking. (A). De lnD-V lus wordt verkregen door het uitzetten van de natuurlijke logarithm van de diameterwaarden tegen de gemiddelde snelheid waarden (b). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie heeft beeldverwerkingsalgoritme basis van de lnD V-lus voor PWV beoordeling in muizen is beschreven. De voorgestelde benadering is gebaseerd op de verwerking van echografiebeelden alleen en dus kan een alternatief voor de bestaande technieken 6, 13 voor de evaluatie van arteriële stijfheid in muismodellen vertegenwoordigen. In feite omgekeerd invasieve methoden 6 die gebaseerd zijn op het verkrijgen van intra-arteriële druk signalen en vereisen het dier wordt gedood, deze techniek is volledig niet-invasieve en kunnen bijgevolg bijzonder geschikt bij longitudinale studies. Bovendien geeft een evaluatie van arteriële stijfheid die lokale en regionale niet. Hoewel de voorgestelde werkwijze bekend worden beïnvloed door de gereflecteerde golf 15, kan een nauwkeuriger PWV oordeel te geven ten opzichte van andere US-gebaseerde benaderingen voor lokale PWV evaluatie zoals die gebaseerd op de stroom-gebied techniek 13 waarop de verwerving van kleur-stroomgegevens in doorsnedeprojectie vereist. De PWV waarde zoals bepaald in de "Representatieve resultaten", gelijk aan 1,69 m / sec, in overeenstemming met hetgeen Volgens referentie 11: in feite, in deze studie abdominale aorta PWV was gelijk aan 1,91 ± 0,44 m / sec volwassen muizen en 2,71 ± 0,63 m / sec in de oude dieren.
Om fouten in PWV assessments een minimum te beperken, veel aandacht moet worden besteed bij de verwerving US beelden. In het bijzonder moet B-modus beelden worden verkregen met zeer duidelijke voorste en achterste wanden teneinde een diameter filter, dat niet is aangetast door ruis bereiken. Wat PW Doppler-beelden, moet de hoekcorrectie worden geminimaliseerd. De waarde van 60 graden kan voorstellen, in de meeste gevallen een goed compromis tussen een goede lange as aanzicht en een goede benadering van snelheidscomponenten. Furthermore, bij longitudinale studies met herhaalde metingen op moet worden genomen in het vat beeldvorming op dezelfde wijze, dat wil zeggen, met dezelfde scan projectie.
De belangrijkste beperking van de gepresenteerde benadering betreft het feit dat de beelden nodig zijn voor de gemiddelde diameter en snelheidsgolfvorm evaluaties niet gelijktijdig verkregen. Dit gebrek aan gelijktijdigheid kan een bron van fouten voor PWV beoordeling vertegenwoordigen en de meting minder nauwkeurig. Bovendien zou een echte gelijktijdige aankoop van een betere tijd afstemming tussen de twee curves te waarborgen en problemen in verband met de hartslagvariabiliteit te voorkomen. Vanuit praktisch oogpunt zou een andere beperking het gebrek aan beschikbaarheid van de hoge framesnelheid ECG-gated modaliteit zijn. Dit probleem kan gedeeltelijk worden ondervangen door het ophalen van afbeeldingen in B-modus modaliteit en instellen verwervingsparameters om de hoogste temporele resolutie. In dit geval moet de diameter signaalgedeeld door de ECG basis en verwerkt op dezelfde wijze als het snelheidssignaal, zodat een golfvorm tel diameter te verkrijgen. Echter, in sommige omstandigheden, de verkregen tijdsresolutie ongeschikt maakt om een geldig signaal diameter bereiken. Toekomstige wijzigingen van de beeldverwerking keten gericht om deze beperkingen te overwinnen zou de techniek te verbeteren en leiden tot een nauwkeuriger beoordeling van de lokale arteriële stijfheid.
Toekomstige toepassingen van de gepresenteerde aanpak zou betrekking hebben op andere arteriële districten. Effectief, dankzij het feit dat de overname van B-mode en slechts PW Doppler-beelden zijn, kan deze werkwijze gemakkelijk worden toegepast op andere arteriële sites, zoals de halsslagader, waardoor een multi-site arteriële stijfheid beoordeling. Een hogere frequentie sonde moet worden gekozen voor meer oppervlakkige arteriën als de halsslagader; in ieder geval moet de keuze van de sonde korrekte weergave van de slagader voor thij dieren in de studie. Tot slot kan het beschreven systeem biedt een eenvoudige manier om de functionele eigenschappen van verschillende slagaders in muismodellen beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VEVO2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound equipment | |
| MS250 Ultrasound Probe | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound probe | |
| EKV Software | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | Software | |
| Matlab R2015a | MathWorks Inc, Natick, MA, USA | Software | |
| Conductive Paste | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Petroleum Jelly | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Depilatory Cream | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Acoustic Coupling Gel | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Developed Matlab Software | The authors are willing to collaborate with those researchers who are interested in the software and to make the software available under their supervision |
References
- Zaragoza, C., et al.
- Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
- Wang, Y. X., et al. Increased aortic stiffness assessed by pulse wave velocity in apolipoprotein E-deficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278, 428-434 (2000).
- Mitchell, G. F., Pfeffer, M. A., Finn, P. V., Pfeffer, J. M. Comparison of techniques for measuring pulse-wave velocity in the rat. J Appl Physiol. 82 (1), 203-210 (1997).
- Parczyk, M., Herold, V., Klug, G., Bauer, W. R., Rommel, E., Jakob, P. M. Regional in vivo transit time measurements of aortic pulse wave velocity in mice with high-field CMR at 17.6 Tesla. J Cardiovasc Magn Reson. 12, 72 (2010).
- Hartley, C. J., Taffet, G. E., Michael, L. H., Pham, T. T., Entman, M. L. Noninvasive determination of pulse-wave velocity in mice. Am J Physiol. 273 (1), Pt 2 494-500 (1997).
- Feng, J., Khir, A. W. Determination of wave speed and wave separation in the arteries using diameter and velocity. J Biomech. 43 (3), 455-462 (2010).
- Borlotti, A., Khir, A. W., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., Vermeersch, S., Segers, P. Noninvasive determination of local pulse wave velocity and wave intensity: changes with age and gender in the carotid and femoral arteries of healthy human. J Appl Physiol. 113 (5), 727-735 (2012).
- Chérin, E., et al. Ultrahigh frame rate retrospective ultrasound microimaging and blood flow visualization in mice in vivo. Ultrasound Med Biol. 32 (5), 683-691 (2006).
- Gemignani, V., Faita, F., Ghiadoni, L., Poggianti, E., Demi, M. A system for real-time measurement of the brachial artery diameter in B-mode ultrasound images. IEEE Trans Med Imaging. 26 (3), 393-404 (2006).
- Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Sicari, R., Faita, F. Non-invasive assessment of pulse wave velocity in mice by means of ultrasound images. Atherosclerosis. 237 (1), 31-37 (2014).
- Nichols, W. W., O'Rourke, M. F. McDonald's Blood Flow in Arteries: Theoretical, Experimental, and Clinical Principles. , Arnold. London. 215-358 (1998).
- Williams, R., et al. Noninvasive ultrasonic measurement of regional and local pulse wave velocity in mice. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1368-1375 (2007).
- Penny, D. J., et al. Aortic wave intensity of ventricular-vascular interaction during incremental dobutamine infusion in adult sheep. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294, 481-489 (2008).
- Segers, P., et al. Wave reflection leads to over- and underestimation of local wave speed by the PU- and QA-loop methods: theoretical basis and solution to the problem. Physiol Meas. 35 (5), 847-861 (2014).
