Introduction
חלבונים קושרי RNA (RBPs) מייצגים כ -10% של ס חלבוני cerevisiae 1,2 וכ -15% של חלבונים יונקים 3-5. הם מעורבים תהליכים תאיים רבים כגון mRNA שלאחר תעתיק עיבוד ורגולציה, תרגום, biogenesis הריבוזום, tRNA aminoacylation ושינוי, שיפוץ הכרומטין, ועוד. בפלח חשוב של RBPs הוא חלבונים קושרי mRNA (mRNPs) 6,7. במהלך ההבשלה mRNA, RBPs שונים לקשור את התמליל ואת לתווך עיבוד הגרעין שלה, לייצא מתוך הגרעין, לוקליזציה הסלולר, תרגום והשפלה 6-8. לפיכך, הקבוצה הנפרדת של RBPs כבול תעתיק מסוים בכל נקודת זמן קובעת העיבוד שלו, ובסופו של דבר את גורלה.
זיהוי של RBPs קשור mRNA עשוי לשפר באופן משמעותי את הבנתנו התהליכים שבבסיס תקנה שלאחר התעתיק שלהם. מגוונים גנטיים, מיקרוסקופי, שימשו שיטות ביוכימיות ביואינפורמטיקה לזהות חלבונים המעורבים בוויסות mRNA (הנסקרת ב 9-11). עם זאת, רק כמה שיטות אלה מאפשרים זיהוי של חלבונים הקשורים עם mRNA יעד מסוים. מן ראוי לציין כי הוא המערכת ההיברידית שמרים שלוש (Y3H), אשר מנצלת את ה- mRNA של עניין כפיתיון כדי להקרין ספריית ביטוי בתאי שמרים. שיבוטים חיוביים בדרך כלל הם נצפו באמצעות ביטוי בחירה או כתב צמיחת 12-14. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא מספר רב של חלבונים כי ניתן לסרוק בסביבה הסלולר והיכולת למדוד את עוצמת האינטראקציה RNA-חלבון. חסרונות כוללים מספר הגדול יחסית של תוצאות חיוביות שגויות עקב מחייב הלא ספציפי, ואת הפוטנציאל הגבוה תוצאות שליליות שגויות נובעות, בין שאר, כדי misfolding של טרף חלבון היתוך או RNA הפיתיון.
חלופה לגישה הגנטית purifi זיקהקטיון של RNA עם החלבונים הקשורים שלה. פולי A-המכיל mRNAs ניתן לבודד באמצעות השימוש בעמודים dT אוליגו, וחלבונים הקשורים בהם מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה. האינטראקציה RNA חלבון נשמרת בהקשר הסלולר שלה על ידי crosslinking, מה שהופך קשרים קוולנטיים קצר-טווח. השימוש בעמודה אוליגו dT מניב בראיה גלובלית של proteome כולו המשויך כל פולי A-המכיל mRNA 3,5,15. עם זאת, זה אינו מספק רשימה של חלבונים הקשורים עם mRNA מסוים. מעט מאוד שיטות זמינות להשיג הזדהות כזאת. שיטת הזוג כרוכה transfection של חומצות גרעין עם השלמה ליעד mRNA 16,17. חומצת גרעין גם מחוברת פפטיד, אשר מאפשר crosslinking כדי RBPs באזור קרוב לאתר אינטראקציה. לאחר crosslinking, חומצת RBP-פפטיד-גרעין ניתן לבודד נתון ניתוח פרוטאומיקה. לאחרונה, מתודולוגיה מבוססת aptamer הייתהבהצלחה להחיל שואבת מן שורות תאים יונקות 18. Aptamer RNA עם זיקה משופרת streptavidin פותח התמזג רצף של עניין (אלמנט עשיר AU (ARE) במקרה זה). Aptamer-ARE RNA צורף חרוזים streptavidin ו מעורבב עם lysate התא. חלבונים כי קשור ההשתלשלות אינה טוהרו וזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). אמנם שיטה זו זוהתה עמותות המתרחשות מחוץ הגדרות הסלולר (כלומר, במבחנה), היא עשויה להיות שונה בעתיד כדי להציג את aptamers לתוך הגנום ובכך לאפשר את הבידוד של חלבונים הקשורים mRNA בעוד המילייה הסלולר (כלומר, in vivo). בשמרים, שבו מניפולציות גנטיות מבוססות היטב, את השיטה המהירה (שפותחה במעבדתו של פרופ 'ג'ף Gerst) מספקת תצוגה של עמותות vivo ב -19. מהירה משלב הכריכה ספציפי וחזק של חלבון מעיל MS2 (MS2-CP) אל רצף הרנ"א MS2, ושל תחום מחייב streptavidin (SBP) streptavidin בשילוב חרוזים מצומדות. זה מאפשר טיהור יעילה של mRNAs מתויג MS2 באמצעות חרוזי streptavidin. יתר על כן, הביטוי של 12 עותקים של MS2 לולאות מאפשר עד שישה MS2-CPS להיקשר בו זמנית אל RNA ולהגדיל את יעילות הבידוד שלה. פרוטוקול זה ולכן הוצע לאפשר זיהוי של חלבונים הקשורים mRNA הרומן פעם דגימות eluted חשופים ניתוח proteomics ידי ספקטרומטריית מסה.
אנחנו לאחרונה מנוצלים מהירים לזהות חלבונים חדשים קשורים שמרים PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA הוצגה בעבר יקושר עם קרום ER וסביבתה 3 'המתורגמת (UTR) נמצאה להיות קובע עיקרי בשיתוף זה 21. לפיכך, RBPs אשר נקלט PMP1 3 'UTR צפוי לשחק תפקיד חשוב הלוקליזציה שלה. מהיר ובעקבותיו כרומטוגרף נוזליy-המוני ספקטרומטריית / ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) גרמה לזיהויו של חלבונים חדשים רבים כי אינטראקציה עם PMP1 20. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של המתודולוגיה המהירה, שולטים חשוב שצריכים להיעשות, וטיפים טכניים שעלולות לשפר את התשואה וספציפית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הכנס רצף המורכב 12 אתרים MS2 מחייב (MS2 לולאות; MS2L) לתוך מוקד גנומית הרצוי, בדרך כלל בין מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) ואת 3 'UTR. פרוטוקול מפורט לצורך שילוב זה מסופק במקום אחר 22. אמת בנוגע להרכבה ביטוי הולם על ידי PCR, ניתוח הצפוני או RT-PCR 20,23. חשוב לוודא כי השילוב לא התערב עם הסינתזה של 3'UTR. בנוסף, MS2-CP-לבטא פלסמיד התמזגו SBP תחת הביטוי של האמרגן מושרה (דלדול מתיונין) צריך גם להיות מוחדר לתאים 24. זן זהה, למעט לולאות MS12 הציגו, אמור לשמש כביקורת לצורך זיהוי של אותות שאינם ספציפיים.
1. טיהור מהירה
- לגדול 500 מ"ל של תאי שמרים (השתמש 250-1,000 מ"ל של תאי שמרים בהתאם לרמת הביטוי של הגן של עניין) המבטא mRNA מתויג MS2 20MS2-CP-GFP-SBP היתוך חלבון 24 עד OD 600 0.8 - 1.0 ב 30 o C במדיום הגידול המתאים (למשל, דקסטרוז סינתטי (SD) מצע סלקטיבי).
- תאים צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 4 דקות ב RT וזורקים supernatant.
- לשטוף התאים בופר פוספט 1x (PBS), צנטריפוגות כמו קודם (שלב 1.2), resuspend בנפח שווה (שלב 1.1) של SD ללא מתיונין, דגירה במשך 45 - C 60 דקות ב 30 o להשרות ביטוי של MS2 -CP-GFP-SBP חלבון היתוך.
הערה: זמן אינדוקציה ארוך עלול לגרום צבירה של GFP. - מניחים בצד 10 מ"ל של תאים ולחלץ RNA ממדגם זה על פי השיטה פשוטה "פנול חם" 25. זהירות: פנול הוא רעיל מאוד, יש לטפל בהתאם להוראות הבטיחות שלו.
הערה: RNA זוהי התייחסות טובה איכות RNA הבודד (איור 1 א). - עבור 500 מ"ל תאים, להוסיף 1.35 מ"ל 37% פורמלדהיד ג הסופיoncentration של 0.1% ל crosslink מתחמי-חלבון RNA. המשך דגירה על 30 מעלות צלסיוס למשך 10 דקות. זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל מאוד, יש לטפל בהתאם להוראות הבטיחות שלו.
- הוסף 26.5 מ"ל של 2.5 מ 'גליצין לריכוז סופי של 0.125 M דגירה במשך 3 דקות כדי לעצור crosslinking. משלב זה ואילך, לשים את הכל על קרח כדי למזער השפלה RNA.
- צנטריפוגה התאים ב 3000 XG במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלסיוס ולשטוף עם 45 מ"ל קר 1x PBS.
- תאים Resuspend ב 1 מ"ל חיץ תמוגה מהירה לכל 100 מ"ל של תרבית תאים ראשונית.
- התפצלה aliquots של 500 μl צינורות microfuge בורג הכתיר ולהוסיף ~ 400 מ"ג של חרוזי זכוכית מקורר לכל aliquot (בערך צינור PCR מלא 0.2 מ"ל).
- Lyse תאים חרוז מקצף במשך 3 דקות. מיד לשים את lysate על הקרח.
הערה: משחרר תמוגה Cell RNases הסלולר, אשר הם הגורם העיקרי לפגיעה חמורה RNA. חיץ תמוגה מהירה מכיל ריכוז גבוה של RNase inhibitors, כגון הפרין המעכב RNase הספציפי ומעכבים ספציפיים. עבודה במהירות ושמירת הכל קר מומלץ גם. - מעבירים את lysate צינורות חדשים. פירס חור קטן בתחתית כל צינור microfuge במחט חמה (0.8 מ"מ x 40 מ"מ) והמקום צינורות microfuge על גבי 15 צינורות מ"ל. השתמש ראש מזרק 5 מ"ל כמו מתאם בין צינורות microfuge ו -15 מ"ל צינורות. צנטריפוגה הרכבת הצינורות ב 3000 XG דקות 1 ב 4 מעלות צלסיוס
- העברת זרם דרך מהצינור 15 מ"ל לצינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל חדש ב XG 10,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלסיוס כדי לנקות פסולת התא.
- supernatants בריכה מכל צינורות 1.5 מ"ל לתוך צינור 15 מ"ל יחיד, ומניחים בצד 1/50 ו 1/100 נפח של lysate עבור RNA ובידוד חלבון, בהתאמה.
הערה: אלה ישמשו את הדגימות "קלט" לניתוח שלאחר מכן (איור 1). - הוספת 300 מיקרוגרם של avidin לכל 500 מ"ל של iתרבית שמרי nitial דגירה למשך 30 דקות (זה יכול להיות מופחת עד 10 דק ') בשעה 4 מעלות צלסיוס מתחת זמן התגלגל (10 סל"ד).
הערה: ביוטין בלוקים avidin וחלבונים biotinylated מלהיקשר החרוזים streptavidin. - טרום לשטוף את החרוזים streptavidin לפני הדגירה עם lysate התא.
- העבר כ -300 μl של streptavidin חרוזים בלועה לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ולהסיר את supernatant העליון. זה יגרום 250 μl של חרוזים. שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ תמוגה מהירה. צנטריפוגה חרוזים streptavidin ב 660 XG במשך 2 דקות ב 4 o בין כל שלב.
- חסום את החרוזים על ידי דוגרים במשך שעה 1 עם 0.5 מ"ל של חיץ תמוגה מהירה, 0.5 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל BSA ו -10 μl של 10 מ"ג / tRNA שמרים מ"ל. חרוזים ניתן להשאיר O / N בחסימת פתרון ב 4 o C עם רוטציה במידת הצורך.
- שטפו פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ תמוגה מהירה.
הערה: חרוזים מגנטיים גם יכול לשמש כדי להפחית את זמן background. יש אלה, עם זאת, קיבולת נמוכה יותר מאשר חרוזים sepharose.
- הוסף 250 μl של חרוזים streptavidin מראש שטף אל lysate המכיל avidin (משלב 1.14) ו דגירה שעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה קבועה (10 סל"ד).
הערה: זמן דגירה זוהי פשרה בין מתן זמן מחייב מספיק ומזעור סיכויים שפל RNA. - צנטריפוגה ב 660 XG במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלסיוס כדי לנקות את החרוזים streptavidin ולהעביר את supernatant לצינור 15 מ"ל חדש. מניחים בצד 1/50 ו 1/100 נפח של lysate עבור בידוד RNA וחלבון, בהתאמה.
הערה: אלה יהיו הדגימות "המאוגדות". - שטפו את החרוזים עם 1 מ"ל של חיץ תמוגה מהירה, לנער בעדינות, להעביר צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש, צנטריפוגות כמו בשלב 1.17. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
- שטפו את החרוזים עם 1 מ"ל של חיץ מהירה לשטוף, וסיבוב הפעם (10 סל"ד) במשך 5 דקות ב 4 °. חזור על פעולה זו פעמיים. שטפו את החרוזים עם 1 מ"ל של PBS ו צנטריפוגות 1x כנ"ל.
- שטפו את החרוזים שוב עם 120 μl של 1x PBS. צנטריפוגה כנ"ל, ולקחת את supernatant כולו עבור רנ"א מיצוי חלבון כמו המדגם "לשטוף".
הערה: מדגם לשטוף אחרון זה יציין את ההחמרה של הכביסות וצריך להיות של אותו נפח כמו מדגם Elution. זה יפשט עיבוד וטעינה מבחני הבאים. - כדי elute רנ"א וחלבונים הקשורים RNA מהעמודה, להוסיף 120 μl של ביוטין 6 מ"מ 1x PBS ו דגירה במשך 45 דקות ב 4 ° C עם רוטציה קבועה (10 סל"ד).
- צנטריפוגה חרוז כנ"ל ולהעביר את חומר eluted לצינור 1.5 מיליליטר חדש. ספין מדגם eluted שוב ולהעביר את השלב העליון לצינור 1.5 מיליליטר חדש על מנת להבטיח שום שריד של חרוזים.
- קח דגימות עבור RNA או מיצוי חלבון.
הערה: הנפח נלקח להסתמך על נחות היסוד ברמת assay והביטוי הבאה של RNA או חלבון העניין. כקו מנחה, לניתוח הצפוני 26, לקחת 80% מהמדגם, עבור כתם המערבי 23,27 או RT-PCR 28, לקבל 20%, ועבור ספקטרומטריית מסה 29 לגלות חלבונים חדשים, לקחת את המדגם כולו.
2. RNA הפקה
- הוסף נפח שווה של הצפת היפוך 2x Crosslinking דגירה במשך 45 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. המשך ישירות להפקת RNA.
הערה: היפוך Crosslinking ההצפה מכיל חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), אשר משפרת באופן משמעותי מיצוי RNA 20. - השתמש פנול סטנדרטי: שיטת כלורופורם 26 לחלץ RNA מן "הקלט" דגימות "מאוגדות" (שלבי 1.13 ו 1.17).
הערה: דגימות אלה מכילות כמות גדולה של הפרין המעכב RNase, אשר יכול לעכב Transcriptase- הפוך עוקבים (RT) מבחני ניצול (למשל, RT-PCR), ולכן, LiCl משקע 30 מומלצת להסיר אותו. את "wash "ו" elution "דגימות (שלבי 1.21 ו -1.24) מכילות כמויות נמוכות של רנ"א הם זרזו באמצעות השלבים הבאים. - הוסף נפח שווה של 8M guanidinium-HCl (GuHCl) ושני כרכים של אתנול 100% על "לשטוף" דגימות "elution". דגירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 2.
הערה: guanidinium יהיה לפגל חלבונים ביעילות ובכך לעכב RNases ו פרוטאזות במדגם. - צנטריפוגה ב 20,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות וזורקים supernatant. שטוף את הכדור עם אתנול ו צנטריפוגות 80% קרים שוב ב -20,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- ממס את גלולת רנ"א 400 μl מים חינם RNase המשקע שוב כדי להסיר כל שאריות GuHCl או מזהמים אחרים. הוסף 40 μl של 3 M נתרן אצטט, pH 5.2 ו 800 μl של אתנול 100%, דגירה ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1.
- צנטריפוגה ולשטוף כמו בשלב 2.4 ולהסיר כל אתנול עם טיפ 10 μl. Resuspend את פל RNAet ב 10 מים חינם μl RNase. לטפל נוסף כמו גלולת RNA היא בדרך כלל לא נראה לעין.
הערה: דוגמאות ניתן להשתמש לצורך ניתוח הצפוני כמתואר 23 (איור 1).
3. חלבון הכנה כתם המערבי או ניתוח ספקטרומטריית מסה
- להוסיף 1/3 נפח של חיץ מדגם 4x Laemmli (LSB) כדי דגימות חלבון דגירה 45 דקות ב 65 מעלות צלזיוס כדי להפוך את crosslinking של רנ"א וחלבונים.
הערה: דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C. - חלבונים לרוץ על ג'ל polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) 31. התאם את אחוז הג'ל בהתאם לגודל של חלבונים להיות מנותח.
הערה: 10% ג'ל acrylamide נותן מגוון רחב של נפרד והוא טוב כמו קירוב ראשון. - עבר חלבונים בקרום כמו בניתוח immunoblot תקן 27 על שליטה יעילה בידוד (התרשים 1C). כתם עם או Coomassie הכחול Rכתם 250 או כסף לפני ניתוח ספקטרומטריית מסה.
הערה: כתם כסף הוא הבחירה המועדפת, כי זה יותר רגיש ומאפשר זיהוי טוב יותר (איור 1 ב). מכתים ניתן לעשות עם באופן ידני פתרונות מוכנים או ערכות מסחריות. זמן הדגירה של ג'ל הפתרון לצבוע הסופי צריך להיקבע באופן ניסיוני. דגירה ארוכה עשויה לחשוף חלבונים נמוכים בשפע, אבל יכולה לגרום חלבונים מבוטאים בכמות גבוהה כגון MS2-CP-SBP-GFP להיצבע שוב עלול להסוות חלבונים שמסביב בקרבתם. בנוסף, רקע גבוה עלול לגרום. בצע את התגובה בקפידה, ולהוסיף להפסיק פתרון בזמן המתאים. - לגזור להקות מן הג'ל ולהעבירם 1.5 מ"ל צינורות. חנות דגימות ב -20 ° C, או לשלוח להפקת חלבונים העיכול טריפסין ואחריו LC-MS / MS ניתוח 32.
- כגישה proteomic אלטרנטיבה שולל את הצעד ההפרדה ג'ל, לעכל חומר eluted משלב 1.24 ב כךlution באמצעות טריפסין ובכפוף LC-MS / MS ניתוח 33.
הערה: השמטת הפרדה SDS-PAGE מפשט את פרוטוקול ומגבירה התשואה. עם זאת, דגימות עשויות להכיל עקבות של חומר הניקוי NP-40, אשר מעכב ניתוח ספקטרומטריית מסה. כדי להתגבר על בעיה זו, בצע את הפעולות הבאות:- הפעל חלבון על SDS-PAGE 31 במשך 10 - 15 דקות.
- חותכים את החלק כולו של השביל (כלומר, שבו חלבונים נמצאים).
הערה: מדגם החלבון עשוי לכלול כמות משמעותית של חלבון MS2-CP-SBP שעשוי לטשטש אותות של חלבונים בשפע נמוכים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מהיר מאפשר הבידוד של רנ"א יעד ספציפי עם החלבונים הקשורים שלה. ההצלחה קריטית שלה הוא שמירה על רנ"א ללא פגע ככל האפשר, ועל ידי כך הושגה כמות של חלבונים מספיק. כדי לקבוע את יעילות הבידוד ואיכות RNA, ניתוח צפון מתבצע (איור 1 א). יש ניתוח צפון היתרון של ישירות דיווח יעיל והאיכות של ראפיד. לפיכך, את הסכומים היחסיים של מוצרים אורכים והשפלה מלאים ניתן לקבוע בטווח אחת. RNAs ריבוזומלי (rRNAs) מזוהים בקלות מכתים ברומיד ethidium, וחוסר rRNAs במדגם elution מציין את ההחמרה של טיהור. ההחמרה והספציפית של הטיהור מודגם עוד יותר על ידי חוסר איתות של mRNA מתויגת בדגימות elution (פנל תחתון ACT1). האות נראית לעין בנתיב FPR1, וזה לא בגודל של ACT1, היא שאריות מראשכלת vious עם חללית MS2L. הניתוח הצפוני גם מגלה כי קלט RNA הוא מעט יותר מושפל לעומת RNA כי היה מטוהר על ידי פרוטוקול פנול חם (c / o ACT1 פאנל בדיקה). זו מיוחסת הפרוטוקול המהיר הממושך ומורכב יותר. אף על פי כן, כמות משמעותית של באורך מלא, מתויגת RNA מבודד במיוחד, כפי שהיא מתגלה על ידי האיתות החזקה בשבריר elution (בדיקת MS2L).
ניתן להפעיל דגימות חלבון על SDS-PAGE וכתמי כתם כסף לפני ניתוח פרוטאומיקה (איור 1B). מדגם מבודד שליטה, תאים מתויגים (-MS2L) יכול לסייע בהתמודדות עם עמותות שאינן ספציפיות מבדילות מאלו תלויים RNA. לכן, רק להקות שהם חזקים במדגם המתויג (+ MS2L) נחתכות מתוך הג'ל ונלקחו עבור LC-MS / MS. ניתוח מערבי עם RBPs הכללי מומלץ גם כדי לציין את היעילות של חלבון שיתוף טיהור (איור1C). בזאת, השתמשנו Yef3, אשר ידועה אינטראקציה עם PMP1 20, או GFP, אשר מציין את היעילות הכוללת וספציפיות של בידוד. מעניין לציין, כי יעילות הבידוד Yef3 נראה שונה בין PMP1 ו FPR1, והוא נמוך בהרבה לעומת GFP.
בידוד ספציפי איור 1. RNAs מתויג MS2L וזיהוי Associated החלבונים. התוצאות של שני RNAs השונה אשר עברו מהיר (PMP1 ו FPR1) מוצג. (א) ניתוח כתם צפון של דגימות RNA מטוהרות מניסוי מהיר. RNA נדרס על ג'ל agarose ו מוכתם ברומיד ethidium (הפאנל העליון). הג'ל היה מחק קרום ניילון נתון הכלאה עם בדיקות המצוינות (לוחות נמוכים). הדגימות נותחו הם: מהר תאים תמוגה (פנול חם [שלב 1.4]), ראתמוגה תא מח"ש (קלט [צעד 1.13]) ואחרי elution עם ביוטין ([צעד 1.24] elution). (ב) כתם כסף של חלבונים מן מהיר עם MS2-tagged ותאים מתויגים. דגימות חלבון מתוך שברים elution של PMP1 MS2-tagged (+ MS2L) או לא מתויגות (-MS2L) שליטה נוהלו SDS-PAGE וכסף מוכתם. להקות בעצמת הפרש (מסומן על ידי כוכביות) נחתכו מתוך הג'ל שנקבעו על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסה. החץ מציין את החלבון היתוך MS2-CP-GFP-SBP אשר מביא לידי ביטוי טעינת חלבון שווה. נתיבים לא רלוונטיים היו חתוכים לבהירות. (C) ניתוח מערבי של בקרות חיוביות. כתם המערבי עם נוגדנים שמזהים מחצית Yef3 או GFP של החלבון היתוך MS2-CP נערך. נתיבים לא רלוונטיים היו חתוכים לבהירות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות שונות להשתמש הבידוד של mRNAs ספציפי לזהות חלבונים הקשורים בהם 11,34 35. שיטות אלה חלות במבחנה אסטרטגיות vivo לחקור אינטראקציות RNA-חלבון. שיטות חוץ גופית דגירה עיבד אקסוגני RNA עם lysate התא כדי ללכוד RBPs ולבודד מתחמי RNP 36,37. גישה יעילה מסוג זה הוצגה לאחרונה, אשר אפשרה זיהוי של חלבונים חדשים אשר נקלטים מוטיב RNA רגולטוריים 18. חסרון של שיטות אלה הוא המחייב של RBPs הלא ספציפית כי העמותה מתרחשת מחוץ לסביבת הסלולר. שיטות בחי שבו חלבונים הם crosslinked תוך בסביבה הטבעית שלהם, עשוי לספק תצוגה טובה יותר של עמותת RNA-חלבון. יתר על כן, crosslinking מאפשר חומרא גבוה במהלך בידוד ולכן סגוליות גבוהות יותר. גישת הזוג 17 מנצלת את transfection של antisenseרצף של RNA היעד על מנת לביים מחצית פפטיד בקרבת RBPs. הפפטיד-RBPs אז יכול להיות crosslinked ומבודד דרך חרוזים שמקושרים לרצף כי הוא משלים את רצף antisense. המתודולוגיה הזוג יש יתרון מאוד בשל היישום הפשוט שלה סוגי תאים רבים ללא צורך מניפולציות גנומי מורכבות. היא, לעומת זאת, תלוי את היעילות של transfection, ומקרים בהם אחוז נמוך של תאי לקבל את antisense תהיה יעילות נמוכה. יתר על כן, את הבידוד של רצף RBP-פפטיד-antisense מתקבל באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin כי הם מצמידים עם oligonucleotide biotinylated משלים חומצת גרעין antisense. ריבוי אינטראקציות (חרוזים מגנטיים, streptavidin-ביוטין זיווג בסיס) עשוי להגביל את ההחמרה והיעילות של הבידוד. את השיטה המהירה 24 המתואר כאן מספק אלטרנטיבה מגבלות אלה כמה היבטים. ראשית, לאהוא שילוב של MS2 לולאות לתוך לוקוסים הגנומי מבטיח כי כל התאים לבטא את זה, ובכך להגדיל התשואה שלה. שנית, היא משתמשת אינטראקצית הזיקה הגבוהה של MS2-CP-GFP-SBP עד שתים עשרה MS2 לולאת רצפים ומאפשרת להם להיקשר in vivo. שלישית, קיבעון של האינטראקציה RNA חלבון מאפשר שוטף מחמירים יותר ומקטין את הזיהוי של כבול שאינם במיוחד חלבונים. לבסוף, התחום SBP נקשר חרוזים streptavidin עם זיקה גבוהה והוא eluted בקלות עם ביוטין חינם.
קלטי לולאת MS2 לתוך RNA רצויים בין ORF ואת 3 'UTR למזער הפרעות תרגום ולהבטיח ביטוי של כל הלולאות. שש עד 24 MS2 חוזר לולאה שימשו בעבר עבור להדמיה של לוקליזציה mRNA 38-40. עם זאת, החדרת רצף ארוך של MS2 לולאות עשויים לגרום לשינויים בעיבוד והמבנה של רנ"א; זה עלול לערער את התמליל או לשנות את הרפרטואר של RBPs כבולאליו. מניסיוננו, 12 לולאות מספיקות כדי לקבל elution יעיל של MS2-tagged RNA 20. מבחינה זו, נציין, כי אנו בדרך כלל שנצפינו תמלילים קצרים נוספים ההכלאות הצפוניות שלנו. צפון מנתח עם בדיקות שונות הנחשפות שצורות קצרות אלה כללו את MS2L וחלק 20 3 'UTR, מעיד על סיום שעתוק מוקדם. מקרים כאלה עלולים להפחית את היעילות של הבידוד של חלבונים הקשורים עם UTR '3. לכן, מספר לולאות מוכנסות ומיקומם בתוך RNA יש לאזן בין ויציבות תמליל נפתחים יעילות הגבוהה.
רנ"א יש להישאר שלמים ברחבי הפרוטוקול כדי לאפשר בידוד יעיל וזיהוי של המערך המקסימאלי של חלבונים מאוגדים. רוב הסיכויים לזיהום RNase חיצוני יכול להיות מופחת על ידי לבישת כפפות, הבטחת סביבת עבודה נקייה, הכנת פתרון עם מים RNase ללא, ועבודה תמציתיוביעילות כדי לקצר את זמן פרוטוקול. אף על פי כן, מצאנו כי התורם הגדול ביותר שפלת RNA הוא השחרור RNases הסלולרי אל lysate על תמוגה תא. הוצע כי שחיקה קריוגני של תאי שמרים עם תוצאות טחנת מכני טיהור RNA משופרת 41. זה יכול להישפט במקרים בהם השפלה משמעותי הוא ציין עם פרוטוקול זה.
חסרון משותף של מבחני נפתח הוא הבידוד של חלבונים רבים אשר נקלטים nonspecifically לעמודה. לכן, השימוש של זן שמרים עם RNA המתויגת הוא פקד חשוב. זן זה מבטא את החלבון היתוך MS2-CP-GFP-SBP להמשיך לכלול חלבונים אשר נקלטות על ידי החלבון היתוך ולא RNA היעד. נציין כי זו אינה שוללת חלבונים שעשויים לקשור את הלולאה MS2 עצמה, ואלה צריכים הוכחה נוספת עם assay הנפתח חלבון. 1B איור מראה כי הצלחנו לזהות כמה חלבונים הנקשריםבמיוחד כדי PMP1 mRNA, וחלק מכן אומתו על ידי assay שיתוף IP 20.
המתודולוגיה המהירה כיום מוגבלת למערכות שמרים, ניצול מתודולוגיות אינטגרציה באתר ספציפי ומבוססת שלה. פרוטוקולים שילוב ספציפי אתר מפותחים כיום עבור גנים במערכות אחרות באמצעות מערכת CRISPR-קאש 42,43. אלה יהיו בעלי חשיבות רבה בהרחבת הניצול המהיר למערכות נוספות. יישום עתידי של ראפיד הוא הבידוד של RNAs המשויכים עם mRNA של עניין. זו יכולה להיות מושגת בקלות, על ידי העמדת החומר המבודד כדי RNA-seq ולא LC-MS / MS. בהתחשב התפקידים החשובים של RNA הקטן בויסות ביטוי mRNA, יישום זה עשוי להיות בעל חשיבות רבה. לבסוף, השיפורים ספקטרומטריית מסה (MS) ניתוח והשימוש בשיטות כמותיות MS כגון SILAC יגרמו מדד כמותי של mRNA הנכנס proteins בתנאים שונים. המהיר ניתן להשתמש עם שמרים הגדלים מדיה מועשרת איזוטופים כבדים לעומת תאים שגודלו בתנאים שונים (למשל, מתח) עם תקשורת ללא תווית 44,45. החלת השיטה המהירה יחד עם ניתוח MS כמותית תניב צעדים מדויקים של שינויים ברפרטואר RBP המשויכים עם mRNA מסוים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים פרופ 'ג'ף Gerst ובוריס Slobodin עבור העצות המועילות שלהם בהקמת הפרוטוקול המהיר ומתן פלסמידים הדרושים. כמו כן, אנו מודים לד"ר אביגיל עתיר-לנדה על עזרתה בהקמת פרוטוקול זה וד"ר תמר זיו ממרכז פרוטאומיקה סמולר על עזרתה עם ניתוח LC-MS / MS. אנו מודים פרופ TG Kinzy (Rutgers) עבור נוגדן YEF3. עבודה זו נתמכה על ידי מענק 2011013 מהקרן הדו-לאומית למדע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
