Snelle en specifieke beoordeling van de halogenerend Peroxidase activiteit in leukocyten verrijkte bloedmonsters

Summary

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Abstract

In dit artikel een protocol voor de snelle en gestandaardiseerde verrijking van leukocyten uit kleine hele bloedmonsters wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op de hypotonische lysis van erytrocyten en kan worden toegepast op menselijke monsters en bloed van niet-menselijke oorsprong. De aanvankelijke kleine monstervolume van ongeveer 50 tot 100 gl maakt deze methode van toepassing op periodieke bloedmonsters van kleine proefdieren. Bovendien is leukocyten verrijking bereikt binnen enkele minuten en met een laag materiaal inspanningen ten aanzien van chemische stoffen en instrumentatie, het maken van deze methode niet van toepassing in meerdere laboratorium omgevingen.

Gestandaardiseerde zuivering van leukocyten wordt gecombineerd met een zeer selectieve kleuring methode halogeneringsmiddel peroxidase activiteit van het heem peroxidasen evalueren, myeloperoxidase (MPO) en eosinofiel peroxidase (EPO), dat wil zeggen de vorming van hypochloorzuur en onderbromig zuur (HOCl en HOBr). Terwijl MPO is sterk uitgedrukt in neutrophils, het meest voorkomende celtype immuunsysteem in menselijk bloed als in monocyten, de bijbehorende enzym EPO uitsluitend tot expressie gebracht in eosinofielen. Halogeneringsmiddel activiteit van deze enzymen wordt behandeld met het bijna HOCl- en HOBr specifieke kleurstof aminofenyl fluoresceïne (APF) en de primaire peroxidase substraat waterstofperoxide. Bij daaropvolgende flowcytometrieanalyse alle peroxidase-positieve cellen (neutrofielen, monocyten, eosinofielen) zijn onderscheiden en hun halogenerend peroxidase activiteit kan worden gekwantificeerd. Aangezien APF kleuring kan worden gecombineerd met de toepassing van celoppervlak markers, kan dit protocol worden uitgebreid om meer bepaald leukocyt subfracties. De methode is toepasbaar op te sporen HOCl en HOBr productie zowel in de mens en in knaagdieren leukocyten.

Gezien het wijd en divers besproken immunologische rol van deze enzymatische produkten chronische ontstekingsziekten kan dit protocol bijdragen aan een beter begrip van deimmunologische relevantie van leukocyt afgeleide heem peroxidasen.

Introduction

Polymorfonucleaire leukocyten (PMN's, ook wel granulocyten) en monocyten vormen belangrijke cellulaire componenten van het aangeboren immuunsysteem in het bloed ^1,2. Zij bijdragen aan de primaire afweer tegen ziekteverwekkers alsook de activering van het verworven immuunsysteem en het initiëren van een systemische ontstekingsreactie ^2-4. Maar vooral neutrofielen, de meest voorkomende vorm van granulocyten en monocyten ook aanzienlijk bijdragen tot de regulering en de beëindiging van acute ontstekingen gebeurtenissen ^5. Daarom zijn deze cellen kunnen ook een belangrijke rol bij chronische ontstekingsziekten zoals reumatoïde artriti....

Protocol

Alle menselijke bloedmonsters werden verkregen van gezonde vrijwilligers, en de toegepaste leukocyten verrijking protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie van de Medische Faculteit van de Universiteit van Leipzig. De experimenten met ratten bloed werden goedgekeurd door de bevoegde lokale ethische commissie (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), volgens de Duitse richtlijnen voor de verzorging van dieren en het gebruik.

1. Experimentele Setup

OPMERKING: de hypotone lysis procedure voor de uitputting van erytrocyten uit de bloedmonsters een tijdkritische procedure bereiden alle benodigde apparatuur ....

Results

Zoals eerder gemeld de bovenbeschreven werkwijze bleek toepassing zowel menselijke en niet-menselijke materiaal ^32. Bovendien zoals getoond voor muizen met astmatische symptomen kunnen de APF kleuring een geschikt instrument om verschillen in de systemische pro-inflammatoire toestand detecteren. Daarom wordt in een volgende studie we dit protocol dat wordt gebruikt om herhaaldelijk te evalueren de halogenerend activiteit van MPO (en EPO) in vrouwelijke Dark Agouti rat.......

Discussion

Als neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in menselijk bloed de isolatie van peroxidase-positieve cellen vaak alleen gericht op deze cellen en omvat een scheiding van neutrofielen uit andere leukocyten door dichtheidsgradiënt centrifugatie ^38. Nog neutrofielen veel minder overvloedig in muizen ³⁹ bloedmonsters voor deze ingewikkelder methoden worden gebruikt ^40. Bovendien beide methoden leiden tot de verwijdering van peroxidase-positieve monocyten uit de monsters en vanwege d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes	VWR/Corning	734-0451	-
1.5 ml sample tubes	VWR/Eppendorf	211-2130DE	-
Pipettes for volumes up to 5 ml	Eppendorf	e.g., 3120000070	We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench	Thermo Electron Corperation	HeraSafe	-
Vortex mixer	Bender & Hobein AG	Vortex Genie 2	-
Tabletop centrifuge	Kendro Laboratory Products	Laborfuge 400R	The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge	Eppendorf	5415D	The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator	Heraeus	cytoperm 2	Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer	Varian	Cary 50 bio	A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer	Becton, Dickinson	BD Facs Calibur	Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS)	amresco	K812	sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+	Sigma-Aldrich	H1387	970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid	Merck Millipore	1.09057.1000	1 M solution
Sodium hydroxide	Riedel-deHaën	30620	Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein	Cayman	10157	5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH)	Sigma-Aldrich	A41909	A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO	VWR chemicals	23500.26	-