Summary
L'horloge circadienne régule environ un tiers du transcriptome Arabidopsis, mais le pourcentage de gènes qui se nourrissent de nouveau dans timekeeping reste inconnue. Ici, nous visualisons une méthode pour évaluer rapidement les phénotypes circadiens dans toute lignée mutante d'Arabidopsis en utilisant l'imagerie luminescente d'un journaliste circadien transitoirement exprimé en protoplastes.
Introduction
La plupart des organismes vivants possèdent un chronométreur endogène pour faciliter la négociation efficace des changements quotidiens dans l'environnement. Cette chronométreur, l'horloge circadienne, régule de nombreux aspects du métabolisme et la physiologie d'un organisme d'anticiper les changements prévisibles dans l'environnement externe. Chez les plantes , par exemple, l' anticipation des agents pathogènes ou herbivore attaques temporellement prévisibles réduit fortement la sensibilité globale 1-4. Le métabolisme de l' amidon est étroitement régulée par l'horloge circadienne pour assurer que les réserves d'amidon jusqu'à l' aube si cultivé dans des conditions longues ou courtes jour 5. En effet, les plantes avec des horloges circadiennes correspondant aux environnement montrent une augmentation des taux de croissance de 24 h, le taux de fixation de carbone et les taux de survie par rapport aux plantes en cours d' exécution d' une horloge de la période dépareillés 6. L'influence étendue des rythmes circadiens dans tous ces processus se présente dans une large mesure de la régulation rythmique jusqu'à un tiersdu transcriptome total Arabidopsis 7. Ces produits de gènes rythmiques sont impliqués dans un large éventail de processus cellulaires , y compris les voies métaboliques, la signalisation hormonale, et le stress des réponses 7. En plus de cela, la régulation circadienne directe de la fonction des protéines est établie par régulation circadienne de la phosphorylation 8 et plus probablement d' autres modifications post-traductionnelles (PTM).
Au centre de l'horloge circadienne qui entraîne cette reprogrammation transcriptionnelle quotidienne est un réseau de transcription / feedback translationnelle boucles (TTFLs), y compris les gènes du matin exprimé CIRCADIEN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) et TARD ELONGATED HYPOCOTYLE (LHY) qui répriment l'expression des gènes du soir TIMING dE CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) et les membres du complexe du soir (CE); LUX ARRHYTHMO (LUX), floraison précoce 3 (ELF3), et ELF4 9 - 11. wit Ensembleh les -Genès REGULATEUR PSEUDO DE RÉPONSE (pRR3, 5, 7 et 9), TOC1 refoule CCA1 / expression LHY alors que la CE agit comme un régulateur positif 12-14. Additionnel à des mécanismes de rétroaction, post-transcriptionnelle et post-traductionnelle régulation des composants du réseau TTFL joue un rôle important dans les rythmes circadiens tuning. À ce jour, le PTM le plus abondant identifié sur les protéines de l' horloge circadienne est la phosphorylation 15. La phosphorylation de CCA1 par Casein Kinase 2 (CK2) affecte sa liaison à cibler les promoteurs 16 et est important pour la compensation de température de l'horloge circadienne 17. Les protéines PRR sont phosphorylés différentiellement au cours du cycle circadien, et la phosphorylation de TOC1 affecte l' interaction avec son régulateur négatif, le composant d'horloge Zeitlupe soir phases (ZTL) 18. Ces exemples illustrent comment PTM et les interactions protéine-protéine syntoniser le réseau TTFL dans un h 24l'oscillateur de la transcription. Pour une présentation plus détaillée au réseau d'horloge de la transcription et de sa régulation, d' excellentes critiques récentes sont disponibles (par exemple , référence 15).
Cependant, ce qui reste moins clair est la mesure dans laquelle les processus réglementés rythmiquement et d'autres aspects du métabolisme cellulaire se nourrissent de nouveau dans le mécanisme de chronométrage lui-même. Vaste sélection de mutants d'Arabidopsis pour les défauts d'horloge pourrait obtenir une meilleure compréhension des mécanismes qui ou les voies de signalisation pourraient être impliqués dans la génération de 24 rythmes h à partir d'un réseau de TTFL. À cette fin, Kim et Somers précédemment publié une méthode de percée pour l'analyse efficace et rapide de la fonction d'horloge dans une ligne de Arabidopsis 19. Sur la base de l'utilisation de l'expression transitoire dans des protoplastes, cette méthodologie surpasse le besoin de lignées transgéniques stables ou centre pour lignes de marquage d'horloge luminescentes. Ici, nous visualisons un protoplaste isolatio à haut rendementn procédé 20 combiné avec un protocole optimisé pour cribler des défauts circadiens imagerie par luminescence des marqueurs d'horloge exprimés transitoirement dans un lecteur de plaque à 96 puits.
Nous allons comparer type sauvage Col- 0 Arabidopsis à des mutants d'horloge bien caractérisés pour confirmer la méthodologie décrite ici avec succès détecte les rythmes circadiens altérés. Protoplastes dérivés de ces lignes sont transfectées avec une construction de rapporteur qui exprime la luciférase de luciole à partir du promoteur DPA1 circadien; CCA1pro: LUC 19. Luciférase catalyse la réaction en plusieurs étapes dans lequel luciférine est converti excité électroniquement oxyluciférine qui émet de la lumière 21, qui est imagé au fil du temps pour évaluer la période, l' amplitude et la phase des rythmes de transcription dans ces protoplastes.
Le protocole est constitué de trois parties principales; l'isolement des protoplastes, transfecter des protoplastes avec le plasmide rapporteur et im luminescentvieillissement. Ces trois parties doivent toujours être effectuées sur un seul jour, en utilisant des tampons et des réactifs fraîchement préparés. La croissance des plantes et la purification de quantités suffisantes de plasmide rapporteur doivent être effectués à l'avance et ne sont pas visualisées dans ce protocole.
Protocol
NOTE: Dans ce protocole, les réactifs et les volumes décrits sont exprimés par ligne de Arabidopsis qui est testée, et se traduira par six puits réplicats pour ce génotype. Multipliez les matériaux avec le nombre de lignes à analyser lors de l'analyse plus d'une ligne. Dans la vidéo, de type sauvage Arabidopsis sera comparée à l'horloge circadienne mutant ZTL ligne (bien que des résultats représentatifs des lignes supplémentaires seront fournies ultérieurement).
| solution enzymatique | |
| Cellulase | 0,5% (p / v) |
| Pectinase R10 | 0,25% (p / v) |
| D-mannitol | 400 mM |
| CaCl2 | 10 mM, |
| KCl | 20 mM, |
| Albumine de sérum bovin | 0,1% (p / v) |
| MES, pH 5,7 | 20 mM, |
| solution W5 | |
| NaCl | 150 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5,7 | 2 mM |
| Glucose | 5 mM |
| solution MMg | |
| MES, pH 5,7 | 4 mM |
| D-mannitol | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM, |
| solution de PEG | |
| PEG4000 | 40% (p / v) |
| D-mannitol | 200 mM |
| CaCl2 100 mM | |
| Solution d'imagerie | |
| solution W5 | au volume final |
| Sérum de veau fœtal | 5% (v / v) |
| Luciferin | 1,2 mM |
| ampicilline | 50 mg / ml |
Tableau 1: Liste des solutions.
1. Préparation des matériaux et Tampons
- Les matières végétales
- Maintenir Arabidopsis Col -0 graines dans l' eau dans un tube de 1,5 ml à 4 ° C dans l'obscurité pendant quatre jours. Pipeter les graines sur le sol dans une casserole et transférer à des conditions de jours longs (16 heures de lumière 8 h d'obscurité) à 21 ° C pendant 7 jours. Laisser un couvercle sur le pot pour les trois premiers jours pour assurer une forte humidité. Transplant six plants à une nouvelle 8 cm x 13 cm x 5 cm pot et continuer à cultiver les plantes dans les mêmes conditions pour another 21 jours. Assurez-vous que le sol est humide tout au long.
- Reporter plasmide
- Purifier le CCA1pro: LUC plasmide rapporteur 19 de la culture bactérienne à l' avance, en utilisant un kit d'isolement d'ADN selon les instructions du fabricant.
NOTE: 20 ug plasmide rapporteur est nécessaire (10 pi à 2 pg / pl dans dH 2 O) pour une transfection.
- Purifier le CCA1pro: LUC plasmide rapporteur 19 de la culture bactérienne à l' avance, en utilisant un kit d'isolement d'ADN selon les instructions du fabricant.
- Solutions
NOTE: Pour ce protocole cinq solutions sont nécessaires: la solution enzymatique, Wash 5 (W5) solution, mannitol-Magnésium (MMG) solution, le polyéthylène glycol (PEG) solution, et une solution d'imagerie (tableau 1). Préparer ceux-ci avant de procéder à l'étape d'isolement de protoplastes.- Préparer 10 ml de solution d'enzyme selon le tableau 1, en ajoutant les enzymes dernier et stériliser par filtration la solution à travers un filtre de 0,22 um seringue.
- Préparer les solutions restantes dans les volumes suivants: 15 ml W5 solution, 10 ml MMg solution, 1 ml de solution de PEG et d'une solution d'imagerie de 1,5 ml selon le tableau 1.
Remarque: il est important que la solution de PEG est préparé au moins une heure avant la transfection pour assurer que le PEG est complètement dissous. Stériliser par filtration la solution de formation d'image à travers un filtre à seringue de 0,22 um.
Figure 1:. Protoplastes isolement Les feuilles des plantes d'Arabidopsis adultes (A) sont fixés sur la bande autoclave avec la couche inférieure de l' épiderme vers le haut (B). (C) Magic Tape est doucement pressée sur la couche inférieure de l' épiderme avec la pointe d'un tube de 15 ml conique. (D) La bande magique est enlevée pour exposer les cellules du mésophylle (E). (F) Des bandes de ruban autoclave avec la permissions ci-joints sont flottés sur une solution enzymatique contenant de la cellulase et de la pectinase, la libération des protoplastes dans la solution. (G) La feuille squelettes restent sur la bande autoclave après digestion par enzyme et sont mis au rebut, ce qui laisse les protoplastes dans une solution enzymatique (H). (I) protoplastes finales résultant de mésophylle (barre d' échelle = 50 pm). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
2. protoplastes Isolation
- Etiqueter une boîte de Pétri et ajouter 10 ml de solution d'enzyme stérilisée par filtration.
- Fixer quatre bandes de ruban autoclave avec le côté collant sur une surface de laboratoire propre, et marquer la taille de la boîte de Pétri sur les bandes.
- Couper les feuilles de 4 semaines vieilles plantes (figure 1a), et appuyez sur l'épiderme supérieur sur la bande d'autoclave ( à savoir la surface de l' épiderme inférieur vers le haut (
- Appuyez doucement sur des bandes de ruban magique sur la surface de l'épiderme inférieur à l'aide d'un tube de 15 ml conique. Prenez soin de ne pas écraser le tissu foliaire (Figure 1c). Retirez délicatement le ruban magique hors de dépouiller l'épiderme inférieur (Figure 1d) et exposer les cellules du mésophylle (Figure 1e).
- Couper le ruban autoclave pour ajuster la boîte de Pétri, utiliser des pinces pour déplacer la bande dans la boîte de Pétri et flotter sur la solution d'enzyme (Figure 1f), les feuilles vers le bas. Tourner à 60 tours par minute sur un agitateur à plate-forme pendant 60 minutes, au cours desquelles les protoplastes sont libérés dans la solution.
- Utilisez des pinces pour enlever et jeter les bandes de ruban autoclave (Figure 1g) et la pipette la solution contenant les protoplastes (Figure 1h) dans un tube conique de 50 ml. Utiliser un embout de pipette grand alésage (comme une pointe de P5000 ou une pointe de P1000 avec l'extrémité coupée).
- Centrifuger les protoplastes à 100 xg pendant 3 min à 4 ° C et à retirer le surnageant avec une pipette. Prenez garde, car le culot est très lâche.
- Ajouter une solution de W5 10 ml aux protoplastes et resuspendre en remuant doucement le tube.
- Reposez les protoplastes sur la glace pendant 30-60 min. Au cours de cette étape, d' évaluer le rendement en comptant les protoplastes dans un hémocytomètre (Figure 1i).
- Recueillir les protoplastes par centrifugation à 100 x g pendant 3 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec une pipette. Prenez garde, car le culot est très lâche.
- Remettre en suspension les protoplastes à une concentration de 5 x 10 5 protoplastes / ml dans une solution MMG.
3. protoplastes Transfection
- Ajouter 10 ul plasmide rapporteur (2 pg / pl) dans un tube de 15 ml conique.
- Ajouter 400 ul de protoplastes dans le tube.
- Ajouter un volume (410 pi) solution de PEG et mélanger en inversant le tube doucement 12 fois pour transfecter les protoplastes.
- Après 8-15 min incubation à la température ambiante, on dilue le mélange protoplastes ADN-PEG avec quatre volumes (1640 pi) mélanger la solution W5 et en retournant doucement à six reprises.
- Recueillir les protoplastes transfectées par centrifugation à 100 g pendant 2 min à température ambiante et retirer le surnageant avec une pipette. Encore une fois, prendre soin, comme le culot est très lâche.
- Resuspendre les protoplastes dans 1.250 solution d'imagerie ul.
- Aliquoter 200 pi dans six répliquent puits d'une plaque à 96 puits, remplir tous les puits vides avec une solution W5, et sceller la plaque avec un couvercle transparent adhésif approprié pour l'imagerie luminescente.
4. Imaging
- Transférer la plaque pour toute installation d'imagerie luminescente appropriée pour l'imagerie végétale. Changez les couvercles adhésifs sur les plaques 10-15 minutes après le transfert pour éviter la condensation et la pression des différences entre les puits, puis commencer à l'imagerie. Lire la plaque tous les ~ 45 min (3 sec par puits) pendant cinq jours à la température ambiante.
Noter lala fréquence de la plaque de lecture et le temps de lecture par puits peut varier en fonction de la configuration de l'imagerie.
Analyse 5. Données
- Analyser les résultats de luminescence en utilisant un logiciel d'analyse (par exemple, biologique Rhythms système logiciel d' analyse (BRASS) 22). Comparer la ligne mutant à des contrôles de type sauvage pour révéler les défauts circadiens.
Representative Results
Protoplastes de type sauvage Arabidopsis ont été comparés aux mutants d'horloge connus CCA1 / lhy (courte période mutant 2), ZTL (long mutant de la période 23), et la ligne de surexpression CCA1 -OX (arythmique 24). Tous ont été transitoirement transfectées avec le CCA1pro: reporter GCU et imagé à la lumière constante sur un lecteur de plaque sur 5 jours.
Ici , nous montrons que , dans le mutant CCA1 / lhy, la période de libre-exécution de l' expression circadienne contrôlée gène est réduite (figure 2a), en ligne avec la période publiée analysée par expression transgénique stable de l' horloge luminescent marqueurs 2,9. La période des oscillations circadiennes dans les protoplastes du mutant ZTL est plus long que dans le type sauvage (figure 2b), en conformité avec les résultats publiés antérieurement à partir de semis, suspension cellulaire cultures et protoplastes 19,23,25.
La surexpression de CCA1 verrouille l'horloge du matin phase et la transcription mondiale devient arythmique 24. Constamment, nous avons observé aucune oscillation dans CCA1pro: expression LUC en protoplastes -OX de CCA1 (figure 2c).
Figure 2: protoplastes Circadian Rhythms protoplastes de Col- 0, CCA1 / lhy, ZTL et CCA1 -OX ont été transitoirement transformé avec le CCA1pro: GCU construire et les rythmes circadiens dans la luminescence ont été imagées sur 5 jours (A - C). (D) estimations de la période circadiens basées sur les traces de luminescence dans le Col -0, CCA1 / lhy et ZTL (A - B). Moiun SEM ±, n = 3-5, t-test p-valeur comme indiqué. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Génotype | Période (protoplastes) | Période (transgénique) | Rapporté par: | Les références |
| Col- 0 | 23,0 ± 0,21 | 24,4 ± 0,09 | pCCA1: LUC à Col -0 | (2) |
| CCA1 / lhy | 20,6 ± 0,13 | 19,9 ± 0,11 | pCCA1: LUC à Col -0 | (2) |
| ~ 18 | ARN dans L er fond | (9) | ||
| 25,1 ± 0,12 | 27,4 ± 0,5 | CAB2: LUC en C24 écotype | (22) | |
| CCA1 -OX | arythmique | arythmique | pCCA1: GCU (données LD uniquement) | (2) |
| arythmique | ARN et de protéines dans le col de l'arrière - plan | (23) |
Tableau 2: les rythmes circadiens dans protoplastes Par rapport à Transgenic plantules La période circadienne de pCCA1:. Expression LUC en protoplastes par rapport aux longueurs de période rapportées pour la mutation et, si possible, avec pCCA1: expression LUC à Col -0.
Discussion
Ici, nous présentons un test rapide à l'écran circadiens défauts d'époque dans des lignées d'Arabidopsis, y compris l'isolement de protoplastes, la transfection, et l'imagerie par luminecent. La période circadienne de type sauvage Arabidopsis et l'horloge mutants CCA1 / lhy, ZTL et CCA1 -OX a été calculé à partir des mesures de luminescence d'un CCA1pro: reporter LUC et jugée compatible avec les données publiées générées à partir de plantes entières à l' aide de plus Time- consommant des approches transgéniques (tableau 2). L'utilisation de ce test pour cribler des mutants d'Arabidopsis évite l'exigence initiale pour générer des lignées transgéniques luminescentes, ce qui prend du temps et peut ne révéler qu'un mutant particulier présente des rythmes de type sauvage. Un avantage évident de ce protocole est que toute ligne de Arabidopsis peut être projeté en peu de temps pour les rythmes circadiens de transcription modifiés, ce qui permettra l'identification de plusieurs gènes affectant timekeeping dans les plantes.
26,27. La digestion ultérieure nécessite au moins 3 heures d'incubation dans l'obscurité pour libérer les protoplastes dans la solution enzymatique. Lorsque l'infiltration sous vide est pas appliquée, la durée d'incubation jusqu'à 18 heures est conseillé. Dans le protocole présenté ici, l'infiltration sous vide est inutile car la couche cellulaire épidermique impénétrable aux enzymes est enlevé par la bande. Lors de la génération des protoplastes en coupant le matériel végétal, il est nécessaire de protoplastes séparer les débris de la paroi cellulaire après digestion; ceci est généralement fait par filtration de la solution ou de la purifier sur un 27,26 gradient de sucre. Ici, tout tissu non digérés restera sur la bande d'autoclave aprèsla digestion, de sorte que la filtration et la purification du sucre gradient des protoplastes peut être omise. Il y a une chance que le stress résultant de procédures de protoplastes prolongées affecte la viabilité cellulaire et l'horloge circadienne. La méthode de protoplastes sur bande 20 visualisés ici donne un nombre élevé de protoplastes; et compte tenu de la viabilité des cellules au cours d' une série temporelle du rythme circadien et les longueurs des périodes correspondantes de protoplastes et de plants entiers (tableau 2), la méthode décrite ici , on préfère plus d' autres méthodes pour générer des protoplastes.
L'étape de transfection du protocole est une étape critique qui a un impact sur la viabilité des protoplastes. La solution de PEG permet à l'ADN qui doit être délivré dans la cellule, et à la fois du temps d'incubation dans cette solution (étape 3.4) et le pourcentage du PEG doit être déterminée de manière empirique. La concentration standard est de 20%, avec des concentrations plus faibles en réduisant l'efficacité de la transformation ultérieure etLes concentrations en réduisant la viabilité 28. Temps aussi court que cinq minutes d'incubation pourrait donner une transfection efficace des protoplastes 27.
Les protoplastes peuvent être visualisés sur une plate-forme d'imagerie luminescente. Dans cette vidéo, nous avons utilisé un lecteur de plaque de luminescence équipée avec des lumières extérieures (rouge et LED bleues, 630 et 470 nm, respectivement, à une intensité combinée de ~ 20 uE), qui permet le criblage à haut débit et des mesures fréquentes. Autre équipement d'imagerie qui détecte la luminescence, tels que les lecteurs ou les configurations de plaques alternatives basées autour d'un dispositif (CCD) à couplage de charge, pourrait être appliquée aussi bien aussi longtemps que l'éclairage est disponible pour la photosynthèse. L'avantage d'utiliser une caméra CCD monté sur un meuble commandé est que la lumière et la température peut être programmé. Un inconvénient est le temps de capture plus, l'introduction de longues périodes d'obscurité qui peut causer un stress aux protoplastes en plus perturberaiting timekeeping endogène. Quelle que soit la plate-forme expérimentale est choisie, le réglage des paramètres est susceptible d'être nécessaire par rapport aux paramètres pour les semis ou les plantes matures. Dans notre expérience, ce qui augmente les concentrations de plasmide rapporteur pendant la transfection et / ou luciférine dans le tampon d'imagerie peut résoudre tous les rythmes erratiques ou d'amortissement rapide qui pourraient survenir dans les premières expériences.
Dans des expériences futures, la méthode décrite ici peut être appliquée à l'étude du phénotype circadien d'une ligne d'Arabidopsis mutante. Avec des modifications mineures, par exemple l'effet de divers médicaments sur timekeeping pourrait être étudié dans cette configuration. En outre, la transfection peut être modifié pour inclure microARN artificiel pour silençage génique 19, élargissant ainsi la polyvalence de ce protocole. Protocoles pour générer des protoplastes de riz sont bien établies 29 et le protocole d'imagerie présentées ici pourraient également être appliqués pour faire avancer notre uCOMPRENDRE de l'horloge dans économiquement importantes plantes cultivées monocotylédones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride | Merck Millipore | 219466 | |
| Pectinase R10 | Sigma Aldrich | P2401 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4503 | |
| MES | Acros Organics | 327765000 | |
| NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
| Glucose | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | Acros Organics | 434630010 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| D-Luciferin, Firefly | Biosynth AG | L-8200 | Dissolve luciferin powder in 0.1 M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50 mM |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9618 | |
| Comply Steam Indicator Tape | 3M | 1222 | |
| Magic Tape | 3M | 819-1460 | |
| Petri Dishes | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Microplate, 96 well, flat bottom, white | Greiner Bio-One | 655075 | |
| TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates | Perkin Elmer | 6050195 | |
| Syringe, 10 ml, w/o needle | BD Plastipak | 302188 | |
| Syringe filter 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) | Free download at amillar.org | ||
| QIAfilter Maxiprep Kit | Qiagen | 12262 | |
| Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell | Hawksley | AC6000 | |
| Bright field microscope | Optika Microscopes | B-150POL-B | |
| LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module | Berthold Technologies Ltd | 57947/57948 |
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