Summary
В этих исследованиях, мы предлагаем методологию новых, неонатальных, мышиные сердца подмостей для использования в регенеративных исследований.
Introduction
Сердечная недостаточность является общим и смертельно опасны. Это прогрессирующее заболевание, которое приводит к снижению сократительной способности сердца, что ухудшает приток крови к органам и оставляет метаболические потребности неудовлетворенных тела. По оценкам, 5,7 миллиона американцев страдают сердечной недостаточностью , и это является основной причиной госпитализации в Соединенных Штатах 9. Коллективный стоимость лечения пациентов при сердечной недостаточности в Соединенных Штатах превышает 300 миллиардов долларов в год 9-10. Только радикальная терапия для конечной стадии сердечной недостаточности ортотопическая пересадка сердца. Каждый год, по оценкам, более 100000 сердца доноров необходимы для сердечных процедур трансплантации в США 1-2. Из - за ограниченного числа доноров, лишь около 2400 трансплантаций ежегодно проводится в США 2. Очевидно, что этот дефицит орган необходимо решать, как другие стратегии необходимы для создания дополнительных органов для transplantaции и, в идеале, эти органы были бы аутологичной таким образом, чтобы избежать осложнений, связанных с отторжением и времени жизни иммуносупрессии.
Млекопитающие взрослые кардиомиоциты демонстрируют ограниченную регенеративную способность после травмы , но последние данные свидетельствуют о том , что у млекопитающих неонатальные сердца поддерживать замечательную регенеративную способность после повреждения 5-8. В частности, после частичной хирургической резекции, регенеративный окно было обнаружено между рождением и постнатальный день 7. Этот восстановительный период характеризуется отсутствием фиброзного рубца, формирование неоваскуляризации, высвобождение ангиогенных факторов из эпикарда и кардиомиоцитов пролиферации 5-8 , 11. Это регенеративная окно времени обеспечивает потенциал для использования сердца новорожденной как новый источник материала для развития биоискусственных сердца.
Внеклеточный матрикс, как известно, обеспечивают важные сигналы для содействия cardiomyocytе пролиферации и роста. Четкие различия в доступности молекул в неонатальных и взрослых матриц 12 и их способности содействовать регенерации, были исследованы 13. Decellularized взрослых матрицы были использованы в ряде исследований, чтобы обеспечить ECM эшафот для сотовых репопуляции и генерацию биоискусственных сердца. В то время как эти исследования, и новые открытия в области стволовых клеточных технологий, быстро развиваются, несколько препятствий, которые еще должны быть выполнены. Например, ограничения в сохранении нативной структуры матрицы, клеточной интеграции в матрицу стены, а также способность поддерживать пролиферацию и рост всех предела успех этого подхода. В то время как превосходные регенеративные атрибуты были приписаны сердца новорожденной, практические аспекты использования такой ткани ограничили его исследование.
На основе продемонстрированной регенеративной способности сердца новорожденной, мы разработали новые матрицы посредством разработкиТехника decellularization для сердца P3 мыши. Сердце Р3 была выбрана для этих исследований , как он находится в пределах окна регенерации сердца , как ранее определено 6 , а сердце является достаточно большим , чтобы урожай, decellularize и recellularize. Целью данного исследования является демонстрация возможности создания матрицы из сердца новорожденной мыши. Наши исследования дают доказательства осуществимости decellularizing минуту, неонатальный сердце при сохранении структурной и белковую целостность ECM. Мы также продемонстрировать способность recellularize этот сердечный ECM с mCherry, выражающих кардиомиоцитов и мы исследовали эти кардиомиоциты для экспрессии различных кардиомаркеров следующих recellularization. Эта технология позволит для тестирования превосходства новорожденных матрицы для развития биоискусственных сердца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты мыши были выполнены в соответствии с Законом США охране животных и были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животного происхождения в Университете штата Миннесота.
1. Метод для мышей сердца изоляции
- Эвтаназии неонатальную мышь обезглавливание с одним лезвием использования.
- Тампон грудную клетку с 70% этанола.
- Рассеките кожу от груди, сокращая его подальше от стенки грудной клетки со стандартными ножницами, потянув кожи по бокам с парой # 5 щипцов.
- Проколите живот просто уступающий грудины с ножницами резанием через брюшную стенку. Схватив мечевидного отростка с # 5 щипцов, втягивания грудины ростральным от тела во время резки, хотя ребра с обеих сторон грудной клетки с ножницами. Грудная клетка отражается главно с щипцами, чтобы раскрыть сердце.
- Попросту рассекают два главных долей тимуса, потянув в боковом направлении с # 5 щипцов, обнажаядуга аорты, а также кавальной и легочных вен.
- Трансекте основные артерии от дуги аорты, а сама аорта, с пружинными ножницами 10 см. Сохраните аорту между основанием сердца и брахиоцефальных артерий. Возьмитесь за концы отрезанных судов с № 5 пинцет, чтобы отразить сердце вперед, отделяя его от трахеи и пищевода.
- Трансекте легочную сосудистую и другие крупные вены, путем разрезания между легкими и сердцем по обе стороны от сердца с помощью пружинных ножниц 10 см. Жилы остаются открытыми для обеспечения дренажа.
- Удалите сердце из средостения с # 5 пинцетом, захватывая отрезанные концы магистральных сосудов. Поместите сердце в чашку для культивирования 60 мм, содержащую стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) для катетеризацией.
2. Способ по Decellularization Лангендорфа перфузии
- Подготовьте узел катетера заранее. Нарисуйте раздел 4 смиз ПЭ 50 труб в небольшом пламени спирта, чтобы создать меньше, тоньше катетер. Обрежьте концы с лезвием , чтобы иметь размеры (прибл. 300 мкм внешний диаметр OD с фланцем прибл. OD 500 мкм) , показанного на фиг.1. Это обеспечит две симметричные катетеров с каждой стороны тяги.
- Точка обрезанный конец трубки в пламя на короткое время, чтобы расплавить фланец на отверстие в тонком конце.
- Наполните 12 мл шприц с PBS и собирают катетер путем размещения 3-ходовой кран на шприц. Добавьте 22 г х 1 иглу к запорным краном и водить иглу через перегородку. Вставьте нарисованный PE трубки катетера на иглу (рис. 1).
- Промывать собранные детали с PBS, гарантируя, что все пузырьки воздуха были удалены.
- Вставьте катетер, полученный, как описано выше, в аорту изолированного сердца, не распространяющие мимо аортального клапана и лигируют с одним галстуком 7-0 швом. Отдыхайте фланец тон катетера проксимально против галстука, что делает герметичное уплотнение и предотвращая сердце от отрываясь катетера.
- Обратите внимание на катетеризацию при увеличении, в то время как мягко перфузии сердца, используя шприц, содержащий PBS. Убедитесь в том, что нет никаких утечек в системе и ткань однородно бледнеет, как скрытую кровь удаляется.
- Поместите перегородку в горловину переходника впускного и запечатать его путем складывания сторон над стеклом.
- Приложить резервуар , заполненный 60 мл 1% додецилсульфата натрия (SDS) в дистиллированной воде (дН 2 O) через линию достаточной длины для получения колонки , который генерирует 20 мм рт.ст. , как показано на рис. 1. Вычислить давление от высоты столба жидкости на основе соотношения 1 мм ртутного столба равна 1.3595 см H 2 O.
Внимание: SDS является очень рыхлый порошок с раздражающими свойствами. Следует избегать попадания. Ручка порошка, используя соответствующую защитную одежду. - Заливать сердца с 1% SDS в течение 14 ч. Сердце будет полупрозрачные по внешнему виду без видимых оставшейся ткани.
- Промыть систему до запорного крана оставшегося раствора SDS и заменить его 10 мл дН 2 O. Заливать сердца с помощью 10 мл 1% Тритон Х-100 (разведенный в дистиллированной воде), а затем 10 мл дН 2 O, затем 60 мл PBS , содержащим 1x пенициллин стрептомицин (Pen-Strep).
- Храните сердце в PBS с 1x Pen-Strep при 4 ° С. Если предполагаемое применение пост decellularization требует перфузию затем катетер в аорту должен быть сохранен, в противном случае сократить шовного галстук и удалить катетер.
Определение 3. ДНК
- Приготовьте дайджестом decellularized ECM или контроля сердца с использованием 200 мкг / мл протеиназы К в 50 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl 2, 0,45% твин - 20 в 10 мМ Трис (рН 8,3).
- Инкубируйте ткани при температуре 55 ° С при перемешивании, пока ткань не растворится,как правило, 4-5 ч.
- Количественно оценить содержание ДНК в гомогенате с ДНК , анализа связывания 4,11.
4. Закрепление и секционирования ткани
- Fix decellularized, recellularized или контроль P3 сердца в 4% параформальдегид в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Мытье ткани в PBS в 3 раза.
- Поместите ткань в растворе 7,5% сахарозы в 0,1 М фосфатном буфере при температуре 4 ° С, пока он не тонет.
- Изменение раствора до 15% сахарозы в 0,1 М фосфатном буфере при температуре 4 ° С, снова, пока она не тонет.
- Нагреть ткани до 37 ° С, заменить половину объема желатином раствора в 15% -ной сахарозы и 0,1 М фосфатного буфера и уравновешиваться в течение ночи. Концентрации желатина ступенчато увеличивается до 1%, 2,5%, 5% и, наконец, 7,5% в два раза.
- Поместите образцы в cryomolds с использованием свежей 7,5% желатина. Для того, чтобы восстановить форму decellularized образцов, жидкий желатин может быть перфузию в камеры при t-он сердца отлиты. Замораживание плавающими в cryomolds на жидком азоте. Хранить при температуре -80 ° С.
- Вырезать (толщиной 10 мкм) участки с криостата. Принесите слайд близко к поверхности раздела и наблюдать секция отъехать от ножа на поверхность из-за заряда на электростатическим обработанных горками. Высушить слайды в течение ночи и хранят при -80 ° С для последующего анализа.
- Удалить слайды из морозильной камеры, уравновешиваться до комнатной температуры, а затем поместить в банку, содержащую Коплин PBS в течение 20 мин при 37 ° С, чтобы растворить желатин.
- Пятно секции, вырезанные из шага 4.7 с гематоксилином и эозином. Место слайдов в банке Коплин. Expose слайды гидратированных на шаге 4.8 гематоксилин в течение 45 сек, водопроводной воды в течение 1,5 мин, буфер в течение 3 мин, водопроводной воды в течение 1 мин, подсинивания агента в течение 1,5 мин, 80% этанола в течение 1 мин, алкогольная эозин Y в течение 8 сек, 80% этанола в течение 1 мин, 100% этанолом в течение 1 мин 2x, осветлитель (ксилол заменяющего) в течение 1 мин 3 раза, покровное смолойна основе монтажа среднего. Осмотрите слайды микроскопически.
- Для того, чтобы подтвердить сохранение ECM белка реактивности сердца ECM, морилку для ECM структурных белков, таких как коллаген IV, помещая гидратированных слайды в увлажненной камере и обрабатывают 10% нормальной ослиной сыворотки (NDS) в фосфатном буферном солевом растворе с 0,1% тритона -X100 (PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре (RT). Используйте достаточный объем, чтобы покрыть срезы ткани.
- Заменить раствор с первичным антителом выбора при эмпирически установленного разбавления в 5% НСР / PBST. Например, антитело Коллаген IV разводили в соотношении 1: 150. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Промыть слайды с PBST 3x и применяют вторичное антитело выбора, конъюгированных с флуоресцентным красителем. Развести антитела эмпирически установленного количества. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Мытье с PBS 3 раза.
- Пятно слайды с переплетом красителя ДНК, таких как DAPI проверить отсутствие клеточных ядер с помощью DAPI, содержащего mountiнг среды, когда крышка скольжения слайдов.
- Проверьте слайды с флуоресцентным микроскопом при температуре от 50 до 400X.
5. P1 неонатальной Мышиные желудочков кардиомиоциты для Recellularization
- Спрей каждого детеныша с 70% этанолом и обезглавить с одним лезвием использования.
- Удерживайте каждую детеныша между большим и указательным пальцами в то время как грудная клетка делится на средней линии с маленькими стерильными ножницами, чтобы разоблачить грудной полости. Надавите, чтобы позволить сердце свободно выступать из груди, когда она отрезается магистральных сосудов и предсердия оставив только желудочков ткани.
- Поместите каждое сердце непосредственно в 50 мл пробирку, содержащую 20 мл ледяной кальция, забуференный солевой раствор раствором гидрокарбоната свободного Хэнка с 20 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (CBFHH), пока все сердца не будут собраны.
- Аспирируйте CBFHH и добавьте 10-15 мл свежего CBFHH (ледяная) к трубке. Вымойте ткани путем закрученного ткани в тон несколько раз трубку.
- Декантируют раствор, содержащий сердца в 60 мм пластиковой чашке Петри.
- Проанализируйте любую скрытую предсердной ткани из сердца при увеличении на льду, урезая его подальше от сердца с пружинными ножницами. Фарш до желудочки в текущем гомогенного размера мелкие кусочки. Удалите отделенный без желудочковой ткани из тарелки с # 5 щипцов.
- Пипеткой столько раствора CBFHH как требуется для передачи фрагментов тканей в небольшую стерильную пробирку, которая содержит стерильную микро мешалку.
- Дайте ткани осесть на дно флакона и удаления раствора CBFHH.
- Составляют 50 мл ферментного раствора 1,75 мг / мл трипсина, 20 мкг / мл ДНКазы II в CBFHH. Пипеткой 5 мл этого раствора фермента и добавить его в пробирку, содержащую измельченный желудочковой ткани и место на магнитной мешалкой. Перемешивают при постоянной скорости (340 оборотов в минуту) при комнатной температуре в течение 8 мин.
Примечание: Действие перемешивание должно быть нежным и вместе с тем позволяютдля суспензии шлама. - Извлеките пробирку из мешалке и позволяют Шлам осаждаться в течение 3 мин. Пипеткой и отбросить первоначальный переваривать супернатанта, так как она в основном содержит клетки крови и тканей мусора.
- Пипетируйте второй 5 мл аликвоту раствора фермента и добавить его к переваривания желудочка. Смесь перемешивают в течение 8 мин и дайте ему осесть в течение еще 3 мин. До начала дайджестов, приготовить две 50 мл пробирки (помеченный 1 и 2) каждый из которых содержит 12 мл охлажденного на льду фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Поместите сетчатый фильтр ячейки 40 мкм поверх каждой трубки. Пипеткой этот супернатант через фильтр на трубе 1.
- Повторите процесс пищеварения еще 8 раз, чередуя размещение супернатанта дайджеста между двумя трубками, содержащими FBS. Разделить последнюю супернатант поровну между трубами 1 и 2, чтобы обеспечить равные объемы в каждой пробирке.
Примечание: Каждая коллекция трубка теперь будет содержать 32,5 мл общий объем клеточной суспензии. - Центрифуга трубки содержатИнг Поверхностный слой 150 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С.
- В то время как сбор переваривании аликвот, подготовить пять 100 мм тканевых культуральных планшетах с 6 мл среды (Дульбекко Modified Eagle с носителями (DMEM) с добавлением 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-глутамина) на одну пластину. Выдержите эти аликвоты при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 30 мин для уравновешивания носителя.
- Аспирируйте ферментную смесь CBFHH и ресуспендирования клеток в 30 мл культуральной среды, полученного выше, комбинируя клетки из обоих приборке.
- Возврат 6 мл суспензии клеток в каждой из пластин 100 мм и инкубировали в течение 45 мин при 37 ° С.
- В конце инкубации, передавать, не прилипшие клетки до 5 новых блюд и повторно инкубировать в течение 45 мин (фракция фибробласты будет начинают прилипать к посуде и можно выращивать отдельно, при желании).
- В конце второго раунда предварительного покрытия, собирать средства массовой информации и не-адгезивные клетки из блюд и спина СМИ при 150XG в течение 6 мин.
- Откачать лишние носители , чтобы привести клетки к приближенному желаемой концентрации (4,0 × 10 5 клеток на конструкцию в 100 мкл перфузату). Удалить аликвоту для подсчета и жизнеспособности или тестирования 14.
6. Биореактор Recellularization Р3 сердца Матрица
- Обрабатывайте обособленное матрицу сердца с культуральной среды (этап 5.15) в течение ночи перед добавлением клеток.
- Соберите элементы системы Лангендорфа , как показано на рис. 2. Автоклав стеклянные части и окись этилена стерилизовать пластмассовые части для обеспечения стерильности. Различные субъединиц системы могут быть собраны в колпаке с ламинарным потоком перед тем, установленный на подставке. Циркулирующая вода ванны и путь потока воды с подогревом опущено для ясности.
- Заполните Собранная система с 120 мл среды культуры ткани (шаг 5,15).
- Поместите катетеризированы матрицу сердца с шага 2.14 в 60 мм кульратура блюдо под микроскопом и было подключить 1 мл шприц с 22 G х 1 иглы загружается с клеточной суспензии со стадии 5,20 к катетеру. Убедитесь в том, что эта сборка является свободным от пузырьков воздуха, чтобы избежать эмболизации сердце.
- Осторожно заливать 100 мкл суспензии клеток в матрицу сердца через коронарные артерии. После завершения, отсоединить комбинацию шприца / иглы.
Примечание: Медленное перфузия ок. 20 мкл в минуту требуется для предотвращения клетки от вытекающей из вены, пересекал сердце. - С 22g тупой заглушке, прикрепленного к штуцером Люэра на нижней части банки крышки биореактор сердца, вставьте катетер на заглушке.
- Запустите перистальтический насос и наблюдать , что доходы потока , как показано на рисунке 2. Поток переходит из резервуара с помощью насоса через пузырь ловушку в катетер в аорту на шаге 2.5 (красной дорожке на рис. 2). Обратите внимание на поток сердечного кровообращения из веныs и капать с вершины, рециркулирующей в средствах массовой информации резервуара.
Примечание: скорость перфузии потока зависит от индивидуальных факторов, таких как сосудистый сопротивление конструкции, а также от размера сердца, но со скоростью от 50 до 100 мкл / мин является хорошей отправной точкой. В промежуточных точках времени, функциональные оценки могут быть выполнены. Шкала размер неонатальном recellularized сердца ограничивает оценок, которые могут быть выполнены , но мы установили , что системы оптически основанные могут быть использованы для количественного определения избивая поведение так же , как они были использованы в взрослых сердцах крыс. 4 Конструкция может быть перфузию при продолжительном периоды времени (до 23 часов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularization
В среднем, время decellularization из Р3 сердца, используя этот протокол составляет около 14 ч. учитывая средний вес сердца 23 мг для P3 новорожденному.
Acellularity
3 , а демонстрирует полностью неповрежденным P3 сердца новорожденной (вся гора). Рисунок 3b показывает то же самое сердце следующее decellularization. На рисунках 4а и 4б показывают гематоксилином и эозином интактных и decellularized сердца, соответственно. Обратите внимание на отсутствие гематоксилиновых положительных ядер и уменьшение эозинофильных структур в decellularized сердце. Кроме того, содержание ДНК в decellularized сердца значительно снижается от 68,08 ± 2,25 мкг в интактном сердце (п = 6) до 4,73 ± 2,27 мкг в decellularized сердца (N = 5).
Коллаген иммунореактивности
Поддержание внеклеточного матрикса (ЕСМ) после decellularization имеет важное значение для репопуляция с экзогенными клетками и к функциональности матрицы. Для того, чтобы оценить содержание неонатальном ECM в интактной и decellularized ECM, проводили иммуно-окрашивание на коллаген IV. Фиг.4С и d показывают , что коллаген IV является робастно выражается как в интактном и decellularized сердца и что локализация этого белка поддерживается после удаления клеток, в то время как DAPI положительных ядер эффективно удаляются (рис 4д-Н).
Содержание ДНК
Присутствие ДНК используется в качестве дополнительного указания клеточности. На рисунке 5, ДНК показано , уменьшается на 93% в неонатальном сердцах следующих decellularization на основе моющего средства. Эта степень восстановления ДНК согласуется сВ литературе с использованием моющего средства на основе decellularization в других тканях 15-16.
Recellularization
Мы выполнили иммуногистохимии для определения экспрессии различных кардиомиоцитов маркеров в recellularized сердце. Рисунок 6 иллюстрирует клетки , которые мигрировали в стенке левого желудочка (рис 6A и 6B). 6С демонстрирующая DAPI мечение recellularized сердца. Рисунок 6D-G иллюстрирует клетки , которые являются положительными для Nkx 2,5, mCherry, α-актинин и DAPI, соответственно. Nkx2.5 известно маркировать сердечных клеток-предшественников, в то время как α-актинин является саркомера белок, который отмечает дифференцированные кардиомиоциты. Мы наблюдали большинство клеток , которые экспрессируют все эти маркеры (розовый, рисунок 6H), указывая , что эти клетки продолжают экспрессировать маркеры кардиомиоцитов эван после 23 дней перфузией.
Рисунок 1. Схема decellularization аппаратного обеспечения. A. 60 мл резервуар цилиндр шприца для моющего раствора. B. Катетер сборка с поливной шприца как подробно. C. Фрагмент нарисованного наконечника ПЭ трубки катетера. D. Decellularization камера и перегородку с дренажем. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Схематическое изображение сердца биореактора. 1. Увлажнение карбогена газа (Зеленые линии представляют собой поток газа). 2. Перистальтические привода насоса для средств массовой информации и перфузиейоксигенации (Фиолетовые линии представляют собой поток средств массовой информации через оксигенатор). 3. Тонкие стенки Оксигенатор. 4. Лист Оксигенатор и медиа резервуар. 5. Преднатяг камера и пузырь ловушку. 6. Камера сердца (красные линии представляют собой поток средств массовой информации к и от сердца). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Весь бугор P3 сердца новорожденной мыши до (а) и после того, как decellularization (B). Это сердце decellularized с использованием метода перфузионной Лангендорфа , как описано в способе 2. Обратите внимание , что сердце становится прозрачным и слегка увеличенным объемом следующей перфузионного (B) , Масштаб = 2 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Гистология родной и decellularized P3 сердца новорожденной мыши. Криостат секция (10 мкм) окрашивали H & E (A, B), Коллаген IV (C, D, G, H) и DAPI (E, F, G, H ). Слитые изображения представлены в G и H. Окрашивание Н & Е показывает отсутствие клеточных ядер и цитоплазмы в decellularized ткани (В) по сравнению с нативным сердца (A). Хотя содержание коллагена IV остается следующий decellularization (D), DAPI окрашивания (маркер ядер) отменяется. Присоединяемых изображения демонстрируют колокализации коллагеном IV и DAPI в наивной сердце (G) и отсутствие этого колокализации в decellularized сердце (H). Эти данные указывают на то, что клетки не больше заполнения коллагеновой матрицы сердца. Масштаб = 500 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Оценка содержания ДНК. Контроль (n = 6) и decellularized (п = 5) сердца анализировали на содержание ДНК путем пико-зеленого методом. Количественное выраженное в мкг ДНК на сердце ± стандартное отклонение. Звездочка указывает, р <0,01 по сравнению с контролем. Эти данные указывают на то, что decellularization снижает содержание ДНК значительно в неонатальном центре P3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
OAD / 54459 / 54459fig6.jpg "/>
Рисунок 6. Гистология P3 сердца матрицы 23 дней после recellularization с P1 mCherry , выражающих кардиомиоцитов. Окрашивали H & E (A, масштаб = 250 мкм, B, масштаб = 50 мкм), DAPI (C, шкала = 250 мкм), Nkx 2.5, mCherry, α-актинины, DAPI, и объединены (D, Е, F, G, Н, шкала = 50 мкм). Мы показали эффективное заселение коллагеновой матрицы с P1 кардиомиоцитов (AC). Кроме того, мы заметили, что м-черри положительные кардиомиоциты выражают Nkx2.5 и альфа-актинин 23 дней после введения в коллагеновой матрице. Эти данные указывают на то, что эти клетки сохраняют свою идентичность кардиомиоцитов в течение длительных периодов времени. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого Figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Зависимость этой методики при повторных перфузии сердца делает предотвращение эмболии одним из важнейших компонентов успешного результата. Из начального катетеризацию сердца на этапах 2,2-2,6, к изменениям раствора между стадиями 2.8-2.14, есть манипуляции, которые могут позволить введение воздушных пузырьков, компромиссом поток перфузату в миокарде. Из-за миниатюрного размера сердца новорожденной малейшим пузырьки в сосудистую сеть может привести к технической миокарда, тем самым оказание decellularization неполной. Кроме того, в более поздних стадий промывки, неполное перфузия может привести к моющей остатка, который отрицательно влияет на биологическую совместимость. Кроме того, быстрые изменения температуры, например, при удалении матрицы из хранения 4 ° C, как предложено в шаге 2.14, следует подходить с осторожностью, поскольку это также может быть источником образования пузырьков воздуха при растворении газа движется из раствора с изменением температуры. WКурица продвигаясь к recellularization, дополнительного ухода следует применять при подготовке шприц с клеточной суспензии, чтобы обеспечить вливание пузырь бесплатно (шаг 6.4).
Может возникнуть необходимость манипулировать специфику этого протокола для размещения других типов тканей. Есть целый ряд протоколов decellularization сообщили 4,9,11 , которые могли бы дать соответствующие указания. Конечная цель (ы) любого протокола decellularization должен включать в себя поддержание структуры ЕСМ белка и связанной с ним биохимию, а также достаточное удаление нативных клеточных компонентов на примере остаточной ДНК. В этих условиях применение избыточного давления перфузии приводит к нарушению ECM ультраструктуры, которые могут быть визуализированы гистологически.
Размер сердца Р3 мыши ставит некоторые ограничения на введении клеток по сравнению с взрослой ткани. В то время как взрослые сердца представляют собой достаточно толстый стенки желудочков, что делает трансмурального injectioна возможный доставка клетка модальность, сердце Р3 достаточно мал, что игла, размер которых не будет лизировать клеточную суспензию, делает существенный ущерб сердцу. Перфузия является жизнеспособной стратегией доставки, но зависит от клеток определенного размера и формы, которые будут доставлены эффективно. Новорожденных миоциты мышиные хорошо работают в этом направлении. Другие небольшие круглые клетки, также было показано , чтобы служить этой цели 11. Шкала размер этих сердец исключает использование обычного физиологического функционального анализа, такие как громкость давления катетеров. Другие подходы, основанные на видео захвата, возможно, придется считаться.
Эти данные подтверждают возможность decellularization и recellularization из сердца новорожденной мыши. Предыдущие исследования продемонстрировали использование взрослых сердец с целью изучения decellularization / recellularization. Матрицы , полученные из этих взрослых сердец были заселены с неонатальных кардиомиоцитов 4 и человекаиндуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) 17. В случае hiPSCs, то заселена сердца отображается уменьшение маркеров плюрипотентности, таких как NANOG, Sox2 и OCT4 и сформированных мышечных структур, подобных; все наводит на мысль о созревании. Внеклеточные репликами ECM, однако, было показано, играют важную роль в развитии клеток, тканей и органов, которые побудили нас попытаться генерировать матрицы из тканей известных укрывать регенеративную способность. В наших исследованиях мы показали, что recellularized сердца по-прежнему выражают маркеры кардиомиоцитов, даже после длительной культуры. Эти данные указывают на то, что, с использованием новых матриц, кардиомиоциты можно поддерживать в течение продолжительных периодов времени без потери своей идентичности, как кардиомиоциты. Наши данные подтверждают технику и возможности для decellularizing сердца новорожденной мыши. Неонатальном матрицы обладают потенциалом для предоставления новых конструкций для исследований Репопуляции, а также для производства гелей, которые имеют вирerior регенеративная способность. С помощью этих неонатальных ECMs, мы теперь адресация превосходство этих каркасах с образованием функциональных тканей с различными типами клеток, в том числе hiPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
