Summary
Cet article décrit un protocole simple et reproductible pour manipuler des conditions d'oxygène dissous dans un environnement de laboratoire pour les études sur le comportement des animaux. Ce protocole peut être utilisé dans les milieux d'enseignement et de laboratoire de recherche pour évaluer la réponse de organismal des macroinvertébrés, poissons, amphibiens ou aux changements de concentration d'oxygène dissous.
Abstract
La capacité de manipuler l'oxygène dissous (DO) dans un environnement de laboratoire a une application importante pour enquêter sur un certain nombre de questions de comportement écologique et organismales. Le protocole décrit ici fournit une méthode simple, reproductible et contrôlée à manipuler DO pour étudier la réponse comportementale dans les organismes aquatiques résultant de conditions hypoxiques et anoxiques. Tout en effectuant un dégazage de l'eau avec de l'azote est couramment utilisé en laboratoire, aucune méthode explicite pour écologique application (aquatique) existe dans la littérature, et ce protocole est le premier à décrire un protocole pour dégazer l'eau pour observer la réponse de organismal. Cette technique et le protocole ont été développés pour une application directe pour les macroinvertébrés aquatiques; Cependant, les petits poissons, les amphibiens, et d'autres vertébrés aquatiques pourraient être facilement remplacés. Elle permet une manipulation aisée des niveaux d'OD allant de 2 mg / l à 11 mg / L, avec une stabilité pendant une période d'observation de l'animal 5 min.Au-delà d'une période d'observation de 5 min température de l'eau a commencé à augmenter, et à 10 min DO niveaux est devenu trop instable pour maintenir. Le protocole est extensible à l'organisme d'étude, reproductible et fiable, permettant une mise en œuvre rapide dans les laboratoires d'enseignement d'introduction et d'applications de recherche de haut niveau. Les résultats attendus de cette technique devraient se rapportent dissous changements d'oxygène à des réactions comportementales des organismes.
Introduction
L'oxygène dissous (DO) est un paramètre physicochimique clé importante dans la médiation d'un certain nombre de processus biologiques et écologiques dans les écosystèmes aquatiques. L' exposition à la sous-létale hypoxie aiguë et chronique de réduire les taux de croissance de certains insectes aquatiques et de réduire la survie des insectes exposés 1. Ce protocole a été développé pour fournir une méthode contrôlée pour manipuler les niveaux DO dans l'eau des cours d'eau pour observer les effets sur le comportement animal. Depuis la survie tous les organismes aquatiques aérobies dépend de la concentration en oxygène pour vivre et se reproduire, les changements dans la concentration de DO sont souvent pris en compte dans les changements de comportement par des organismes. Plus invertébrés aquatiques et les poissons mobiles ont été observés pour répondre aux faibles concentrations d'oxygène (hypoxiques) en cherchant des endroits avec DO plus 2,3. Pour moins les organismes aquatiques mobiles, des adaptations comportementales pour augmenter l'apport de DO peut être la seule option viable. L'ordre de macroinvertébrés aquatique de PlecOPTera (stonefly) a été noté pour effectuer des mouvements "push-up" pour augmenter le débit de l' eau, et l' absorption d'oxygène, à travers leurs branchies externes 4 - 6. Ces comportements adaptatifs ont été observés dans les milieux naturels et dans des expériences de laboratoire.
manipulation en laboratoire de DO dans l'eau ouvre des possibilités importantes pour les études sur le comportement des animaux, mais il existe des lacunes importantes dans le déploiement méthodologique. Par exemple, une étude a utilisé les grands aquariums pour évaluer le temps physiologique de réponse des graves Largemouth (Micropterus salmoides) aux environnements hypoxiques suivants gazage avec de l' azote, mais peu de détails est donnée pour la méthodologie 7. Une autre étude réalisée sur Zebra poissons (Danio rerio) décrit en utilisant de l' azote gazeux et une pierre poreuse de livrer du gaz à l' eau et réduire la DO de l'eau 8. Pour les applications basées sur la chimie, les méthodes de dégazage de solvants utilisent spécialisésappareil 9 - 11 pour éliminer l' oxygène de solvants, mais ne serait pas approprié pour les études sur le comportement des animaux. Bien que ces études utilisent des méthodes pour éliminer l'oxygène de l'eau, aucune méthode descriptive n'a pu être identifié qui permettrait à l'évaluation du comportement animal en réponse à des changements DO.
Ce procédé est décrit ci-après une tentative de décrire en détail un protocole de manipulation de DO de l'eau en utilisant de l'azote gazeux. En outre, cette méthode a été développée vers l'observation des relations entre le comportement de stonefly (tractions) et DO qui a été employé dans un laboratoire de biologie niveau de première année. L'un des principaux avantages de cette méthode est qu'elle peut facilement être effectuée dans un laboratoire avec verrerie et produits accessibles à la plupart des établissements d'enseignement secondaire et supérieur commun. Le protocole est également facilement adaptable, permettant aux individus à l'échelle de la procédure pour répondre aux objectifs fixés pour les applications de recherche ou d'enseignement.
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Protocol
Note: Cette expérience n'a pas utilisé les vertébrés et n'a donc pas besoin de l'approbation par l'Institut de Juniata College de protection des animaux et l'utilisation du Comité. Toutefois, pour les personnes en adaptant cette méthode pour une utilisation avec les vertébrés, l'approbation IACUC doit être recherchée.
1. Champ de prélèvement des échantillons
- Déterminer et évaluer les sites potentiels de terrain pour la capacité de recueillir, de stocker et de plécoptères de transport rapidement pour réduire au minimum le temps en transit avec un temps maximum recommandé en transit de 1 h.
- Effectuer un échantillonnage de kick-net sur le site de champ sélectionné suivant les procédures kick-net standards suffisamment de fois pour recueillir au moins 35 plécoptères 12.
- Recueillir 50 L d'eau des cours d'eau et de roches avec un diamètre maximum de 2 cm à partir de flux.
- Placez les aquariums dans un réfrigérateur réglé à la température du site de flux. Distribuer des roches collectées sur le site de flux dans les aquariums et remplir avec 4 L d'eau des cours d'eau par aquarium. Placez 20-30 Plécoptères recueillies par aquarium et placer une pierre de barbotage attaché à un bulleur d'aquarium dans chaque réservoir et tourner sur barboteurs pour ajouter en permanence l'air ambiant à l'eau.
- Autoriser les plécoptères pour ajuster au nouvel environnement dans les aquariums pour une période de 48 heures.
Figure 1. Mise en place pour la manipulation de l' oxygène dissous. (A) 1) Raccord pour tuyau de cuivre au mâle raccord cannelé 2) Emplacement du joint de bouchon pour examiner pour assurer le bien flacon d' étanchéité. (B) 1) 2 L bras latéral flacon rempli de 1,9 L d'eau 2) tube de gaz et d'un barboteur d'air (bleu) pour une utilisation dans un barbotage d'azote et de l' air ambiant bullage, respectivement 3) réservoir d'azote et les valeurs jaugés 4) 2 L flacon rempli de 0,4 L d'eau avec un tube à vide immergée 5) dissous oxymètre. S'il vous plaît cliquer ici pourvoir une version plus grande de cette figure.
2. Mise en place expérimentale
- Sur une paillasse, connectez un tube à vide à paroi standard pour le bras d'un côté 2 L bras latéral flacon comme le montre (1 dans la figure 1B).
- Remplissez le flacon avec 1,9 L d'eau des cours d'eau de 3 L récipients en plastique contenant de l'eau des cours d'eau recueillie dans un réfrigérateur réglé à 12 ° C.
- Placer le ballon et le tube sur un plateau assez grand pour contenir un bain de glace autour du ballon côté-bras sans obscurcir la vue de l'intérieur du flacon et remplir le bac avec de la glace.
- Percer deux trous de 3 mm de diamètre dans un bouchon en caoutchouc pour permettre le passage de 1) un tube de cuivre pour délivrer le gaz dans le récipient , et 2) la sonde d'un appareil à oxygène dans le 2 litres bras latéral flacon (1 sur la figure 1B) .
- Faire une incision latérale à partir du bord du bouchon à l'un des trous pour permettre aux sièges du fil de la sonde à oxygène dans le bouchon.
- Branchez un coupleur avec un tuyau mâle de 3 mmardillon à un morceau de tuyau en cuivre de 2 mm de diamètre (1 sur la figure 1A). Assurez-vous que ce tuyau est assez long pour atteindre à moins de 10 cm du fond du ballon tout en atteignant à travers le bouchon.
- Placer le tube avec raccord si le deuxième trou dans le bouchon jusqu'à ce que la longueur du fond du bouchon est suffisant pour atteindre au moins de 10 cm du fond du flacon.
- Connecter un 0,75 m de longueur, tube de gaz en polyéthylène à paroi mince avec un diamètre de 3 mm au coupleur sur le tuyau.
- Faites glisser la fois la sonde DO et le tuyau de cuivre dans le flacon et sceller le flacon avec le bouchon.
- Vérifier une parfaite étanchéité entre le bouchon et le flacon, ainsi qu'un ajustement serré entre le tube et le fil de sonde à l'intérieur du bouchon.
- Remplir un ballon de 1 L avec 0,4 L d'eau du robinet et placez à côté du plateau avec le bain de glace et fiole à vide.
- Immerger le tube en polyéthylène provenant du grand récipient sous vide dans l'eau du ballon de 1 litre. Fixer lele tube avec du ruban adhésif de telle sorte qu'elle reste submergée par l'expérience.
- Raccorder la conduite de gaz de 3 mm de diamètre de la fiole à vide dans une chambre à air de barbotage d'aquarium. Commencez à faire des bulles de l'eau dans le flacon de 2 litres en branchant le bulleur d'aquarium, qui introduit l'air ambiant et de l'oxygène à l'eau.
- Surveiller la concentration DO et de la température de l'eau avec le compteur DO pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que l'équilibre de la DO est établi dans la chambre de sorte que peu de changement dans DO est en cours.
3. Test de la stabilité de l'ensemble expérimental
- Tester chaque configuration pour DO la stabilité avant l'addition de plécoptères.
- Ajouter trois ou quatre roches au flacon de 2 litres de telle sorte que les perles ont substrat propice à des tractions.
- Commencez une manipulation d'essai de DO en débranchant le tube de gaz à partir du barboteur et l'attacher à la ligne de l'azote gazeux.
- Lancer barboter de l'azote à 20 pieds cubes par heure (CFH) pour environ 40s à 1 min.
- Une fois que la DO a chuté à moins de 0,5 mg / L de la concentration cible, diminuer le débit à 15 CFH et permettre à la concentration de diminuer à la cible.
- Cesser flux d'azote immédiatement une fois que la concentration cible est atteinte.
- Utilisez la salle d'air barboteur d'aquarium pour retourner la concentration à la concentration cible si la DO diminue en dessous de la cible.
- Si la DO est instable au cours de l'essai d'un set-up, puis vérifier le volume d'eau est encore à 1,9 L et pas d'eau a barboter dehors, la température de l'eau est stable et ne change pas, et les joints sur tous les raccords semblent être serré et étanche.
- Une fois que trois essais ont été effectués et l'expérimentateur a confiance dans la capacité de contrôler DO, fixer la ligne de gaz dans le barboteur et la bulle à l'équilibre à nouveau.
- Bulles à l'équilibre en fixant la ligne de gaz de 3 mm de diamètre dans le barboteur d'aquarium et début de l'addition de l'air ambiant à l'eau jusqu'à ce que la concentration enl'oxygène dans l'eau n'a pas d'augmenter ou de changer pendant 3 min.
- Une fois à l'équilibre, arrêtez bouillonnant et desceller le ballon.
4. Stonefly Push-up Experiment
- Diviser le nombre total de plécoptères par le nombre d'observateurs pour déterminer le nombre d'essais à effectuer.
- Déterminer les différents niveaux d'OD entre 2 et 10 mg / L pour évaluer la réponse comportementale de plécoptères (nombre de tractions).
- Mettre en place un flacon par essai et ajouter un nombre égal de plécoptères comme il y a des observateurs du flacon (4 plécoptères dans cette conception), placer la sonde et le tuyau de retour dans le ballon, puis refermer le flacon avec le bouchon en caoutchouc.
Note: Une première DO concentration de 10 mg / L a été choisi comme premier point d'observation, car il était la concentration DO du courant à partir duquel les plécoptères ont été échantillonnés. - Une fois que l'eau est à 10 mg / L par barbotage suivant les étapes 2.10-2.11, enregistrer la température de l'eau de départ et permettre à laplécoptères à joindre au substrat rocheux dans le ballon.
- Attribuer un seul observateur à regarder un seul stonefly pour assurer un comptage précis du comportement de push-up, qui est le mouvement du corps vers le haut et vers le bas présenté par le stonefly.
- Compter et noter le nombre de push-ups observés au cours d'une période d'observation de 3 min.
- Manipuler DO au niveau suivant DO expérimental et répéter période d'observation de 3 min pour les niveaux expérimentaux supplémentaires.
Remarque: Dans ce modèle expérimental, trois niveaux d'OD différents ont été évalués.
5. Analyse statistique
- Pour effectuer statistique nombre moyen d'utilisation de l'analyse des push-ups dans les quatre plécoptères dans un groupe pour un essai DO donné.
- Utilisez le logiciel de calcul libre R statistique 12 pour effectuer une analyse de variance (ANOVA) sur le nombre de push-ups et les concentrations d' OD en utilisant l'ordre de chaque essai expérimental (DO niveau) et la température covariates. Analysé DO que les niveaux discrets d'un seul facteur.
- Utilisez un test de normalité Anderson-Darling sur les résidus pour vérifier la normalité 13.
- Effectuer une régression linéaire sur les données en traçant le nombre moyen de push-ups contre des concentrations DO.
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Representative Results
Six essais de la configuration décrite ont été réalisées par 24 étudiants de première année étudiants de premier cycle dans un environnement de laboratoire d'enseignement pour quantifier le nombre de push-ups plécoptères effectuer en réponse à la concentration DO différente dans l'eau. Le nombre moyen de push-ups effectuées au sein d' un niveau DO et dans chaque essai a été mis en commun pour tracer push-ups contre le niveau DO dans la figure 2. Une ANOVA a été réalisée d' abord en utilisant la concentration DO, l' ordre séquentiel des essais, la température, ainsi que les interactions entre les variables. Les résultats suggèrent que seulement DO concentration influencé de façon significative le nombre de push-ups effectuées par plécoptères (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) et aucune autre interaction variable ou était un facteur prédictif significatif de tractions. Toutes les données utilisées dans cette analyse a été confirmée pour la normalité en utilisant un test d'Anderson-Darling.
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Figure 2. Nombre moyen de push-ups effectuées par plécoptères groupées par essai fonction de la concentration en oxygène dissous. Cela montre une relation négative significative (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) entre les pompes et la concentration en oxygène dissous (pente de -6,063). Les chiffres rouges indiquent la température de l'eau (en ° C) pour un essai. Les températures sont stables sur 3 périodes min d'essai, mais varié à travers l'expérience. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Fichier de code supplémentaire. Code R pour les analyses statistiques S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger cettefichier.
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Discussion
Les étapes critiques
Cette procédure constitue un moyen simple et efficace pour manipuler DO dans un environnement de laboratoire pour effectuer des études comportementales sur les organismes aquatiques. Nous avons trouvé qu'il y ait plusieurs critiques étapes / articles à connaître lors de l'exécution de cette expérience qui directement liée aux résultats. À l'intérieur d'un essai, il est essentiel de maintenir la pression dans la chambre pour éviter les variations de la pression partielle des gaz au-dessus de l'eau, et à la suite des fluctuations DO. En suivant les étapes décrites dans le «test de la stabilité de l'installation expérimentale" paragraphe du protocole est critique. Inspecter le joint d'étanchéité du bouchon avec le flacon, assurant une immersion complète du tube à vide dans le ballon de 1 L d'eau (pour empêcher le reflux de l'air ambiant), et d'un coin de la conduite de gaz et DO joint de fil avec le bouchon peut aider à maintenir une écurie environnement de la chambre. En outre, en maximisant le volume d'eau dans la chambre est nécessaire pour améliorer la stabilité de DO au seinun procès que nous avons constaté que trop peu de résultats de volume erratique et instable DO manipulations.
Le maintien de la température de l'eau dans la chambre est impératif pour une bonne maîtrise des niveaux DO internes. Alors que nous étions en mesure de maintenir des températures d'eau froide à l' intérieur des expériences individuelles du groupe, une certaine variation minimale de la température dans les différents essais était évident (figure 2). Depuis notre gamme globale de températures était faible (11.8-13.5˚C) et dans la gamme typique pour plécoptères, il n'a pas prouvé être un prédicteur important dans notre modèle de tractions de stonefly. Cependant, la température de l' eau est connu pour réaliser le potentiel de saturation en oxygène de l' eau 14,15, et à défaut de maintenir la température de l' eau de la chambre aurait des impacts directs sur les niveaux DO. Avec une bonne étanchéité, un volume adéquat d'eau, et la température de l'eau stable, la pression de la chambre interne et DO est facilement maintenu pendant toute l'expérience et le contrôle de DO entre les essais est stable et reproductible.
Limitations et modifications
Deux limitations potentielles de cette expérience sont la taille de la chambre et la longueur de la période d'observation. Le volume d'eau (~ 2 L) et une petite ouverture dans le col de la chambre limite la taille de l'organisme susceptible d'être utilisé. A cette échelle, le protocole permettrait la substitution facile de plécoptères pour d' autres macroinvertébrés, les amphibiens et les poissons plus petits, mais ne serait pas applicable pour les grands organismes (poissons prédateurs, poulpes). Toutefois, il serait possible à l'échelle de cette expérience par l'utilisation plus grande verrerie, et d'adapter le protocole global pour atteindre les objectifs d'apprentissage / de recherche différents avec les plus grands organismes. En outre, tout substrat nécessaire dans la chambre pour les plus grands organismes devraient être pris en compte lors du choix de la verrerie en raison de la petite taille du cou sur le flacon de 2 litres. Dans notre expérience petite rivière pierres ont été recueillies avec plécoptères et fourni amplement chambre s ubstrate pour les plécoptères pour effectuer des tractions.
conditions de la chambre interne à l'égard des périodes d'observation de courte durée ont été maintenus avec des fluctuations minimales, cependant, les incertitudes demeurent sur les périodes d'observation plus longues. Utilisant la période d'observation de 3 min décrite dans le protocole, la température de l'eau de la chambre et DO niveaux ont été maintenus à des valeurs constantes. Nous avons été en mesure de maintenir DO et de la température de l'eau jusqu'à une période d'observation de 5 min, mais à une longue période d'observation de 10 min, les températures de l'eau dans la chambre a commencé à augmenter. Dans le protocole actuel, il est impossible de prolonger la période d'observation au-delà de 5 min. Cependant, les adaptations apportées au protocole courant (par exemple en utilisant une température ambiante contrôlée) pourrait permettre une plus grande stabilité à long terme de la température de l'eau. En outre, une analyse plus robuste et détaillée des temps d'observation par rapport à des conditions d'eau ambiantes (température de pression, DO, partielle) aiderait à déterminer les facteurs limitatifs.
content "> Ce protocole a la capacité à modifier (comme mentionné ci-dessus) pour répondre à un certain nombre de différents besoins et objectifs. Une modification supplémentaire au protocole existant serait une modification du système de barbotage. Alors que nous avons utilisé uniquement un petit tuyau de cuivre à bouillonner l'eau, nous avons remarqué que l'addition des grosses bulles de gaz d'azote souvent délogé les plécoptères de leur emprise sur les pierres de rivière et les a envoyés flottant autour de la chambre. Nous avons essayé d'utiliser une pierre bouillonnant pour plus encore la dispersion d'azote gazeux , mais a constaté que l'eau de la chambre n'a pas été agité suffisamment pour disperser uniformément le gaz d'azote, résultant dans une colonne de conditions hypoxiques dans la chambre. le perfectionnement du système de distribution de gaz d'azote peut fournir des renseignements utiles, et enlever le confondre potentiel des délogeant plécoptères du substrat entre les essais DO. Importance et applications futures
Cette expérience a été le premier de son genre dansClude un développement de protocole détaillé pour manipuler les niveaux DO pour l'observation du comportement animal dans un environnement de laboratoire. Alors que d' autres travaux publiés a suggéré l'utilisation de l' azote gazeux pour manipuler les niveaux DO 7,8,16, détails insuffisants méthodologique est donnée pour permettre la réplication. L'intérêt pour le développement de ce protocole découle de notre désir de manipuler les niveaux DO et d'observer le comportement des animaux pour une utilisation dans un laboratoire de niveau collégial écologie introduction au Juniata College. Dans la classe de 24 étudiants, ce protocole prouvé reproductibles dans des essais avec différents niveaux d'OD et à travers des groupes d'étudiants. En outre, ce protocole offre un moyen très accessible et rentable pour manipuler les niveaux DO pour l'expérimentation en laboratoire.
Bien que ce protocole a été développé spécifiquement pour une utilisation avec les perles dans un laboratoire d'enseignement, il pourrait facilement être adapté à d'autres objectifs. Plus précisément, ce protocole pourrait facilement être utilisé avec d'autres petits organismes aquatiquesmacroinvertébrés, les poissons et les amphibiens, même selon les espèces d'intérêt. Par exemple , les membres de l'ordre Amphipodia qui augmentent leur activité locomotrice en réponse à l' hypoxie 17 pourrait être utilisé, ou le poisson rouge (Carassius auratus) qui présentent un comportement "engloutissement" à la surface de l' eau dans des conditions hypoxiques 16. En outre, diverses étapes de la vie des organismes aquatiques pourraient également être utilisés avec ce protocole pour aider à approfondir notre compréhension des besoins en oxygène organismales tout au long du développement. Ce protocole pourrait également être utilisé pour étudier les réponses biochimiques à l' hypoxie en expérimentant avec des amphibiens comme nectures (Necturus maculosus) 18. En outre, ce protocole peut être agrandie ou réduite en taille pour répondre aux besoins des organismes plus ou moins et des applications d'enseignement ou de recherche. Alors que nous pensons que le protocole et l'application spécifique lui-même est d'un grand intérêt écologique, la plus grande force de ce protocol est qu'il fournit un grand développement de la fondation à travers les groupes taxonomiques et objectifs expérimentaux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
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