La quantificazione accurata degli eventi di traffico vescicolare spesso fornisce informazioni chiave sui ruoli di specifiche proteine e sugli effetti delle mutazioni. Questo articolo presenta metodi per l'utilizzo della pHluorina supereclittica, una variante della GFP sensibile al pH, come strumento per la quantificazione degli eventi endocitici nelle cellule viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza quantitativa e la citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito
In questo articolo
Sommario
Abstract
proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti sono ampiamente utilizzati strumenti per studiare la localizzazione delle proteine e la dinamica di eventi come il rimodellamento del citoscheletro e il traffico vescicolare nelle cellule viventi. metodologie quantitative che utilizzano fusioni GFP chimerici sono stati sviluppati per molte applicazioni; tuttavia, GFP è un po 'resistente alla proteolisi, così la sua fluorescenza persiste nel lisosoma / vacuolo, che può ostacolare la quantificazione del traffico merci nella via endocitico. Un metodo alternativo per quantificare endocitosi e post-endocitosi eventi traffico fa uso di superecliptic pHluorin, una variante pH-sensibile GFP che viene raffreddato in ambienti acidi. la fusione chimerica del pHluorin alla coda citoplasmatica di transmembrana carico proteine risultati in una attenuazione della fluorescenza al momento della costituzione del carico in corpi multivesicular (MVB) e la consegna al lume lisosomi / vacuolo. Così, tempra di fluorescenza vacuolare facilita quantificazione di endocitosi ed eventi precoci nella via endocitico. Questo documento descrive i metodi che utilizzano carichi pHluorin-tag per la quantificazione di endocitosi tramite microscopia a fluorescenza, così come saggi basati sulla popolazione citometria a flusso.
Introduzione
traffico vescicolare svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'identità organello e funzione in cellule eucariotiche, ed è un meccanismo fondamentale di regolazione composizione proteica e la membrana dei singoli compartimenti cellulari. Alla membrana plasmatica, fusione delle vescicole esocitosi offre nuove proteine e membrane alla superficie della cellula, mentre vescicole generati tramite endocitosi rimuovere la membrana e proteine dalla superficie per il successivo riciclaggio o destinata al lisosoma. Così, endocitosi è importante per l'assorbimento dei nutrienti e risposte all'ambiente extracellulare. Esocitosi e endocitosi sono equilibrat....
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Protocollo
1. Soluzioni e supporti
- Preparare i seguenti stock, Media e piastre:
- Per preparare 10x YNB, sciogliere 67 g di base azotata di lievito priva aminoacidi in 1 L di acqua. Sterilizzare per filtrazione attraverso un filtro di 0,22 micron nitrocellulosa.
- Preparare medio YNB usando 1x YNB (da 10x magazzino) con il 2% di destrosio (da una sterile 50% w / v magazzino) e miscela di aminoacidi 1x / nutrienti (da 100x magazzino, vedere il punto 1.1.4). Per la selezione plasmide, omettere singoli aminoacidi o nutrienti, se necessario. Per l'induzione di espressione Mup1, inoltre omettere metionina dalla miscela di aminoacidi / nutrienti.
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Risultati
Localizzazione steady-state e la quantificazione del costitutivamente interiorizzato endocitico proteine cargo STE3
Per dimostrare che carichi pHluorin-tag possono essere utilizzati per la quantificazione di endocitosi in cellule viventi, localizzazione di GFP chimerico e fusioni pHluorin con la coda citoplasmatica C-terminale STE3, il recettore feromone un fattore in lievito, sono stati confrontati. STE3 è un.......
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Discussione
Applicazioni di pHluorin per la quantificazione degli eventi endocitosi in cellule di lievito fa uso di carichi transmembrana in cui il tag fluorescente viene fusa alla coda citoplasmatica della proteina (Figura 1A). Per i saggi qui descritte, carichi sono fluorescenti vivacemente quando il tag pHluorin è esposto ad ambienti neutri, ma diventano spenta quando il tag pHluorin incontra condizioni di acidità. Così, un carico endocitico pHluorin-tag è prontamente rilevata la faccia citoplasmatica della memb.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Gero Miesenböck e Tim Ryan per aver condiviso il cDNA di pHluorin utilizzato per generare reagenti in questo studio, Nathan Wright, Joanna Poprawski e Lydia Nyasae per l'eccellente assistenza tecnica, i membri del laboratorio Wendland per le utili discussioni, e Michael McCaffery e Erin Pryce dell'Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) per i consigli e l'assistenza con la microscopia e la citometria a flusso. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (a B.W., GM60979) e della National Science Foundation (a B.W., MCB 1024818). K.W. è stato sostenuto in parte da una borsa di studio per la formazione del Nati....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adenina | Sigma | A8626-25G | Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Utilizzare per la preparazione di terreni di coltura |
| BD Difco Lievito Base di azoto (senza amminoacidi) | BD | 291920 | Utilizzare per la preparazione di terreni liquidi e piastre |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Utilizzare per il rivestimento della camera |
| vetrini Destrosio | Fisher | BP350-1 | Utilizzare per la preparazione di liquidi e piastre |
| L-istidina | Fisher | BP382-100 | Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre |
| L-Leucina | Acros | 125121000 | Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre |
| L-Lisina | Fisher | BP386-100 | Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre |
| L-metionina | Fisher | BP388-100 | Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre |
| L-triptofano | Fisher | BP395-100 | Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre |
| L-Tirosina | Acros | 140641000 | Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8 pozzetti) | Thermo Scientific | 155411 | Utilizzare per saggi cinetici e finali di internalizzazione Mup1-pHluorin |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Utilizzare per la preparazione di miscele di aminoacidi e soluzione madre |
| Microscopio invertito Axiovert 200 | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Lens Carl | Zeiss | L'obiettivo deve essere 100X, 1.4NA o superiore | |
| La fotocamera Sensicam | Cooke Corporation | deve avere una gamma dinamica a 12 bit o superiore | |
| X-Cite 120PC Q Fonte di illuminazione | Software Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 | Software Intelligent Imaging Innovations | ||
| Software ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Riferimenti
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endo....
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Ristampe e permessi
