Une blessure à la tête modèle Répétitive commotionnant chez la souris

Introduction

Commotion, également appelée légère lésion cérébrale traumatique (TCCL), est le cas le plus fréquent de lésion cérébrale traumatique (TBI) et affecte des millions de personnes dans les États-Unis. Commotions peut être difficile à diagnostiquer et il n'y a pas de remède spécifique pour une commotion cérébrale. Il y a une reconnaissance croissante et une preuve que le traumatisme mécanique légère résultant de blessures sportives, le combat militaire, et d' autres activités physiques d' engagement peut avoir des conséquences neurologiques cumulatifs et chroniques ^1,2. Cependant, il y a encore un manque de connaissances sur les commotions cérébrales et leurs effets. méthodologie actuelle limite les études de pathologie et le traitement chez l'homme car seule l'évaluation neurologique et l'évaluation de l'imagerie sont disponibles pour le diagnostic clinique. Les modèles animaux fournissent un moyen d'étudier les commotions cérébrales d'une manière efficace, rigoureuse et contrôlée avec l'espoir de diagnostic et de traitement du TCCL.

Des études ont adapté TBI traditionnellemodèles tels que l'impact corticale contrôlé (CCI), l'impact percussion de fluide (FPI), blessure à la chute de poids, et les blessures de souffle pour effectuer TCCL et stimulent les sévérités de blessures faibles en changeant les paramètres de blessures. Ces modèles sont avantageux d'utiliser en raison de leur capacité à reproduire un traumatisme cérébral morphologiquement semblables à ceux de l'état clinique; Cependant, ils ont aussi leurs propres limites. La gravité de la lésion induite par une blessure d'accélération (poids chute) est souvent très variable. Les deux résultats de la CCI légère - hémorragie méningée et contusion focale - ne sont pas comparables avec les commotions cérébrales humaines typiques. CCI et FPI exigent une craniotomie, qui ne sont pas cliniquement pertinente, alors que les blessures de souffle est un modèle plus controversée en ce qui concerne les différentes positions de l' exposition et la pression maximale des mesures, ainsi que des blessures secondaires variable au cours de l'exposition ^_3-6. Un modèle mis à jour des animaux concussive qui peut traduire la recherche pré-clinique dans le setti cliniqueng est nécessaire dans la recherche.

La question clé dans la modélisation légère TBI est de définir la gravité des blessures expérimentales, qui reproduit le plus étroitement la blessure dans un cadre clinique. Récemment, différents groupes de recherche ont développé le traumatisme crânien fermé ou un traumatisme crânien concussive (CHI) modèle ^7-10. CHI est une modification du CCI sans craniotomie, mais il utilise toujours un système d'impact magnétique électronique traditionnelle pour générer un choc de la tête. Un CHI peut induire une commotion cérébrale allant de légère à modérée en ajustant les paramètres d'impact. Perte de conscience (LOC) peut être observée immédiatement après un choc en détectant une diminution de la fréquence respiratoire ou la cessation temporaire de la respiration. La période de LDC est utilisée pour déterminer la gravité de la blessure. Ce document comprend une version légèrement améliorée et mise à jour d'un modèle répétitif CHI (rCHI) chez la souris, avec un protocole détaillé étape par étape et des résultats représentatifs. La rCHI stratégies de recherche de modèle, unre bénéfique dans la détermination des effets et des traitements potentiels TCL, surtout parce qu'il n'y a pas de modèle animal capable d'imiter tous les changements pathologiques induits par une commotion cérébrale.

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées en vertu des protocoles # 201207692 approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Floride et en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Animal Care

1. Utilisez 3-4 mois vieux mâles C57BL / 6J. Fournir la literie, matériel de nidification, de la nourriture et de l' eau ad libitum. Garder la souris dans des températures ambiantes contrôlées à 20 - 22 ° C avec de la lumière / 12 h-cycles sombres 12 h constants.

2. Pré-impaction Préparation

1. Joindre une silicone pointe en métal recouvert de caoutchouc sur mesure à un dispositif d'impact stéréotaxique électromagnétique. Assurez - vous que le fond plat de la pointe est parallèle à la surface de la pointe de la sonde (figure 1A).
2. Anesthetize la souris avec 4% d'isoflurane suivi d'entretien de l'anesthésie de 2,5% d'isoflurane. Vérifier l'anesthésie par l'intermédiaire du débitmètre. Monitor le niveau d'anesthésie jusqu'à ce que l'animal atteint un niveau chirurgical de l'anesthésie en montrant la perte de retrait de la pédale réflexe.
3. Placez la souris dans une position couchée sur un coussin chauffant. Utilisez un cône de nez en forme d'entonnoir pour garder la souris sous anesthésie. Complètement raser la tête à l'aide d'une tondeuse. Utilisez la vaseline pommade ophtalmique sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.

3. Paramètres d'impact Réglage

NOTE: Le système d'impact comprend un boîtier de commande pour définir les paramètres d'impact, un actionneur pour effectuer l'impaction, et un cadre stéréotaxique numérique avec 3 axes de mouvement.

1. Pré-régler la vitesse du dispositif d'impact à 4 m / s et le temps de séjour à 240 msec sur le boîtier de commande.

4. Positionnement du Centre d'impact

1. Mettez un coussin chauffant souple sous le corps de l'animal pour maintenir la température du corps près de 39 ° C. Monter la souris dans un cadre stéréotaxique dans un prone position avec les barres d'oreilles extrémités franches.
2. Abaisser la pointe d'impact près de la tête de la souris en déplaçant le Z-pilote. Réglez la pointe d'impact plat (9 mm de diamètre) en déplaçant le X et Y conducteurs à mi-chemin de coordonnées cible au-dessus de la suture sagittale.
3. Assurez - vous que l' un des bords de la pointe d'impact verticalement parallèle à une ligne horizontale imaginaire tracée entre les deux oreilles (figure 1C). Le centre de l'impact correspond à la mi-chemin sagittal central de suture entre les sutures interfrontal et lambdoïdes (interauraux 9 mm à Interaural 0 mm, latéral 4,5 mm).

5. Impact Profondeur Réglage

1. Pour définir correctement la profondeur de l'impact, utilisez la pointe de la sonde supplémentaire pour remplacer la pointe d'impact de caoutchouc silicone isolé.
2. Pour assurer qu'il n'y a pas de décalage du centre d'impact après des conseils de commutation, réglez le X et le canal Y sur le panneau de commande stéréotaxique numérique à zéro avant de changer les pointes.
3. Déplacez le probe pointe vers le centre de la zone d'impact en déplaçant manuellement les X et Y lecteurs.
4. capteur de contact Clip à la queue de la souris.
5. Déplacer l'impacteur (Z lecteur) vers le bas jusqu'à ce que la pointe de la sonde touche la surface du site d'impact.
6. Réglez le canal Z sur le panneau de commande stéréotaxique à zéro.
7. Déplacez la pointe d'impact vers la zone d'impact en réglant manuellement X et Y conducteurs (PAS les zéro boutons sur le panneau de commande stéréotaxique numérique) jusqu'à ce que X et Y conducteurs sont nuls (où la pointe d'impact a été préalablement positionné).
8. Dégager l'actionneur en déplaçant le commutateur de retrait sur le boîtier de commande. Déplacer manuellement l'impacteur vers le bas (pilote Z) de 4 mm.

6. impact

1. Déclencher l'impact en cliquant sur le bouton d'impact sur le boîtier de commande et d'atteindre une profondeur de 4 mm de déformation.

7. Post-impaction

1. Mesurer le temps écoulé entre l'impact jusqu'au premier souffle de la souris à l'aide d'une minuterie.
2. Autoriser la récupération avant de retourner l'animal de retour dans une cage propre. Ne retournez pas un animal à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
3. Observer et peser les souris par jour. Si les souris montrent des signes de douleur, intrapéritonéale les injecter avec Meloxicam à 1 - 2 mg / kg toutes les 12-24 heures.

8. impaction Répétitive

1. Donner les souris blessures supplémentaires aux jours 4, 7 et 10 après la blessure initiale (intervalle de 72 heures entre les impacts).

9. immunohistochimie (IHC)

1. perfusion Transcardial
   1. Anesthetize les souris par injection intrapéritonéale avec 200 m / kg pentobarbital.
   2. Évaluer et assurer chirurgicale plan anesthésie par un pincement de l'orteil. Secondeure la souris en position couchée en collant doucement les pattes et les pattes arrière sur une surface de travail de styromousse dans une hotte chimique.
   3. Faire une incision à travers la peau le long de la ligne médiane thoracique de juste sous le processus xiphoïde à la clavicule. Faire deux incisions supplémentaires de la peau au processus xiphoïde et continuer sur la base de la cage thoracique ventrale latéralement.
   4. Ouvrez la cavité thoracique et d'exposer le coeur en coupant à travers la musculature thoracique et cage thoracique.
   5. Fixer le cœur battant avec une pince contondants et de faire une 1 - mm incision 2 dans le ventricule gauche.
   6. Insérer immédiatement une aiguille papillon dans l'oreillette droite. Commencez la perfusion de 20ml solution saline en poussant la seringue lentement.
   7. Passer de solution saline à 4% de paraformaldehyde. Poursuivre la perfusion avec 20 ml de paraformaldéhyde.
   8. Décapitez la souris et enlever la peau avec des ciseaux. Isoler le cerveau du crâne à l'aide d'un coupe-os.
2. Cryostat sectionnant
   1. les tissus du cerveau Intégrer dans la température optimale de coupe (OCT) formulation et le gel à -80 ° C. Placer le cerveau dans le cryostat dans une orientation sagittale. coupes de cerveau Couper 5 um d'épaisseur.
3. tachant
   1. Sécher les sections congelées à la température ambiante pendant 1 h.
   2. Incuber les lames avec 100 ul de sérum de chèvre à 2% et 0,1% de Triton X-100 dans du tampon phosphate salin (PBS) pendant 1 heure à température ambiante.
   3. Laver les lames 3 fois avec 300 pi de PBS. Puis incuber les lames avec anti-GFAP (1: 200) ou de l'anticorps anti-ferritine (1: 200) séparément pendant une nuit à 4 ° C.
   4. Laver les lames 3 fois avec 300 pi de PBS. Ensuite incuber les lames pendant 2 heures à la température ambiante avec un anticorps secondaire conjugué à la biotine.
   5. Laver les lames 3 fois avec 300 pi de PBS. Puis incuber les lames avec complexe (ABC) solution avidine-biotine (01h50) à la température ambiante pendant 30 min.
   6. Laver les lames 3 fois avec 300 pi de PBS. Puis laisser incuber à la 3,3'-diaminobenzidine solution (DAB) de substrat (50 ml de PBS, 10 ul de H ₂ O _2, 10 mg de DAB comprimé, le filtre avant utilisation) pour 5-8 minutes. Observer les lames au microscope jusqu'à ce que les cellules positives apparaissent.
   7. Rincer les lames à l'eau courante du robinet lente pendant 5 min. Nettoyer les lames avec un laboratoire essuyez. Montez ensuite les sections avec un milieu de montage et lamelle.

Representative Results

Dans ce modèle (figure 1 AC), il y avait de brèves périodes de halètement et peu profondes respirations. Une perte de conscience (inconsciente) est définie comme une diminution de la fréquence respiratoire ou de la cessation temporaire de la respiration avant de reprendre une respiration normale. Un impact sur le centre de la tête a causé une perte de conscience à court terme (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 sec à chaque impact séparément, figure 1D). Les cerveaux des souris ont montré une morphologie normale par H & E coloration histologique, qui a révélé l' absence de lésions structurelles ou les tissus des dommages évidents résultant de l'impact (figure 2A). En réponse à TBI, les astrocytes sont connus pour subir certains changements , y compris l' activation, la prolifération, ou gliose réactive ^11,12. Augmentation fibrillaire gliale acides protéines (GFAP) des cellules positives avec les corps cellulaires grandes et épaisses synapses sont les astrocytes activés. Le corpus calleux de cerveaux de souris rCHI a montré des signes évidents de astrocytes activation à 7 jours après le dernier choc (figure 2B).

Microbleeds dans le tissu sont fréquents dans les TCCL et peuvent conduire à la libération de fer de l' hémoglobine ^13. La surcharge en fer dans le sérum peut être détectée par des tests de ferritine dans les milieux cliniques ^13. Les cellules immunopositives ferritine dans le cortex de la souris ont été trouvés un jour après le dernier impact et a duré au moins sept jours, ce qui suggère que plusieurs impactions peuvent entraîner des microbleeds corticales (figure 2C).

Figure 1. Un modèle de souris de Répétitive commotionnant Head Injury. (A) de 1 mm d' épaisseur silicone embout de caoutchouc faite sur commande de mesure 9 mm de diamètre avec une pointe de sonde. (B) Une souris est mounted dans un cadre stéréotaxique en position couchée avec un coussin chauffant souple sous le corps. (C) Le positionnement du centre d'impact. Le bord de la pointe d'impact est verticalement parallèle à une ligne horizontale imaginaire tracée entre les deux oreilles. Le centre d'impact correspond à mi - chemin entre les sutures interfrontal et lambdoïdes (interauraux 9 mm à Interaural 0 mm, latéral 4,5 mm). (D) Apnea est définie comme de brèves périodes de cessation temporaire de la respiration. La moyenne et SD sont présentés dans le panneau inférieur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. histologie pour Répétitive commotionnant Head Injury. (A gauche) Un cerveau de souris a été retirée après la perfusion avec 4% de paraformaldehyde. Aucun dommage de tissu a été trouvé. (B) Augmentation du marqueur biochimique pour gliose (GFAP) dans le corps calleux 7 jours après la dernière blessure. Barre d'échelle = 200 um. (C) , par immunohistochimie, la ferritine chaîne H a été trouvé être exprimé dans le cortex cérébral après une blessure. Les photos d'insertion représentent magnifiés cellules positives. Barre d' échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Pour imiter des lésions cérébrales morphologiquement similaires à l'état clinique, les symptômes post-commotion cérébrale sont attendus. les symptômes post-commotion cérébrale comprennent généralement des maux de tête, des étourdissements, des vertiges, la fatigue, la mémoire et les problèmes de sommeil, problèmes de concentration, ainsi que l'anxiété et humeur dépressive. Puisque les symptômes somatiques peuvent pas encore être mesurable dans des modèles animaux, les changements de moteur et la fonction cognitive et le comportement émotionnel sont utilisés comme critères pour évaluer rationnellement commotion dans des modèles animaux. Dans une étude rapportée précédente, on a montré que le modèle de la souris induit rCHI des déficits dans l' apprentissage spatial, la mémoire, l' anxiété et ^8. Plus important encore, le modèle rCHI utilisé dans ce protocole représente le cadre clinique sans lésion cérébrale invasive ou la structure du cerveau fracture, qui peuvent tous deux entraîner des saignements, une hémorragie, un œdème, ou aiguë perte mort cellulaire / tissulaire.

Voici quelques conseils clés pour modéliser avec succès concussio cohérenten / TCL en utilisant un système d'impact magnétique électronique:

Éviter un deuxième traumatisme crânien directement à la suite de la première lésion cérébrale qui peut être provoquée par le mouvement lors de l'impact. La tête de la souris peut se déplacer légèrement vers le bas lors de l'impact. Pour éviter une contusion cérébrale causée par un mouvement rapide contre un sol dur ou la tête d'étirement, un coussin chauffant souple doit être mis sous le corps de la souris. La tête et le corps doivent également être conservés horizontal. En outre, utiliser des barres d'oreille extrémités franches pour fixer la tête de la souris dans le cadre stéréotaxique, et ne les insérez pas à l'intérieur du conduit auditif. Cela protège la souris contre les dommages causés par les extrémités pointues pendant le mouvement.

Positionner correctement le centre d'impact et d'établir le zéro. Contrairement blessure à la tête ouverte, le positionnement de la pointe d'impact est relativement difficile. La taille de la pointe d'impact et le centre d'impact affecte la gravité des blessures et des lésions. Sur la base de la souris anatomie du cerveau, le centre d'impact est conçu pour correspondre à mi-cheminentre sutures interfrontal et lambdoïdes (interauraux 9 mm à Interaural 0 mm, latéral 4,5 mm). Ainsi, une pointe optimisée de 9 mm est nécessaire. La pointe de l' impact doit être ajusté à la cible les coordonnées ci - dessus à mi - chemin de la suture sagittale, et un bord de la pointe d'impact doit être verticale parallèle à une ligne horizontale imaginaire tracée entre les deux oreilles (figure 1C). La pointe de percussion isolé avec un caoutchouc de silicone blocs de revêtement du capteur de contact et empêche le réglage de la profondeur de l'impact. Une pointe de la sonde est nécessaire et doit être parallèle à la surface du bouton sur la pointe d'impact. Le centre de l'impact est ajustée sur le site de toucher de la pointe de la sonde en actionnant l'instrument stéréotaxique. Frotter la tête avec une solution saline augmente l'électro-sensibilité. En outre, la sonde est amovible ou conçue pour ne pas blesser le cerveau lors de l'impact. Une autre façon est de construire deux bouts avec la même longueur; une pointe revêtue de caoutchouc de silicone et l'autre extrémité serait métallique, qui serautilisé comme une pointe de sonde. Les deux conseils devraient être commutés entre le positionnement et impactant.

Surveiller de brefs symptômes inconscients de la souris immédiatement après un impact. Comme indiqué plus haut, la plupart des symptômes post-commotion cérébrale sont difficiles à observer immédiatement dans un modèle animal de laboratoire de la souris. patients TCL peuvent éprouver une brève perte de conscience après la blessure. Pour établir les paramètres de blessures visibles, une brève perte de conscience était un symptôme utilisé pour évaluer la validité de ce modèle TBI concussive. Perte de conscience (LOC) est normalement utilisé comme critères pour classer la gravité des blessures chez les patients ayant subi un TCC. Dans la plupart des commotions cérébrales liées au sport, la durée du LOC est inférieure à une minute ^14. En optimisant les conditions expérimentales, telles que la vitesse d'impact et le temps de séjour, le COL est inférieur à 10 secondes après un impact. La condition d'impact optimal est une profondeur d'impact de 4 mm, 240 msec temps de séjour et de 4 m / s, la vitesse d'impact. Augmentation de la vitesse d'impact et demeurerle temps peut provoquer une pression intracrânienne accrue aiguë sur une grande quantité de temps, ce qui peut entraîner des lésions cérébrales graves ou la mort immédiatement de dépression respiratoire. Les souris vont perdre du poids du corps après chaque impact, mais vont reprendre du poids après 72 heures de récupération. 72 h intervalles répétitifs sont choisis pour imiter une période de récupération pour les athlètes blessés avant de retourner à leur sport.

Outre la perte de problèmes de conscience et respiratoires, les symptômes cliniques d'une commotion cérébrale peuvent inclure des convulsions, des maux de tête, des étourdissements, des nausées et des vomissements. Dans le modèle, la douleur du cerveau peut être la majorité des symptômes inconfortables pour les animaux. Note d'état corporel et la catégorie de douleur Description devraient être utilisés comme points limites. En outre, d'autres effets neurologiques spécifiques telles que la saisie incontrôlée, le comportement spontané indirecte, perte d'équilibre et incapable de marcher ou se tenir debout devraient être considérés comme des points limites rCHI spécifiques. Puisque c'est un modèle de lésion légère, normalement pas signisignes signifi- de la douleur sont observés après chaque impact. Analgésiques sont généralement inutiles à ce niveau de la lésion cérébrale. Ce protocole fournit des étapes clés détaillées pour la modélisation d'un TBI doux concussive répétitif. La vitesse et la profondeur de chaque impact peut être ajustée en fonction de la sévérité désirée de la lésion. Ce modèle utilise un système d'impact magnétique électronique pour offrir des impacts. Il est stable avec une vitesse contrôlée avec précision, temps d'arrêt, et la profondeur de déformation. Cependant, parce qu'il est un traumatisme crânien fermé sans une craniotomie, il est impossible de positionner avec précision l'impact de cerveau de souris en utilisant les coordonnées stéréotaxiques. Aussi la commutation des conseils d'impact / de la sonde peut entraîner un changement de site d'impact, ce qui est la principale cause de blessures incompatibles. Compte tenu de la blessure diffuse et une commotion cérébrale avéré comme prévu, ce modèle reste précis et facile à contrôler.

Ce modèle est avantageux d'utiliser pour sa précision et de simplicité pour déterminer les effets de l'impactlésion cérébrale légère la PI, en particulier liés aux sports commotion cérébrale. Elle sert de plate-forme pour des études précliniques, tels que l'exploration des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques ainsi que le test de dispositifs médicaux, des médicaments et de la solution de thérapie génique. Ce modèle peut également être utilisé pour les études d'encéphalopathie traumatique chronique (CTE), qui est actuellement diagnostiquée par le post-mortem examen neuropathologique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anesthesia machine	Eagle Eye Anesthesia, Inc	Model 150	anesthesia
Electromagnetic Impactor	LeicaBiosystems	Impact One Stereotaxic Impactor	perform impaction
Digital Stereotaxic instrument	LeicaBiosystems	39462501	mount mouse and positioning tips
Sicilone rubber-coated metal tip	Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL	custom-made	impact tip
Lithium Ion All-in-One Trimmer	WAHL Home Products	9854-600	shave mouse hair
paper clips	custom-made		probe tip
Cotton tipped applicators	MEDLINE	MDS202055	scrub head with saline
Tissue Tek O.C.T.	ASKURA FINETEK USA INC	4583	tissue embedding
anti-GFAP	Dako	CA93013	antibody for IHC
anti Ferritin	Sigma	F6136	antibody for IHC
VECTASTAIN Elite ABC  kit	Vector laboratories	PK-6100	IHC detection system
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Aperio XT ScanScope scanner	Leica Microsystems Inc,		slides scanning
Leica AutoStainer XL	Leica the pathology Company	ST2010	H&E staining
DAB	sigma	D3939	IHC detection system