Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Jernklorid-indusert Murine Trombose Modeller

Published: September 5, 2016 doi: 10.3791/54479
Automatic Translation
1,2, 3, 4
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

Vi rapporterer en raffinert prosedyre av jernklorid (FeCl3) indusert trombose modeller på carotis og mesenteric arterie samt vene, preget effektivt ved hjelp av intravital mikroskopi for å overvåke tid til okklusiv tromber formasjon.

Introduction

Arteriell trombose (blodpropp) er en vanlig komplikasjon ved mange systemiske sykdommer assosiert med kronisk betennelse, inkludert aterosklerose, diabetes, fedme, kreft og kroniske autoimmune revmatologiske lidelser. Tromber som oppstår i den arterielle sirkulasjonen stammer fra upassende plateaktivering, aggregering og påfølgende coagulatory mekanismer, og er innblandet i hjerteinfarkt, slag og ekstremiteten tap. Karveggen er et komplekst system som inneholder flere celletyper og er påvirket av en rekke av ytre faktorer, inkludert skjærspenning, sirkulerende blodceller, hormoner og cytokiner, så vel som ekspresjon av antioksidant proteiner i karveggen. In vitro forsøk kan ikke replikere dette komplekse miljø og derfor in vivo-studier som anvender dyremodeller er kritiske for å gi bedre forståelse av mekanismene som er involvert i trombotiske lidelser.

Mus har vist seg å ha simILAR mekanismer til mennesker i form av trombose, aterosklerose, betennelser og diabetes 1,2. Videre kan transgene mus og knockout opprettes for å teste funksjonen av spesifikke genprodukter i et komplekst fysiologisk eller patologisk miljø. Slike studier etterligne menneskelig patologi og kan gi viktig mekanistisk informasjon knyttet til oppdagelsen av nye stier og terapi, samt gi viktige opplysninger for å karakterisere virkninger av rusmidler på trombose.

Patologiske arterielle tromber oppstå på grunn til endotele lag skade eller dysfunksjon og eksponering av blodstrømmen til subendotel-matriksen 3,4. Ulike trombose modeller har blitt utviklet for å stimulere denne endothelial skader som mekanisk skade, fotoreaktive forbindelse Rose Bengal-baserte oksidativ skade og laser skade fem. I dette spektrum, Ferroklorid (FeCl3) indusert vaskulær skade er en mye brukt modell av trombose. Denne reagensen nårpåført den ytre del av fartøyer induserer oksidativ skade på vaskulære celler 6-8, med tap av endotel celle beskyttelse fra sirkulerende blodplater og komponenter i koagulasjonskaskaden. Det FeCl3-modellen er enkel og følsomme for både antikoagulant og anti-blodplater stoffer, og har vært utført på arteria carotis og femorale arterier, vena jugularis, og mesenterisk og cremasteric arterioler og venuler i mus, rotter, marsvin og kaniner 6-15.

En målbar parameter i denne modellen er den tiden som går fra skade til å fullføre fartøy okklusjon, målt som blodstrømmen opphør med en Doppler strømningsmåler eller under direkte observasjon med intramikros 6,7,9. En rekke ganger mellom 5 til 30 minutter er blitt rapportert i forskjellige studier på C57BL6 mus 7-10,16, noe som tyder på at FeCl3 konsentrasjoner typer anestesi, kirurgiske teknikker, mus alder, genomisk bakgrunn, fremgangsmåte for måling blood flyt, og andre miljøvariabler har betydelige effekter i denne modellen. Denne brede variasjonen gjør det vanskelig å sammenligne studier fra ulike fagmiljøer og kan gjøre deteksjon av små forskjeller vanskelig.

Med en visjon om å minimere slike variabilities og etablere en enhetlig reproduserbar in vivo modell system, har vi videreutviklet FeCl3 indusert halspulsåren modell som gjør dataene svært reproduserbare med minimal variasjon 6-10,16-19. I denne artikkelen beskriver vi og dele kompetanse og rapportere flere representative eksperimentelle eksempler som kan dra nytte av denne modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer og manipulasjoner av dyr har blitt godkjent av Institutional Animal Care og Bruk komiteer (IACUC) av The Cleveland Clinic i samsvar med USA Public Health Service politikk på Humane Stell og bruk av dyr, og NIH Guide for Pleie og bruk av forsøksdyr.

1. Forberedelser:

  1. Fluorescerende fargestoff for merking Blodplater
    1. Fremstille rodamin 6G oppløsning, 0,5 mg / ml i saltvann og sterilisere løsningen med 0,22 um filter.
  2. FeCl3 Solution
    1. Lag en ny lagerløsning på 30% FeCl3 (vannfri, tilsvarer 1,85 M) i rent vann, og filter med 0,45 mikrometer filter. Forbered 5 ml frisk FeCl3-oppløsning ved den ønskede konsentrasjon [for eksempel, 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) og 12,5% (0,771 M)] etter fortynning av 30% FeCl3-løsning med vann ina 6 cm vev kultur tallerken og holde lokket lukket.
      MERK: Ved hjelp av kulturskålen gjør det lettere å plukke opp filterpapir mettet med FeCl3-løsning enn å plukke den opp fra en smal beholder, slik som et 1,5 ml mikrosentrifugerør. FeCl3 er ekstremt farlig og at regler, for eksempel på seg hansker og frakk etc., Personlig verneutstyr bør alltid tas.
  3. filter Papers
    1. Skjær filterpapiret til 1 mm x 2 mm størrelse. Sug nok stykker av cut filter papir i FeCl3 løsning i den samme retten.
  4. Papaverin hydroklorid Solution
    1. Fremstille papaverin hydroklorid oppløsning (25 mg / ml) i vann og sterilisere løsningen med 0,22 um filter.
  5. agarosegel
    1. Fremstille 2% agarosegel i PBS eller saltvann i 6-brønners vevkulturplate, ~ 1 cm tykkelse, og cutca det til halv-sirkel med ~ 3 cm diameter.

2. FeCl3 Induced carotis arteriell skade Trombose Modell

  1. Kirurgiske prosedyrer for trombose Model
    1. Bruk 8 - 12 uker gammel C57BL6 mus (eller andre stammer som nødvendig). Bedøve mus med en blanding av ketamin (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injeksjon. Bekreft dybden av anestesi ved tå knipe.
      NB: Denne mengden av ketamin / xylazin er tilstrekkelig til å holde dyret i stabil anestesi og ingen smerte (som reaksjon på tå klemming) i minst 1 time.
    2. Fjern pels på nakken og øvre del av brystet med et lite dyr elektrisk hårklipperen. Hårfjerningskrem er ikke nødvendig. Påfør nøytral petroleums øyesalve på øynene for å hindre tørrhet under anestesi.
    3. Fest musen i liggende stilling på lokket 15 cm vev kultur plate. Bruk en lang tape (~ 10 cm) for å sikre hind lemmer og nedre del av kroppen, og to stykker av små bånd (2 cm x 0,5 cm) for å sikre forben. Bruk en 4-0 sutur å vikle rundt fortennene, tape de to endene av sutur til lokket for å holde mus halsen rett (figur 2).
    4. Plasser plate med musen hodet mot operatøren under et kirurgisk lyskilde.
    5. Sterilisere kirurgiske området med alkohol pad. Bruk Micro-Adson tang for å holde huden og bruke en kirurgisk saks for å lage et lite snitt (2-3 mm).
    6. Holde huden i snittet med pinsett og sett kirurgiske sakser med kjevene lukket inn i snittet. Skyv saks subkutant mot manubrium eller hake, og deretter åpne saksen for å frigjøre huden fra det subkutane lag.
    7. Kutt i huden med kirurgiske sakser for å lage et midtlinje innsnitt fra manubrium til nivået av hyoid ben (figur 3A og 3B). Rett ut dissekere den tynne fascia (stiplet linje, i (Figur 3B og 3C, blå piler).
      MERK: manubrium (svart pil i figur 3C) og luftrøret (T i Figur 3C) vil bli sett etter dette trinnet.
    8. Hold bløtvev og huden sees på høyre side av manubrium med Græfe tang, setter pinsetten under fascia mot klokken 2 posisjon (gul stiplet linje i figur 3C), åpne kjevene til pinsetten for å frigjøre halsvenen fra omkringliggende vev.
    9. Skjær fascia, bløtvev og hud mot klokken 2 posisjon (figur 3C) med kirurgisk saks for å eksponere riktig halsvene (figur 3D, pil).
    10. Tegn på 200-300 mL rhodamine 6G løsning ved hjelp av en 1 ml sprøyte med 22 G nål, og deretter bytteden til 30 G nål.
      MERK: Dette beskytter 30 G nål fra skade av sin fine tips. Direkte tegning rhodamine 6G løsningen med 30 G nål skader ikke spissen; imidlertid berører beholderveggen ved et uhell vil forårsake skade, noe som kan gjøre injeksjonen vanskelig.
    11. Skyll 30 G nål ved sakte skyve ut rhodamine 6G løsning, sørge for at ingen luftbobler i sprøyten eller nålen. Hold 100 ul rhodamine 6G injeksjonsvæske, oppløsning.
    12. Bend 2 - 3 mm spissen av kanylen til en 90 ° vinkel med nåleholderen, noe som vil hindre innsetting av nålen for dypt til vena jugularis og gjør injeksjonen mer lett kontrolleres (figur 3D).
    13. Injiser rodamin 6G oppløsning i den høyre jugularvenen for å etikettblodplater. For å stabilisere sprøyten og holde nålen på plass, hold sprøyten med den ene hånden og nålen med Græfe tang med en annen hånd under injection.After injeksjon, klemme injeksjonsstedet med Græfe tang for å unngå blødning.
    14. Åpne kjevene på pinsetten og sett den under Græfe tang for å klemme åreveggen av injeksjonsstedet, og deretter ligate injeksjonsstedet med en 6-0 sutur.
      MERK: Som et alternativ til trinn 2.1.15, det legges press på injeksjonsstedet med en finger for 2 min vil stoppe blødningen; Men denne metoden har en risiko for å forårsake ytterligere blødning dersom koagulere ved injeksjonsstedet er fjernet ved et uhell.
    15. Rett ut dissekere bløtvev og konseptet rundt den venstre kjertler under kjertelen med pinsetten og Græfe tang og trekk kjertelen mot klokken 7 posisjon (figur 3E) å eksponere venstre sternocleidomastoideus (blå pil i figur 3E).
    16. Rett ut dissekere fascia (Figur 3E, stiplet linje) mellom venstre sternocleidomastoideus og omohyoid muskel eller sternohyOID muskel (Figur 3E, grønn pil) befinner seg til venstre side av luftrøret med pinsetten.
    17. Passere en nål med 6-0 silke sutur (ca 15 cm lang) under midten av sternocleidomastoideus (blå pil i figur 3E), satte de to endene av sutur sammen og trekk sutur sidelengs mot klokka 10 posisjon .
      MERK: Denne prosedyren skal utføres nøye for å unngå skade på den venstre halsvene, som ligger utenfor sternocleidomastoideus.
    18. Rett ut skille tynn sternohyoid muskel og / eller omohyoid muskler til å eksponere halspulsåren (CA) (figur 3F pil) etter å trekke bort sternocleidomastoideus. Skjær sternohyoid muskel og / eller omohyoid muskel som nødvendig. Bruk pinsetten for å skille myke vev fra CA uten å berøre CA.
      MERK: CA følges av nervus vagus, den hvite strukturen sett i figur 3F).
    19. Bruk en fin spiss pinsett til å plukke opp den laterale fascia rundt CA samtidig unngå vagus nerve og CA. Bruk en annen fin spiss pinsett til å slå et hull på fascia mellom CA og vagus nerve.
    20. Før kroken gjennom hullet og løft CA forsiktig, og deretter plassere fin spiss pinsett under CA. Flytt kroken og tang i hver sin retning langs CA å strippe adventitia bløtvev. Gratis minst ~ 5 mm lengde CA (figur 3 H, blå pil) fra omkringliggende vev.
    21. Hvis du vil blokkere bakgrunn fluorescens, trykker du på slutten av en svart plast kaffe pumpe til flatskjerm, kapping av kaffen stirrer inn i en 3 mm stykke, og deretter klippe lengderetningen langs brettekanter å få to stykker av "U" -form plast (figur 3 H, grønn pil).
      22. (figur 3 H, grønn pil). Umiddelbart bruke 2-3 dråper saltvann for å unngå tørking av CA.
  2. Sanntid opptak Video
    1. Overfør musen og plate lokk sammen til mikroskopet scenen og plasseres i en egnet posisjon under 10X vann linsen. Fylle mellomrommet mellom 10X objektiv og en CA med saltvann.
    2. Start digital video-opptak program, og lanserer en ny fil og navngi den deretter. Spill normale fartøyet bilder og skrive ned rammenummeret når videoopptaket er stoppet.
      MERK: Referer til video-opptak programvare i datamaskinen for opptak. Vi bruker digital video-opptak programvare og følgende beskrivelser er basert på dette programmet.
      MERK: Siden mekanisk trauma kan skade endotelet og føre til trombedannelse 20, er det nødvendig å bekrefte at det ikke er noen kirurgisk skade på karveggen før FeCl3 skade. Det er også nødvendig for å bekrefte at det ikke er noen gjenværende vevet rundt CA, som kan danne en barriere og dempe virkningen av FeCl3-indusert skade. Skriv ned rammenummeret av postene vil gjøre det enkelt å analysere videoene etter medgått tid senere.
    3. Beveg musen med plate lokket ut av 10X objektiv. Brett et hjørne av et papirhåndkle for å lage en tynn og fin spiss og bruke den til å forsiktig klatt saltvann rundt CA (unngå å berøre CA) så vel som i andre steder i operasjonsområdet. Dette er viktig for å unngå fortynning av FeCl3-løsning anvendt.
    4. Bruk en fin spiss pinsett og plukke opp et stykke filterpapir mettet med FeCl3 løsning og plassere den direkte på CA og holde den på stedet for 1 min.
      MERK: To hjelp visualisering av blodstrømmen og høste nøyaktige data, plasseres filterpapiret i nærheten av den distale enden av den blottlagte CA (figur 3I) og la et kort segment i den proksimale området (grønn pil i fig 3I) for å observere blodstrøm på sen fase (se nedenfor).
    5. Fjern filterpapiret (dette tidspunkt er definert som starten på "etter skade") og skyll CA med saltvann (minst 2 ml).
    6. Sett mus med plate lokket tilbake til 10X linse; observere fartøyet og begynner å ta opp videobilder. Skriv ned video rammenummeret på slutten av det første minuttet av opptaket.
      MERK: Trombedannelse er identifisert av opphopning av fluorescerende blodplater, som er observert i sanntid videobilder på dataskjermen eller under mikroskop. Record videobilder umiddelbart etter å sette musen tilbake under mikroskop. Hold opptak til enden av det første minutt etter fjerning av fIlter papir. Observer hele fartøyet fra distal til den proksimale nettsider for å få informasjon om skaden, og deretter fokusere på det området av interesse (vanligvis er sentrum av det skadde området) for videre bildebehandling.
    7. Spille inn videobilder til 10 sekunder hvert minutt i de første 10 min (for eksempel 2:55 til 3:05) og deretter 10 sek hvert annet minutt inntil slutten av forsøket. Skriv ned rammenummer når hver opptaket er stoppet.
      MERK: Endepunktene i modellen er: 1) når blodstrømmen har opphørt for> 30 sekunder; eller 2) dersom okklusjon ikke er sett i 30 minutter etter skade. I dette tilfellet bruker 30 min for statistisk analyse. Sett Exposure Time av video-opptak som 10 msek i begynnelsen, så det vil være lett å observere blodstrømmen over tromber. Når tromber bli store og fluorescens metter kameraets sensor, blir det vanskelig å identifisere blodstrømmen over tromber. For å løse dette problemet, må du flytte bilde center til den proksimale uskadet området (figur 3I, grønn pil) hvor blodstrømmen kan fremdeles observeres tydelig. Vi øker også Expose Tid til 15 eller 20 ms når du fokuserer på den proksimale un-skadet området, slik at blodstrømmen kan observeres mer tydelig. Når blodstrømmen opphører, flere større celler (leukocytter) begynne å rulle på beholderveggen ved den proksimale området av tromben. Strømmen stopper vanligvis i løpet av 2 - 3 minutter etter utseendet av de store celler. Skriv ned Expose tid på opptaket ført dersom det blir endret. Det tar vanligvis omtrent 30 minutter fra anestesien til slutten av eksperimentet, hvis de normale villtype C57BL6 mus ble anvendt.
      FORSIKTIG MERK: Ikke bruk den hvite aggregert platekoagel som et tegn på blodstrømmen opphør, som ikke vil gi en nøyaktig data og den påvirkes av eksponeringstiden. Den hvite blodpropp dekket karlumenet betyr ikke at blodstrømmen opphørt (se representant video 1).

3. FeCl3 Induced Mesenteric Artery / venetrombose Model

  1. Anesthetize 8-12 uker gamle C57BL6 mus som nevnt i avsnitt 2.1.1. Påfør dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet under anestesi.
  2. Injiser Papaverin oppløsning (totalt 0,4 mg / mus) intraperitonealt til å hemme tarm peristaltikk.
  3. Fjern pels på halsen og magen med et dyr elektrisk hårklipperen. Hårfjerningskrem er ikke nødvendig.
  4. Fest musen i liggende stilling på lokket 15 cm vev kultur plate. Bruk fire stykker av liten tape (2 cm x 0,5 cm) for å sikre alle ben. Bruk en 4 -0 sutur å vikle rundt fortennene, tape de to endene av sutur til lokket for å holde nakken rett (figur 2).
  5. Følg prosedyrene 2.1.4 -2.1.15 å avsløre halsvene for injeksjon av rhodamine 6G til etikettblodplater.
  6. Utfør en midtlinjen snitt gjennom huden fra xiphoid til nedre del av magen ved hjelp av kirurgisk saks (Figur 4A). Plukk opp midt bukhinnen (også kalt linea alba, 4A, pil) med Græfe tang, som er klar og har ingen blodkar, løfter ca 2-3 mm høy, bekrefter ingen tarm under klippelinjen, og kutte bukhinnen åpen i lengderetningen med de fine saks (figur 4B).
  7. Re-feste mus til høyre sideleie. Plasser den halv-sirkel agarosegel nær til magen, og forsiktig exteriorize tarmene og spre den på toppen av gelen med Græfe tang (figur 4C). Bruk den andre grener for trombose forsøket (figur 4C, pil).
    MERK: Bruk pinsetten eller Micro-Adson tang for å bidra til å exteriorize tarmen. Unngå å skadetarm og fartøyet.
  8. Plasser 5. - 6. dråper saltvann for å holde fuktigheten i tarmen og fartøyet. Overfør musen med platen lokk sammen til mikroskopet scenen og plassere i riktig posisjon under 10X tørr objektiv.
    MERK: Bruk en tørr objektiv fordi jejunoileal membranen ikke kan holde saltvannsoppløsning. Sørg for å slippe saltoppløsning på utsatte vev for å holde dem fuktig.
  9. Blot saltvann rundt mesenteric arterie og vene før behandling.
  10. Bruk en fin spiss pinsett til å plukke opp et stykke filterpapir mettet med 12,5% FeCl3 løsning og plassere den direkte på mesenteric arterie og vene i 1 min (figur 4D). Fjern filterpapiret (dette tidspunkt er definert som starten på "etter skade") og skyll den skadde mesenteriske arterie og vene med saltvann (minst 2 ml).
  11. Sett mus med plate lokket tilbake under 10X tørr linse; observere fartøyene og begynner å recOrd videobilder som nevnt i 2.2).
    MERK: Endepunktene i dette eksperimentet er: 1) når blodstrømmen har opphørt for> 30 sekunder; eller 2) dersom okklusjon ikke er sett i 30 min etter skade, og i dette tilfellet bruker 30 min for statistisk analyse.
  12. Ved slutten av eksperimentet, avlive musene ved hjelp av overdosering ketamin / xylazin (200/20 mg / kg), etterfulgt ved cervikal dislokasjon etter at det ikke pust og hjerteslag blir bekreftet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Carotis arteietrombose Model
Hos mus med C57BL6 bakgrunn, anbefaler vi å bruke 7,5% FeCl3 å behandle fartøyet i 1 min som utgangspunkt. Under behandling av 7,5% FeCl3, er grensene til skadde området og normal åreveggen lett identifiseres i henhold mikroskop (Se online video 1), noe som tyder på at endothelial laget ble betydelig skadet. Trombi som dannes umiddelbart etter FeCl3 behandling, og blir observert i det hele tatt WT C57BL6 mus 1 min etter skade. Den opprinnelig dannet tromber er ustabile og deler av dem er vanligvis vasket bort av blodet, så dannes tromber blir mindre ved 2 - 3 min etter skade. Tromber begynner å forstørre 3-4 minutter etter fjerning av filterpapiret og disse senere dannet tromber er stabile og vanligvis er ikke vasket bort. Den gjennomsnittlige okklusiv tid er 11.3 ± 3.16 min i C57BL6 mus (n = 14) når 7,5% FECL 3 brukes 6,7,19 (figur 5A og online video 1). I tidligere studier har man vist at både reduksjon og økning av FeCl3 konsentrasjoner minske forskjellen mellom en anti-trombotisk musestamme og WT mus 6; Fra vår erfaring, behandling av halspulsåren med 7,5% FeCl3 i 1 minutt er tilstrekkelig til å tilfredsstille alle våre formål. I tillegg til å teste funksjonen av spesifikke gener ved hjelp av knockout mus 7,8,16,19,21, følgende er fire representative eksperimenter ved hjelp av denne modellen:

Intravenøs perfusjon av vev-type plasminogenaktivator Mediated Trombolyse
Vevstypeplasminogen-aktivator (tPA) er en av de FDA-godkjente legemidler for trombolyse behandling i USA 22. Vi har således observert at tPA-mediert trombolyse i den karotide arterien trombose modell. trombose varinitiert med 7,5% FeCl3 og tillatt å danne i 5 minutter før tPA (1 mg / kg kroppsvekt) ble perfusert via et halsvenekateter (22GA). Som vist i figur 5B og video 2, tromben stadig forstørres og okkuperte ca. 50% av hulrommet 5 min etter skade. Den tromber fortsatte å forstørre etter tPA perfusjon som tyder på at tPA ikke påvirker plateaktivering og aggregering. Trombolyse startet ca 4 minutter etter tPA injeksjon. Den dannes tromber ble funnet å gjennomgå størrelsesvariasjoner gjentatte ganger i løpet av 30 min observasjonsperiode og ingen fartøy okklusjon skjedd i dette tilfellet. Disse data viste klart at tPA ikke kan fullstendig hemme blodplate-mediert trombedannelse, selv om det fører til trombolyse. Derfor ser vi for oss at fremtidige eksperimenter som anvender FeCl3-indusert arteriell trombose modell kan anvendes for å evaluere trombolytisk og andre supplerende terapier som kan ha en fremtredende preventative effekt på trombedannelse.

Perfusjon av PAR4 Antistoff mot Mus Hemmer tromboser
Protease aktivert reseptor 4 (PAR4) er en G-proteinkoblet reseptor (GPCR) på blodplater som blir aktivert ved proteolytisk spalting av den N-terminale exodomain 23 og deretter fører til fremgangsmåten i blodplateaktivering. Den Nieman lab har generert en geitepolyklonalt PAR4 antistoff (CAN12) som er rettet mot den anioniske klynge av PAR4, og forsinker PAR4 cleavage, og dermed påvirke et avgjørende skritt for PAR4 mediert blodplateaktivering 24. Ved perfusjon av 1 mg / kg av dette antistoff til C57BL6 mus, har vi funnet at inhibering av spalting PAR4 forlenget signifikant tiden til okklusiv trombedannelse i 7,5% FeCl3 indusert karotidarterie trombose modell (Figur 5C og video 3). Dette viser at FeCl3-indusert trombose modell cen bli anvendt for å evaluere effektene av anti-blodplatemidler og karakterisere potensielle terapeutiske strategier.

Nanopartikkel-mediert tromber spesifikk målretting
Hurtig koagel-fjernelse for å gjenopprette blodstrømmen er viktig ved behandling av okklusive vaskulære sykdommer, inkludert iskemisk slag og myokardinfarkt. Systemisk levering av trombolytiske midler, slik som tPA vist ovenfor, kan lysere den dannede tromber, men kan ikke fullstendig hindre plateaktivering og re-aggregering / okklusjon. I tillegg kan systemisk direkte levering av slike serin-protease-midler fører til vilkårlige off-target handling, noe som fører til store bivirkninger som blødning. Sen Gupta lab har utviklet plate inspirert nanopartikkel-baserte syntetiske levering kjøretøy som kan binde til blodpropp-forbundet aktiverte blodplater og proteiner etter hemodynamic skjærstrømmen 25-27. Vi derfor undersøkt om disse nanopartiklene kanbindes til aktivt å danne blodpropper i en arterie.

Som omtalt i eksperiment for tPA perfusjon, ble et kateter ført inn i vena jugularis og forbundet med en injeksjonspumpe for injeksjon av nanopartikler med jevn strømningshastighet. I dette eksperimentet, ble ingen fluorescens fargestoff injiseres i mus for å merke blodplater. I stedet ble de nanopartikler merket med Rohdamine B; derfor de var i stand til å bli observert etter intra mikroskop. Trombosen ble initiert med 7,5% FeCl3 behandling i 1 min som tidligere nevnt. Siden i WT mus, ble en betydelig mengde av tromber funnet å danne 5 min etter skade, valgte vi dette tidspunkt for injeksjon av nanopartikler for å detektere om nanopartikler bindes effektivt til aktivt å danne tromber. Som vist i figur 5D og online video 4, etter injeksjon av fluorescerende nanopartikler, var vi i stand til å identifisere et fjell-formettrombe som fikk gradvis dekket av fluorescerende partikler. Disse studiene demonstrerer nytten av FeCl3-indusert trombose modell for å evaluere målretting evne (og påfølgende terapeutisk effekt) av blodpropp-målrettede partikkelformede medikamentavleveringssystemer.

Rollen til Røde andre enn blodplater i Trombusdannelse Blood Cells.
Nylige studier har antydet at røde blodceller (RBC) spiller viktig rolle i den FeCl3 indusert trombose modell 28 og de ​​er de første adherente blodkomponent til den skadde karveggen 29,30. For å utforske dette fenomenet, merket vi RBC med 1,1'-dioktadekyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perklorat (Dil, 10 mM endelig konsentrasjon). De Dil-merkede røde blodceller ble vasket to ganger med PBS og resuspendert i saltvann med 35% hematokrit. Den Dil-merket RBC suspensjon (100 ul per mus) var injisereed inn i trombocytopeni mus som har blitt livsfarlige bestrålt 5 dager før forsøket 19. Disse trombocytopeni mus har betydelig redusert antall blodplater, som vil øke sjansen for RBC avventende til åreveggen, hvis de gjør. I motsetning til forsøkene ved hjelp av fluorescens-merkede blodplater (figur 5), ble ingen åpenbare akkumulering av fluorescerende celler som finnes på karveggen etter vaskulær skade (figur 6A, online v ideo 5). Men sammen med dannelsen av det platerike tromber, RBCs begynte å samle seg i den trombe som illustrerer formen av koagel (figur 6A). Immunfluorescens farging av de skadede karotidarterien vist at de store celler festet til karveggen er blodplater (CD41 positive, grønt), mens Dil-merket RBCs er hovedsakelig befinner seg inne i blodpropper (figur 6B og C). Disse studiene viser atFeCl3-indusert trombose modell kan benyttes i å få innsikt mekanistisk på cellulære og molekylære komponenter og rom-tid-hendelser i trombedannelse.

Mesenteric Trombose Modell
For den mesenteriske trombose-modell, en høy konsentrasjon av FeCl3 - anbefales (10 12,5%) som skipene er vanligvis omgitt av fettvevet, noe som kan hindre den FeCl3 diffusjon mot beholderveggen og således hindrer fartøyet fra FeCl3 -indusert skade 7. Denne modellen er mer egnet for venøs trombose studien. Som vist i online video 6, ble trombe sett rundt ~ 15 sek i mesenteric vene etter topisk påføring av filterpapiret mettet med 12,5% FeCl3 løsning, men trombedannelse er dramatisk forsinket i mesenteric arterie. Den gjennomsnittlige tiden til okklusiv trombedannelse er ~ 17 ± 7,2 min (n = 11) i m esenteric vene og omtrent 23 ± 9,9 min (n = 10) i mesenterisk arterie da 12,5% FeCl3 brukes 7.

Figur 1
Figur 1. kirurgi. De minimale nødvendige verktøy for mus kirurgi vises. Se Materialer liste for mer detaljert informasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Mus Fiksering for kirurgi. Fest musen på 15 cm kultur parabolen lokk for halspulsåren trombose modell eller for injeksjon av rhodamine 6G fargestoff for mesenteric trombose modell.få = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Carotid arteietrombose modell. Prosedyrer for å avdekke halsvenen, injeksjon av rhodamine 6G fluorescerende fargestoff inn i blodsystemet og eksponering av venstre arteria carotis vises. I (A), indikerer den linje innsnitt fra manubrium til nivået av hyoid ben; i (B), blå piler indikerer kjertler under kjeven, og gule stiplede linjer representerer fascia mellom kjertler under kjeven; i (C), blå piler indikerer kjertler under kjeven, indikerer sort pil manubrium, og stiplet gul linje indikerer posisjonen til skjære å eksponere vena jugularis; i (D) angir blå pilen halsvenen; i (E), indikerer gul pil venstre submaxillary kjertelen, blå pil .indikatoreres venstre sternocleidomastoideus, indikerer stiplet gul linje konseptet, og grønn pil indikerer omohyoid muskel eller sternohyoid muskel; i (F) angir blå pilen A. carotis, de gule stiplede linjer viser den tynne sternohyoid muskel og / eller den omohyoid muskel; i (G), indikerer den blå pilen halspulsåren og grønn pil viser vagus nerve; i (H), viser den blå pilen halspulsåren og den grønne pilen indikerer plast "U-form" kaffe pumpe; og i (I), indikerer den blå pilen filterpapiret beliggende med FeCl3-oppløsning, og grønn pil indikerer halspulsåren. T indikerer luftrøret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Mesenteric arterie og vene tromboser modell. Eksponering av tarmens blodårer, samt FeCl3 behandling er vist. I (A), indikerer den blå pilen linea alba, den hvite fibrøse vev uten fartøyet; I (B), et snitt kuttet alene linea alba ble vist; i (C), de blå piler indikerer andre bue av tarmens arterier og vener; i (D), indikerer den blå pilen filterpapiret ligger med FeCl3 løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Representative eksperimenter ved bruk av Arteria carotis Thrombosis Model. (A). Trombedannelse i theC57Bl / 6 mus behandlet med 70,5% FeCl3. (B). Pa mediert trombolytisk effekt. (C). Injeksjon av antistoff rettet mot mus trombin reseptor PAR4 på trombose ble vist. (D). Tromben-webområdemålrettede nanovehicles spesifikt binder seg til aktivt å danne blodpropper ble vist . Inj. P indikerer injeksjon av partikler; og Peak B indikerer maksimal binding av partiklene til tromber. Alle bildene ble tatt under samme forstørrelse. Scale bar = 300 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. rolle RBC på Trombusdannelse. (A) trombocytopeni mus som fikk perfusjon av Dil-merket RBC ble utsatt for halspulsåren trombose modell og bilder etter at 7,5% FeCl ^ (B & C) De skadde carotis ble høstet, og frosne snitt ble forberedt. Blodplater ble farget med CD41 (grønn) og RBC ble vist som røde (Dil). Kjerner ble farget med DAPI. Fartøyer som er vist i (B og C) var fra to forskjellige mus. Skala barer = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

video 1
Video 1: Representant video av halspulsåren trombose modell i villtype (WT) mus. (Høyreklikk for å laste ned.) Denne videoen viser den representative trombedannelse i halspulsåren av WT mus indusert ved topisk påføring av filterpapiret liggermed 7,5% FeCl3-løsning. Blodplater ble merket ved intravenøs injeksjon av rhodamine 6G, og videoen ble tatt i svart-hvitt modus. Den hvite massen er klumpete blodplater.

video 2
Video 2: Vevsplasminogenaktivator (tPA) mediert trombolytisk effekt som detekteres av halspulsåren trombose modell. (Høyreklikk for å laste ned.) Blodplate merking og trombedannelse ble igangsatt som nevnt i video 1, og tPA ble injisert intravenøst ​​5 min etter 7,5% FeCl3 skade.

video 3
Video 3: platehemmende stoffet, na Mely anti-protease aktivert reseptor 4 (PAR4) antistoff, mediert anti-trombotisk effekt detekteres av halspulsåren trombose modell. (Høyreklikk for å laste ned.) I dette eksperimentet, mus fikk PAR4 antistoff og rhodamine 6G injeksjon 10 min før trombedannelse ble initiert av topically bruke filterpapiret ligger med 7,5% FeCl3.

video 4
Video 4: Nanopartikkel-mediert tromber spesifikk målretting. (Høyreklikk for å laste ned.) I dette forsøket ble halspulsåren trombedannelse innledet med 7,5% FeCl3 uten merking plate. Nanopartikkel ble merket med rhodamin B og intravenøst ​​injisert i mus 5 minutter etter skade.

Video 5 "src =" / files / ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg "/>
Video 5: Binding av de røde blodcellene som detekteres av halspulsåren trombose modell. (Høyreklikk for å laste ned.) Røde blodceller (RBC) ble merket med 1,1'-dioktadekyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perklorat (Dil, 10 mM endelig konsentrasjon), og 100 ul av den Dil-merket RBCs (35% hematokrit) ble injisert inn i mus med trombocytopeni. Ingen blodplate-merking ble utført i dette eksperimentet. Trombe ble initiert som nevnt ovenfor with7.5% FeCl3.

video 6
Video 6: Representant video av mesenteric arterie og vene trombose modell på WT mus. (Høyre-click for å laste ned.) Blodplater ble merket ved intravenøs injeksjon av rhodamine 6G, og trombe ble initiert lokalt etter påføring ett stykke filterpapir med 12,5% FeCl3 løsning i 1 min. Fartøyet ble observert under 10X tørr objektiv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det FeCl3-indusert modell er en av de mest brukte tromboser modeller, som ikke bare kan gi verdifull informasjon om genetiske modifikasjoner på blodplatefunksjon og trombose 7,8,16,19,31-33, men kan også være et verdifullt verktøy for evaluering av terapeutiske forbindelser og strategier for behandling og forebygging av sykdommer aterotrombotiske 11,17,34-37. Her har vi vist våre modifikasjoner og forbedringer av denne modell og viste ytterligere bevis på anvendeligheten av denne teknikken, som er tilstrekkelig følsom for å bestemme effektene av antikoagulant (tPA) og anti-blodplate midler (PAR4 antistoff). I tillegg til den mekanistiske studiet av trombose, kan modellen også benyttes for å studere nanoteknologi basert, tromber-målrettet levering av legemidler. Den kan også anvendes for påvisning av beholderveggen reaktive oksygenarter (ROS) formasjon ved injeksjon av fluorescerende ROS-indikator 21.

nitidteknikker er nødvendige for å utføre disse modellene. Operatøren skal ha tilstrekkelige kirurgiske ferdigheter samt en dyp forståelse av vaskulær og blodcellebiologi. Flere viktige punkter av FeCl3 induserte halsarterien trombose modell er 6: (1) utsettes for tilstrekkelig lengde av halspulsåren (~ 5 mm) for å tillate anvendelse av filterpapir og gitt noen plass til å observere blodstrømmen i henhold til intravital mikroskopi ved senfase ; (2) klart strippe adventitia myke vevet rundt halspulsåren for å tillate filterpapiret for å ta kontakt med karveggen direkte og fremstille en enda skade; (3) bekrefter ingen mekanisk skade på karveggen og ikke trombedannelse før påføring av FeCl3-mettet filtrerpapir; (4) danner grunnlaget for karotidarterien med et stykke av "U" -formet svart plast for å separere arterien fra omgivende vev, for å blokkere bakgrunnsfluorescens, og for å forhindre FeCl3 diffusjon. Av disse strategiene, har vi generert høytreproduserbare data med villtype C57Bl / 6-mus, og i denne musestamme 7,5% FeCl3 indusert trombose tid er 11,3 ± 3,16 min (n = 14) 6,7,19. Halsvenen injeksjon av rhodamine 6G å merke sirkulerende celler kan være utfordrende. Som et alternativ, kan en halevene-injeksjon blir utført før musen på 15 cm plate lokk. I sammenligning til carotisar modellen, er det mesenteriske arterie og vene modell enklere og mindre kirurgisk intensiv. Imidlertid, som nevnt i resultat-seksjonen, på grunn av dekningen av fartøyene ved fettvev, er den mesenteriske trombose modell for å studere bedre venøs trombose, men krever et større utvalg for å minimalisere feilen mellom forskjellige mus.

Begrensningen av denne modellen er at mekanismen er ikke klart, og fortsatt kontroversielt. Til å begynne med ble mekanismen for denne modellen antas å være av FeCl3 som genereres ROS indusert denudasjon av endotelceller, og subsequently førte til utsettelse av blodkomponenter til prothrombotic subendotel, å gjengi platelet vedheft, aggregering og trombedannelse 6,11. Ved rekonstituering av blodplater forbehandlet med GPVI antistoff til trombocytopene mus, har vi vist at FeCl3-modellen er avhengig av blodplate GPVI, og blokkering av blodplater GPVI kraftig hemmet FeCl3 induserte tromboser formasjon 19. Dette funnet er i tråd med tidligere rapporter 38 og foreslår at FeCl3 modellen kan være mer sannsynlig å etterligne patofysiologien av menneskelig aterosklerotisk plakk ruptur mediert trombose 6. Imidlertid har flere nyere studier foreslått nye mekanismer, inkludert adhesjonen av røde blodlegemer til karveggen, samt fysiokjemiske virkning av FeCl3 indusert aggregasjon av plasmaproteiner og blodlegemer 29,30. Disse ny innsikt antyder de mulige mekanismer for denne modellen kan være mer kompleks.

Ved perfusjon av Dil-merket RBCs inn i trombocytopeni mus og deretter indusere FeCl3 -triggered skader på halspulsåren med 7,5% FeCl3, fant vi at de store cellene fester seg til den skadde fartøy vegger er blodplater (Figur 6 og online video 5 ). Vi fant ikke opplagt RBC heft, og akkumulering av RBC i tromber virket mest sannsynlig til å være et resultat av fangst. Våre funn samsvarer med begrepene primær og sekundær hemostase 39. Forskjellen på vår observasjon fra tidligere rapporter kan være fra hypoksi og hemodynamisk endring som i studien ved Barr og kolleger 30, hvor FeCl3 skadde carotis for scanning elektronmikroskopi undersøkelse ble utarbeidet i mus som hadde venstre ventrikkel tidligere eksponert uten hjelp av en mekanisk lufting. Blod oksygenkonsentrasjon og hemodynamikk vil bli dramatisk redusert som både lunge oghjertefunksjonen vil bli påvirket umiddelbart etter Brystet åpnes uten mekanisk ventilasjon. Oksygenmangel har lenge vært assosiert med aktivering av prokoagulant reaksjonsveien og trombose 40, og også kan øke RBC adhesjon. En annen nylig publikasjon har vist at behandling av arteria carotis med en meget høy konsentrasjon av FeCl3 (20%) i 5 eller 10 min fører til en steady-state-konsentrasjon av FeCl3 ved ~ 50 mM i lumen av de skadde kar 29 . De således direkte tilført 50 mM FeCl3 inn i forskjellige blodkomponenter og undersøkt effekten av FeCl3 på aggregasjon ex vivo, noe som førte dem til å foreslå en ny, to-fase mekanisme for virkningen av FeCl3 i trombedannelse 29. Selv ganske interessant, resultatene fra denne studien må tolkes med forsiktighet, da det ikke representerer FeCl3 modellen brukte. I motsetning til den høye konsentrasjonen av FECl 3 (20%, 1 M som angitt i papir) og lang behandling (5 eller 10 min), våre tidligere studier samt Barr et al. har vist at 10% FeCl3 behandling i 1 minutt er tilstrekkelig til å indusere hurtig okklusiv trombedannelse i halspulsåren i løpet av 7 min 6,30. I tillegg, i de fleste av forsøkene ved hjelp av FeCl3-modellen, et ytterligere lav konsentrasjon av FeCl3 (5 - 7,5%) anvendes.

En annen begrensning ved denne modell er at på grunn av alvorlig oksidativ skade på endotelet, så vel som avdekning av endothelceller etter FeCl3 behandling, kan denne modellen være ikke et passende verktøy for å studere endotelial betennelse assosiert trombose. Men ved å bruke disse teknikkene for å fremstille halspulsåren i kombinasjon med perfusjon av fluorescerende merkede leukocytter, kan vi teste adhesjon og rulling av leukocytter i inflammatoriske endotelet 41.

i summary, vi har utviklet og standardisert FeCl3-indusert vaskulær skade-modell for å fremstille en meget reproduserbar skade på halspulsåren og kvantifisere blodstrømmen opphører tid nøyaktig ved intravital mikroskopi. Denne modellen er tilstrekkelig følsom og for å teste den antikoagulerende og antiblodplatemidler, og er også egnet for studier av tromber målrettet nanomedisin. I kombinasjon med benmargstransplantasjon, blodplate infusjon inn i trombocytopene mus eller direkte intravaskulær injeksjon av kandidat medikamenter, har man vist at dette er en praktisk, enkel og sensitiv verktøy for å studere trombose in vivo 7-10,16,19,42,43 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

Tags

Medisin Thrombosis halspulsåre mesenterisk arterie / vene ferriklorid nanopartikkel formidlet medisintilførsel trombolyse trombe mekanisme intra mikroskop
Jernklorid-indusert Murine Trombose Modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A.… More

Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter