Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ploïdie Manipulatie van zebravis embryo's met Heat Shock 2 Treatment

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54492

⸱

16 december 2016

 ,  ,  , 
1Laboratory of Genetics, University of Wisconsin, 2Department of Neurobiology, University of Massachusetts Medical School, 3Interdisciplinary Biomedical Graduate Program, University of Pittsburgh School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een gewijzigde protocol voor ploïdie manipulatie maakt gebruik van een heat shock naar een één-cyclus kraam in cytokinese induceren in de vroege embryo. Dit protocol wordt gedemonstreerd in de zebravis, maar kan voor andere soorten.

Samenvatting

Manipulatie van ploïdie zorgt voor nuttige transformaties, zoals diploïde te tetraploïden of haploïden te diploïde. In de zebravis Danio rerio bijzonder de productie van homozygote gynogenetic diploïde nuttig in genetische analyse omdat het de directe productie van homozygoten van een heterozygote moeder. Dit artikel beschrijft een gemodificeerd protocol voor ploïdie duplicatie op basis van warmte puls tijdens de eerste celcyclus, Heat Shock 2 (HS2). Door remming van centriole duplicatie deze werkwijze resulteert in een precieze celdeling stall tijdens de tweede celcyclus. De precieze één cyclus divisie stal, gekoppeld aan onaangetast DNA duplicatie, resulteert in een hele genoom duplicatie. Protocollen in verband met deze methode zijn ei en sperma inzameling, UV-behandeling van sperma, in vitro fertilisatie en warmte puls naar een one-celcyclus divisie vertraging en ploïdie duplicatie veroorzaken. Een aangepaste versie van dit protocol kunnen worden toegepastom ploïdie veranderingen in andere diersoorten induceren.

Inleiding

Dit protocol maakt de manipulatie van ploïdie in zebravisembryo's, bijvoorbeeld bij het genereren van homozygote diploïde gynogenetic van gynogenetic haploïden (figuur 1) of de productie van tetraploïden. Dit wordt bereikt door het induceren van een vertraging in cytokinese overeenkomt met precies een celcyclus (Figuur 2A, 2B). De sleutel van één cyclus vertraging cytokinese wordt bereikt door behandeling met hitteschok. Het standaardprotocol van hitteschok (HS) zoals oorspronkelijk beschreven door Streisinger en collega betrokken temperatuur puls gedurende de periode 13-15 MPF, resulterend in één cyclus celdeling stall tijdens de eerste celcyclus 1. De efficiëntie van dit protocol is onlangs verbeterd door het scannen van de eerste celdelingen met een glijdende vensterfuncties van hitteshockbehandeling. Deze scan identificeerde een later tijdstip voor een warmteschok, nog binnen de eerste celcyclus (22-24 MPF), wat resulteert in een hoger embryos met één cyclus celdeling box, die in dit geval beïnvloedt de tweede celcyclus 2. De waarneming dat experimentele manipulaties in de eerste celcyclus verstoren celdeling tijdens de tweede celcyclus en leiden tot DNA-inhoud duplicatie is eveneens beschreven in andere vissoorten 3,4. We noemen dit gemodificeerde protocol Heat Shock 2 (HS2 - de term "2" geeft de warmte puls plaats op een later tijdstip dan de standaard HS methode, en dat de celcyclus vertraging veroorzaakt door HS2 optreedt in de tweede celcyclus ). Deze studies toonden aan dat de basis voor cytokinese arrestatie na hitteschok de remming van centriole overlapping tijdens de hitte puls, welke spil vorming en groef inductie in de volgende celcyclus beïnvloedt. HS2 resultaten in opbrengsten van de celcyclus bijna 100%, en de tarieven van ploïdie duplicatie tot 4 keer hoger dan standaard HS 2.

Embryo's behandeld witha heat shock tijdens blastomere celdeling vertonen veel schadelijke effecten, wat erop wijst dat heat shock invloed op meerdere processen die nodig zijn voor de celdeling 2. Anderzijds, indien de heat shock voorafgaand aan de initiatie van celdeling (tijdsperiode 0-30 MPF) wordt toegepast, blijkt het effect consistent met specifieke interferentie met centriole overlapping hebben en lijkt geen andere essentiële cellulaire processen beïnvloeden 2 . Deze studies toonden aan dat de tijd voorafgaand aan de inleiding van blastomere divisie lijkt een ontwikkelingsperiode vatbaar is voor het gebruik van Heat Shock als een instrument om specifiek te manipuleren door middel van ploïdie centriole remming zijn. De onderliggende oorzaak van de schijnbare selectiviteit voor warmteschok op centriole duplicatie is niet bekend, maar kan verband houden met een selectieve afbraak van centrosoom substructuren waargenomen onder hittestress in bepaalde celtypen, zoals leukocyten 5.

Tijdelijke synchronisatie van de embryonalekeling wordt bereikt door in vitro fertilisatie (IVF). Het gebruik van onbehandelde sperma tijdens de bevruchting resulteert in diploïde embryo's dat bij HS2-geïnduceerde één cyclus cytokinese kraam tetraploïde geworden. Het gebruik van UV-behandelde sperma, die verknopingen dat zijn DNA inactiveren, leidt gynogenetic haploïde embryo 6, dat bij HSII geïnduceerde één cyclus cytokinese stall worden gynogenetic diploïde 2 draagt. Door het resulterende gehele genoom duplicatie deze gynogenetic diploïden homozygoot bij elke locus in het genoom. Beknoptheid wordt verwezen naar haploïde embryo gynogenetic als "haploïden" en homozygote gynogenetic diploïde embryo's "homozygote diploïde". Als levensvatbaar en vruchtbaar, kunnen homozygote diploïde worden gebruikt om steriele en dodelijke-vrije lijnen te starten. Direct homozygosity geïnduceerd door HS2 moet ook gemakkelijk worden opgenomen in genetische analyse of genetische screens, omdat homozygote diploïde zijn van koeien die heterozygote dragers van mut zijnaties vertonen tarieven van homozygotie bij hoge en vaste (50%) verhoudingen 2.

Het volgende protocol beschrijft de stappen om HS2 presteren en induceren ploïdie overlapping met de volledige homozygosity. Voor tetraploïde productie moet sperma oplossing onbehandeld zijn. Voor homozygote diploïde productie moet sperma worden geïnactiveerd door UV-behandeling. Bovendien, zoals beschreven in de discussie, zichtbaar pigment markers kunnen ook worden gebruikt om identificatie van homozygote diploïde vergemakkelijken. Zebravis mate in de eerste plaats tijdens de eerste 3 uur na de opening van hun licht cyclus 7, en zowel volwassenen en eieren zijn gevoelig voor circadiaanse ritmes 8, dus voor het beste resultaat van de IVF-procedure moet plaatsvinden binnen deze periode.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd volgens de Universiteit van Wisconsin - Madison en Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen (University of Wisconsin - Madison Assurance nummer A3368-01).

1. Keuze Vrouwtjes Egg Collection via Onderbroken Mating

LET OP:-IVF gebaseerde protocollen rekenen op de extrusie van rijpe eicellen van koeien door middel van handmatige druk 9. Eerdere protocollen vrouwtjes rechtstreeks gebruik van tanks of in combinatie paringen zonder vrouwtjes ondergaan ei afgiftegedrag, maar slechts een klein deel van deze vrouwen (ongeveer 20% of minder, afhankelijk van de zebravis lijn) werd verkregen geëxtrudeerde en competente eieren op manuele druk. In een verbeterde procedure, vrouwtjes zijn pre-gesorteerd voor het leggen van eieren door directe visuele waarneming, gevolgd door onmiddellijke onderbreking van de paring. Deze procedure is zeer effectief, aangezien bijna alle vrouwelijke voorgeselecteerd door deze onderbroken paring stap opbrengst geëxtrudeerd en competente eierenop manuele druk.

  1. De middag voor het experiment, het opzetten van paren paren van de gewenste zebravis stam in standaard zebravis paring dozen. Houd mannen in dezelfde kamer als vrouwtjes nog fysiek gescheiden van hen, hetzij door middel van een paring doos afdeling of door het plaatsen van de man onder een eierleggende insert en het vrouwtje in de insert.
  2. De ochtend van het experiment, verwijder de fysieke partitie, het plaatsen van zowel de mannelijke en vrouwelijke binnen dezelfde eierleggende insert, zodat paring begint.
  3. Inspecteer visueel tanks met paring paren aan de extrusie van de eieren op te sporen tijdens de natuurlijke dekking. Bij de eerste tekenen van ei profielen, gescheiden mannen en vrouwen om de fokkerij te onderbreken. Na de scheiding van mannen, houdt de vooraf geselecteerde vrouwen afzonderlijk of samengevoegd in dezelfde tank. Met meerdere vrouwen afhankelijk van het gewenste aantal (typisch 50-150 eieren / vrouw) embryo.

2. Het voorbereiden van een Sperm Solution

LET OP: IVF relies over de blootstelling van rijpe eicellen van een sperma-oplossing. Deze oplossing kan onbehandeld zijn, diploïde zygoten genereren (dat bij HS2 behandeling worden tetraploïde embryo) of UV-behandelde, op haploïde zygoten (HS2 die na behandeling worden homozygote diploïde embryo's) te genereren. Previous sperma preparaat protocollen suggestie voor het gebruik van capillaire buizen milt verzamelen van de anale regio levende mannetjes, maar dit was niet effectief Werkwijze slechts een klein deel van de mannen gaf hom 9. Het protocol hieronder vertrouwt in plaats daarvan op het sperma voorbereiding van geschoren ontleed testes, die meer betrouwbare resultaten oplevert.

  1. Bereid Hank's oplossing vroegtijdig als premix Hank's oplossing, omvattende alle componenten (oplossingen 1, 2, 4 en 5), behalve de natriumbicarbonaatoplossing (Oplossing 6). Bereid Oplossing 6 vers en toevoegen voormengsel de ochtend van het experiment (tabel 1). Om Hanks 'oplossing (uiteindelijke oplossing te maken, de voorbereiding van de ochtend van deIVF-procedure), combineer 990 ul van Hank's Premix en 10 ul van de vers bereide Oplossing 6.
  2. Euthanaseren mannetjes door overmatige blootstelling aan tricaïne als een 0,016% oplossing in geconditioneerd water.
    1. Bereid tricaïne als 0,2% voorraadoplossing in water (bufferen tot pH 7,0 met 1 M Tris pH 9,0) en bewaar bij 4 ° C. Voeg 8 ml tricaïne voorraad oplossing per 100 ml water in een beker, en gebruik een net om de mannetjes te dragen aan de tricaïne oplossing.
    2. Gebruik het equivalent van testes één mannelijke per koppeling moest worden bevrucht in een volume van Hank's oplossing overeenkomend met 100 gl per mannelijke (bijv testes van 10 mannen verzameld in 1 ml Hank's oplossing, 10 koppelingen bemesten met 100 gl / koppeling).
    3. Bevestig euthanasie door het stilleggen van de kieuw bewegingen gedurende 15 minuten. Na euthanasie, verwijder de mannetjes uit de beker met een lepel. Spoel de mannetjes kort met geconditioneerde water en droog ze lichtjes door ze kort op diverse locaties van eenkeukenpapier.
  3. Om de testikels, eerste Onthoofd gedood mannetjes met behulp van het ontleden van een schaar of een scheermesje te verwijderen, en maak een longitudinale snede langs de buik met het ontleden scissors.Under een dissectie microscoop met een gereflecteerd licht bron, verwijder de inwendige organen met ontleden tang. Trek elk van de testes massa's met een tang en plaats ze in de microcentrifugebuis met Hank's oplossing.
    OPMERKING: Testes kan worden geïdentificeerd als elk van twee langwerpige structuren doorschijnende uiterlijk vinden naast het lichaam wanden die convergeren en nabij de cloaca. Testes kan blijven 2-3 min op een petri plaat oppervlak na dissectie en voordat u ze in de oplossing van de Hank's.
  4. Laat de sperma in de oplossing door knippen de testes met een smalle spatel en / of voorzichtig en neer te pipetteren 5-6 keer de testes in oplossing met 1000 ul-tip micropipet, met vermijding luchtbelvorming. Laat de testes puin af te wikkelen.
  5. Bewaar de oplossing in ijs sperma, waar het zijn vermogen tot 2-3 uur kunnen houden. Als wordt overgegaan tot UV-behandeling van sperma oplossing en spoel de inhoud in een schone microcentrifugebuis waardoor de stukken testes achteren.

3. UV-behandeling

OPMERKING: UV behandeling wordt gebruikt om sperma DNA verknopen om het inactief in het embryo maken. Deze stap wordt alleen gebruikt bij de productie van gynogenetic haploïde of homozygote diploïde gynogenetic embryo's. Sperma oplossing UV behandeling moet worden gescheiden van stukjes testes (stap 2,4), als grote stukken kunnen zaadcellen te beschermen tegen de UV-behandeling.

  1. Breng de sperma oplossing voor een schone, droge put van een depressie glazen plaat zittend op een ijs bed (bijvoorbeeld ijs in een petrischaal). Gebruik maximaal 1 ml van het sperma oplossing per glasplaat goed.
  2. Expose het sperma oplossing voor UV door het plaatsen van de depressie glazen plaat op het ijs bed onder een UV-lamp. Behandel het sperma oplossing voor 90 sec met een 115 V (60 Hz, 0.68A) UV-lamp op een 19 cm (7,5 inch) afstand. Met het einde van een pipet tip voorzichtig de oplossing elke 30 seconden gedurende UV-behandeling (een schone pipetpunt elke 30 sec) mix.
  3. Met behulp van een schone pipet tip en micropipet, de overdracht van de behandelde sperma oplossing voor een nieuwe microcentrifugebuis. Bewaar op ijs totdat het nodig is voor IVF (niet langer dan 2-3 uur van extractie).

4. Manual Extrusie van rijpe eicellen

LET OP: De wijfjes verkregen door onderbreking van de natuurlijke paringen zal gemakkelijk eieren opleveren onder verdoving en manuele druk. Tijdens deze procedure moet tricaïne behandeling zorgvuldig gecontroleerd worden om overbelichting dat het herstel van de vrouwtjes kunnen voorkomen dat te voorkomen.

  1. Verdoven vrouwtjes door blootstelling aan licht te tricaïne oplossing: overdracht vrouwen met een net om de oplossing in geconditioneerd water tricaïne (gemaakt door het toevoegen van 8 ml tricaïne 0,2% stamoplossing tot 100 ml van geconditioneerd vis water) voor ongeveer 2-5 minuten, tot de vis stop kieuw beweging.
  2. Zodra een vrouw stopt kieuw beweging, gebruik een lepel om het op te halen en even uitspoelen in geconditioneerd water. Met hetzelfde lepel om de vis te bewegen, droog het licht door deze herhaaldelijk kort op verschillende locaties van een papieren handdoek en breng deze over naar een schone, droge 10 cm diameter petrischaal. Benader de vis met de lepel in de voorste naar achterste richting, om te voorkomen dat potentieel schadelijke de kieuw operculum.
  3. Gebruik lab doekjes of zacht weefsel om de anale vin gebied voorzichtig verder te drogen, om eventuele vrijgelaten eieren voorkomen voortijdig wordt geactiveerd door water. Demping van de vingers lichtjes met water (om te voorkomen dat ze vasthouden aan vis schubben), plaatst u een vinger van één hand op de rug van het vrouwtje als ondersteuning, en met een vinger van de andere kant van toepassing lichte druk langs de buik van het vrouwtje tot de eieren geëxtrudeerd worden.
  4. Gebruik een smalle spatel om de eieren af ​​te stappen van het lichaam van het vrouwtje. Plaats de vrouwelijke terug in een tank met geconditioneerde water voor herstel.
    Opmerking: wanneer eieren worden geëxtrudeerd terwijl het vrouwtje ligt aan één kant van haar lichaam, kunnen ze worden omgedraaid en de procedure herhaald met haar andere zijde om extra eieren te verkrijgen. De volledige dekking van de vrouwelijke verzekeren, alleen van toepassing zijn zachte manuele druk op de buik, en het uitvoeren van de procedure vanaf kieuw beweging stop te keren naar water in minder dan 2 minuten.
  5. Activeren (met blootstelling aan water) en bemesten (met sperma oplossing toevoeging) eieren gelijktijdig en binnen 90 seconden na de extrusie (zie paragraaf 5).

5. In Vitro Fertilisatie

LET OP: zebravis bemesting in natuurlijke kruisingen extern is, afhankelijk van de gelijktijdige release en activering door water van de eieren en sperma tijdens het paren. In vitro fertilisatie bootst dit proces de eieren bloot te stellen aan sperma oplossing in de aanwezigheid van water. waterdruk oorspronkelijk klein (1 ml) om de effectieve spermaconcentratie verhogen. Binding door sperma plaatsvindt binnen 15-20 sec 10 </ Sup> en watervolume kan dan worden verhoogd. Chorion het opheffen verder bij aan de nauwe synchronisatie van de koppeling bij het raam te beperken voor de bevoegdheid voor het sperma binden 11,12. De resulterende embryo's vertonen derhalve grotendeels gelijktijdige celdeelcycli tijdens de vroege stadia splitsing.

  1. Voeg 100 ul sperma oplossing (equivalents van testes van de ene male - zie deel 2) de koppeling van geëxtrudeerd eieren op een petrischaal. Zwenk de pipetpunt gebruikt om het sperma oplossing van de eieren toevoegen sperma en eieren door elkaar, waarbij u de tip niet opheffen van het oppervlak van de petrischaal van eieren te voorkomen.
  2. Activeer onmiddellijk de eieren door toevoeging van 1 ml embryonale medium (E3) -oplossing (geconditioneerd water is ook aanvaardbaar als een substituut voor E3 in deel 5 tot 7) en opnieuw zachtjes mengen eieren en sperma door voorzichtig schudden met de pipetpunt. Start een timer om timing ten opzichte van de bevruchting te starten.
  3. Op 1 MPF in het volume 1 ml, overspoelen de plaat met E3. Alvorens verder te gaan, laat staan ​​totdat 10-12 mpf ei activering, met inbegrip van volledige chorion expansie mogelijk te maken.

6. Heat Shock Treatment

OPMERKING: Een heat shock toegepast in het vroege embryo remt centriole overlapping resulteert in een incomplete complement van centrioles spindel formatie rijden tijdens de daaropvolgende celcyclus 2. Aangezien spil op zijn beurt resulteert in het ontbreken van groef 13 vormen.

  1. Na de uitbreiding van het chorions (10-12 MPF), giet de embryo's uit de petrischaal in een theezeefje. Spoel de petrischaal met een wasfles met E3 om resterende embryo's in de theezeef verzamelen.
  2. Plaats de theezeef het embryo in een bekerglas in een voorverwarmd bad met E3 bij 28,5 ° C. Pre-evenwicht van de beker en de E3 om het waterbad temperatuur, en zorg ervoor dat er genoeg E3 zodat alle embryo's in de theezeef wordt blootgesteld aan het medium.
  3. Op 22 mpf, verwijder de theezeefje uit de 28,5 ° C waterbad, kort dep het op een papieren handdoek om overtollig vocht te verwijderen, en plaats deze in een vergelijkbaar voorverwarmd E3 beker in een warmte-bad bij 41,4 ° C.
  4. Op 24 mpf, de overdracht van de theezeefje terug naar de E3 in het waterbad bij 28,5 ° C na een korte blotting. Op 29 mpf, gebruik dan een spuitfles met E3 om de embryo's te dragen van de theezeefje een 10 cm Petri plaat.

7. Selectie voor embryo's met een One-cyclus Cytokinese Stall

  1. Gedurende de periode 35-45 mpf, onder een dissectie microscoop met een verzonden lichtbron, selecteert u die embryo's die symmetrisch splitsing ondergaan in de 2-cel stadium, en die worden dan ook bevrucht. Verwijder embryo's die niet cel splitsing ondergaan.
  2. Verder observeren van de bevruchte embryo's geselecteerd voor normale celdeling tijdens de eerste celcyclus en in de second celcyclus (50-65 MPF).
  3. Sorteer embryo volgens de volgende categorieën (Figuur 2C): 4 cellen ( "geen stall", in het 2: 2 arrangement standaard voor een 4-cel embryo); 3 cellen ( "gedeeltelijke stal", in een afwijkende 2 kleinere cellen: 1 grote cel arrangement); en 2 cellen ( "geblokkeerd", embryo's vertonen in één celcyclus vertraging in een 1: 1 arrangement identiek aan die van een 2-cel embryo). Sorteer de vastgelopen embryo's in een frisse petrischaal.
    Opmerking: In deze fase, embryo's in de 2: 2 opstelling overeen met die waarbij tijdens de tweede celcyclus noch blastomere onderging een celdeling meststal embryo in een afwijkende 2 kleinere cellen: 1 grootcellig arrangement overeen met die waarbij hitteschok veroorzaakt een celcyclus stall tijdens de tweede celcyclus in een blastomeer maar niet de andere; en embryo "vastgelopen" in een 1: 1 arrangement overeenkomen met die waar in de tweede celcyclus zowel blastomeren onderging de gewenste celdelingkraam. Vastgelopen embryo's moet cel splitsing te hervatten tijdens de volgende celcyclus periode (65-80 MPF). De opstelling van blastomeren kan variabel zijn, vanwege de onvolledige wachten van de vorige celcyclus de spindel 2,14 te stabiliseren, maar de meeste embryo's een relatief normaal blastula die normale ontwikkeling kunnen ondergaan vormen.
  4. Laat embryo's te ontwikkelen in de Petri plaat, met een limiet van 80 embryo's per 10 cm plaat. Bij 24 HPF, acht de embryo's te bepalen of zij een normale morfologie kenmerk van diploïde of homozygote diploïde embryo 6 (normale omvang van as verlenging (Figuur 3A, 3C)), in tegenstelling tot minder as uitbreiding en verhoogde lichaamstemperatuur dikte kenmerkend haploïden (Figuur 3B)), en / of diploidization bepalen met behulp van genetische merkers pigment bij 36 MPF, zoals goud of albino en andere dergelijke tests (figuur 3 en zie hierna) 2,6,9.
  5. Verwijder alle embryo's die verschijnen om een ​​haploïde morfologie hebben, of die zijn gelyseerd of vertonen andere grove abnormale afwijkingen.
    OPMERKING: Indien gewenst laat embryo ontwikkeling tot 5 dagen na de bevruchting, terwijl zij gelyseerd of verregaand abnormale embryo's dagelijks te verwijderen en het toevoegen van verse E3 aan het medium vernieuwen. LET OP: Het overleven van embryo's kunnen ook worden gekweekt na zwemblaas inflatie op dag 5 door de overdracht naar een broederij systeem en voederen onder normale omstandigheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Ondanks de één celcyclus cytokinese stal, DNA replicatie plaatsvindt normaliter in dergelijke embryo, wat resulteert in de verdubbeling van de DNA inhoud van de embryo (figuur 1). De Streisinger Heat Shock-protocol (standaard HS) betreft een warmte puls in de periode 13-15 minuten na de bevruchting (MPF) en induceert voornamelijk cytokinese arrestatie tijdens de eerste embryonale celdeling op 35 mpf 1,2, terwijl de afgeleide hier beschreven methode, aangeduid ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

kritische stappen

Het is essentieel om te werken voor daadwerkelijke in vitro fertilisatie. Om een ​​goed aanbod van rijpe eicellen (stap 1) te verzekeren, het opzetten van de vrouwtjes te paren mag niet zijn opgezet in paring kruizen gedurende minstens 5 dagen en moeten zwangere verschijnen. Tijdens de onderbreking van de fokkerij, kan een waarnemer adequaat toezicht 15-30 tanks voor de eerste verschijning van de natuurlijke ei extrusie. Onderbreking van de paring moet zo snel optreden mogelij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R21 HD068949-01 en RO1 GM065303.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Zebrafish mating boxesAqua SchwarzSpawningBox1
NaClSigmaS5886
KClSigmaP5405
Na2HPO4SigmaS3264
KH2PO4SigmaP9791
CaCl2SigmaC7902
MgSO4-7H2OSigma63138
NaHCO3SigmaS5761
TricaineWestern ChemicalTricaine-D (MS 222)FDA approved (ANADA 200-226)
Tris baseSigma77-86-1om 1 M Tris pH 9.0 te bereiden
HClSigma920-1om 1 M Tris pH 9.0 te bereiden
Visnet (fijn maas) (4-5 inch)PennPlax(ThatFishThatPlace # 212370)beschikbaar in ThatFishThatPlace
Kunststoflepelbeschikbaar in de meeste standaard winkels
Dissectie schaarFine Science Tools14091-09
Dissectie pincetDumontSSbeschikbaar bij Fine Science Tools
Dissectie stereoscoop (met doorgelaten lichtbron)NikonSMZ645of equivalent
Reflecterende lichtbron (LED-armen)FostecKL1600 LEDof equivalent
Petrischalen 10 cm diameterelke fabrikant
Eppendorf buisjes 1,5 mlelke fabrikant
IJsemmerelke fabrikant
Pipetteman P-1000elke fabrikant
Pipettipjes 1.000 µlelke fabrikant
Smal spatelFisher14-374
Depressie glasplaatCorning Inc722085 (Fisher cat. Nr 13-748B)beschikbaar bij Fisher Scientific
UV-lampUVPModel XX-15 (cat. Nr. UVP18006201)beschikbaar bij Fisher Scientific. Hoewel dit bij ons niet is waargenomen met dit model, is bij sommige UV-bronnen waargenomen dat de intensiteit na verloop van tijd afneemt (zie indien dit het geval is, Aanpassingen en probleemoplossing)
UV-brilelke fabrikant
Papieren handdoekenelke fabrikant
KimwipesKimberly-Clark06-666-11beschikbaar bij Fisher Scientific
Timer stopwatchelke fabrikant
WasflesThermo Scientific24020500beschikbaar bij Fisher Scientific
Theezeefbeschikbaar in keukenwinkels
Bekers, 250 ml (2)Corning Inc.1000250beschikbaar bij Fisher Scientific
Waterbad (2)elke fabrikant, met nauwkeurigheid tot 0,1 C (bijv. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ oplossing 1zie hierbovenzie hierboven8,0 g NaCl, 0,4 g KCl in 100 ml ddH2O. Bewaren bij 4°C.
Hanks’ oplossing 2zie hierbovenzie hierboven0,358 g Watervrij Na2HPO4, 0,6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Bewaren bij 4 °C.
Hanks’ oplossing 4zie hierbovenzie hierboven0,72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Bewaren bij 4 °C.
Hank's Premixzie hierbovenzie hierbovenvoeg toe, in de volgende volgorde: 10,0 ml oplossing 1;  1,0 ml oplossing 2;  1,0 ml oplossing 4;  86,0 ml ddH2O;  1,0 ml oplossing 5. Bewaren bij 4 °C
Hanks’ oplossing 6zie hierbovenzie hierboven0,33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Vers bereiden op de ochtend van de IVF-procedure.
Hank's oplossing (uiteindelijke oplossing)zie hierbovenzie hierbovenCombineer 990 μl van Hank’s Premix en 10 μl van vers bereide oplossing 6 (NaHCO3 oplossing)

Referenties

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
  2. Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
  3. Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
  4. Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
  5. Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
  6. Walker, C. The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. , Academic Press. 43-70 (1999).
  7. Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
  8. Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
  9. Pelegri, F., Schulte-Merker, S. The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. , Academic Press. 1-20 (1999).
  10. Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
  11. Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
  12. Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
  13. Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
  14. Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
  15. Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
  16. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
  17. Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
  18. Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
  19. Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
  20. Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
  21. Pelegri, F., Mullins, M. Met. Cell Biol. Vol. 104. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. , 83-120 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

DiploidiseringRemming van de CytokineseUV-behandeling van SpermaIn Vitro FertilisatieEmbryosorteringGenetische PigmentmarkersHomozygote Diploiden
Ploïdie Manipulatie van zebravis embryo's met Heat Shock 2 Treatment
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.