Method Article

Micropatterning и сборка 3D микрососудов

DOI:

10.3791/54457

⸱

September 9th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись представляет собой метод литья под давлением для инженера-микрососудов, что перепросматривать физиологические свойства эндотелия. Процесс Микрожидкостных на основе создает патент 3D сети сосудов с адаптивности условиями, такими, как поток, клеточный состав, геометрии и биохимических градиентов. Процесс изготовления и примеры возможных применений описаны.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В пробирке платформ для изучения эндотелиальные клетки и сосудистой биологии в основном ограничиваются 2D - эндотелиальной клеточной культуре, проточных камер с полимером или на основе стеклянных подложек, а также анализов образования трубки гидрогеля на основе. Эти анализы, в то время как информативным, не резюмировать люменов геометрию, правильное внеклеточный матрикс и многоклеточные близость, которые играют ключевую роль в модуляции сосудистой функции. Эта рукопись описывает метод литья под давлением для создания Engineered сосуды диаметром порядка 100 мкм. Микрососуды изготовлены затравкой эндотелиальные клетки в микрожидкостных канал встроенного в родной типа I коллагена гидрогель. Объединив паренхиматозные клетки в коллагеновой матрице предварительного направлять образование, специфические микросреды ткани могут быть смоделированы и изучены. Дополнительные модуляциями гидродинамических свойств и состава средств массовой информации позволяют управлять сложной сосудистой функции в пределах желаемого микросреды.Данная платформа позволяет для изучения набора периваскулярного клеток, крови-эндотелий взаимодействий, ответ потока и тканевой микрососудистой взаимодействий. Engineered микрососудов дают возможность изолировать влияние от отдельных компонентов сосудистой ниши и точно контролировать свои химические, механические и биологические свойства для изучения сосудистой биологии как в здоровье и болезни.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микрососудов в каждом органе помогает определить микросреду ткани, поддержания гомеостаза тканей и регулируют воспаление, проницаемость, тромбоз и фибринолиза 1,2. Микрососудистой эндотелий, в частности, является интерфейсом между кровотоком и окружающей ткани и , следовательно , играет критическую роль в модуляции сосудистой и функции органов в ответ на стимулы , такие как гидродинамические силы и циркулирующих цитокинов и гормонов 3 - 5. Понимание подробные взаимодействия между эндотелий, кровь, и окружающая микросреда ткани имеет важное значение для изучения сосудистой биологии и прогрессирования заболевания. Однако прог....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. микротехнологий узорчатых полидиметилсилоксана (PDMS) с Network Design

  1. Вафли Fabrication создать негативный шаблон сетевого дизайна
    1. Создание шаблона сети с помощью любого программного обеспечения проектирования систем автоматизированного (САПР). Убедитесь, что размер по диагонали между входом и выходом соответствует расстояние между входным и выходным резервуаров на кожухе устройства в будущих шагов (см 2.1.1).
      Примечание: Конструкция шаблона сам заказ в зависимости от конкретных исследовательских задач пользователя (см Рисунок 1 Примеры шаблонов).
    2. Создайте маску шаблона сети, используя высокое р....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инженерных платформа судно создает функциональный микроциркуляторного русла , внедренного в естественной коллагена типа I матрица и допускает жесткий контроль клеточного, биофизических и биохимических среды в пробирке. Для изготовления спроектированных микрососудов, Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) перфузируют через коллагеном встроенный микрожидком сети, где они придают сформировать патентные люмена и сливающийся эндотелий. Как показано на фиг.1А-C,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Engineered микрососудов являются моделью в пробирке , где физиологические характеристики , такие как геометрия просвету, гидродинамические силы и многоклеточных взаимодействий присутствуют и перестраиваемой. Этот тип платформы является мощным в том , что она дает возможность моделировать и изучать эндотелиальной поведение в различных контекстах , где в пробирке условия культивирования могут быть сопоставлены , что микроокружения в вопросе. Например, механизмы , движущие эндотелиальные процессы, такие к.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы отметить Линн и Майк Гарви визуализации лаборатории в Институте стволовых клеток и регенеративной медицины, а также Вашингтон Nanofabrication фонда в Университете штата Вашингтон. Они также признают финансовую поддержку Национального института здравоохранения предоставляет DP2DK102258 (к YZ), а также обучение предоставляет T32EB001650 (к ССК и САХ) и T32HL007312 (к САХ).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma SystemAutoGlow
Headway Spin CoaterHeadway Research, Inc Машина для нанесения покрытий PWM32 
ABM Контактный выравнивательAB-M
Alpha Step ProfilometerTencorAlpha Step 200
SU-8 ПроявительMicrochemY020100
SU-8 ResistMicrochemSU-8 2000
8" кремниевая пластинаWafer World Inc.
Настольный микрогенератор шаблоновHeidelberg Instrumentsμ PG 101Для создания фотошаблона
Нагревательная пластинаVWR97042-646
Спирт изпропиловыйAvantor Эксплуатационные материалы9088
Чашки Петри (120 x 120 мм, квадрат)Сигма-ОлдричZ617679
Трихлор(3,3,3-трифторпропил)силанСигма-ОлдричMKBG3805V
Полидиметилсилоксан (PDMS) эластомерная основа и отвердительDow CorningSylgard 184Смешанный в соотношении 10:1 (с / весом)
Вакуумный эксикаторSigma-AldrichZ119024-1EA
OvenVWR9120976
Device Fabrication and Culture
poly(метилметакрилат) (ПММА)Plexiglas
Corona TreaterЭлектро-Техник Продактс, Инк.BD-20Ручной прибор для плазменной обработки аппаратов ПММА и пресс-форм PDMS
ПаяльникWeller WTCPS
Ферменная головка из нержавеющей стали Шуруп со шлицемMcMaster-Carr 91785A096
Установочные штифты из нержавеющей сталиMcMaster-Carr 93600A060
Пинцет Miltex24-572Можно использовать любой подобный пинцет
Шпатель (микроложка)Услуги электронной микроскопии62410-01
ОтверткаМожно использовать любую плоскую отвертку, автоклавную
Стеклянные покровные стекла (22 x 22 мм)Fisher Scientific12-542B
ОтбеливательClorox4460030966
чашки Петри (150 x 25 мм)Corning430599
чашки Петри (100 x 20 мм)Corning2909
Хлопок, разрезанный на кусочки 1 см х 3 смАвтоклавированный
полиэтиленимин (PEI)Sigma-AldrichP3143Развести до 1% в воде для клеточной культуры
ГлутаральдегидSigma-AldrichG6257Развести до 0,1% в воде
для клеточной культурыСтерильный H2OAutoclaved DI H2O
Тип I коллаген, растворенный в 0,1% уксусной кислотеВыделен из хвостов крыс, как описано в Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 мл шприцBD309659
10 мл шприцBD309604
15 мл конические трубкиCorning352097
30 мл конические тубыCorning352098
M199 10x Media Life Technologies11825-015
1 Н NaOH (стерильный)Sigma-Aldrich415413Разбавить до 1 Н в воде для клеточных культур
HUVECsLonza Эндотелиальные
CC-3124
TrypsinCorning25-052-CI
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermofisher Scientific10082147
Декстран из Leuconostoc spp. (70  kDa)Sigma-Aldrich31390
фосфатно-солевой буфер (PBS)Гемоцитометр Corning21-031-CV
Hausser Scientific Co.3200
Гелевые насадкиVWR37001-152
18 G Игла для тупого заполненияBD 305180
20 г Игла дозирующая из нержавеющей сталиMcMaster-Carr75165A123
Tygon 1/32" ID, 3/32" OD Силиконовая трубкаCole-ParmerEW-95702-00
1/16" Труба-трубка муфтаMcMaster-Carr5116K165
90° Коннекторы локтя, трубка-трубкаMcMaster-Carr5121K901
Муфта с замком Люэра (женская, 1/16" ID)McMaster-Carr51525K211
Пластиковые щипцы, с захватами для челюстейУслуги электронной микроскопии72971
Двойной шприцевой насосГарвардский аппарат70-4505
5 мл Полистироловая трубка с круглым дномFisher Scientific14-959-2A
<Стронг>Прибор Анализ
формальдегидSigma-AldrichF8775
Бычья сыворотка АльбуминSigma-AldrichA8806-5G Triton
X-100Sigma-AldrichT-9284
Кролик анти-hCD31Abcamab324571:25 рабочее разведение
FITC конъюгированное анти-фон Виллебранд Фактор антителоAbcamab88221:100 рабочее разведение
Козий анти-кролик 568 вторичное антителоThermofisher ScientificA-110111:100 рабочее разведение
HoeschtThermofisher ScientificH1399Ресуспендировано в ДМСО
Какодилат натрия Sigma-AldrichC0250Для изготовления 0,2 М какодилатного буфера
ЭтанолVWR InternationalBDH1164-4LP
40 кДа ФИТК-сопряженный ДекстранSigma-AldrichFD40S 
<сильные>дополнительные реагенты для культур 
CHIR-99021Selleck ChemS2924Низкомолекулярный ингибитор GSK-3
Человеческий рекомбинантный VEGFPeprotech100-20
Человеческий рекомбинантный bFGFPeprotechAF-100-18B
питательные среды Lonza

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Engineered MicrovesselsMicrovessel FabricationCollagen HydrogelEndothelial Cell SeedingInjection MoldingPDMS Mold AssemblyVascular Biology ModelPerivascular Cell RecruitmentBlood Endothelium InteractionFlow Response Study

Related Articles