ラットの腹部大動脈の収縮を通じて心臓リモデリングのモデル

Introduction

心不全は、複雑な臨床症候群、疲労、呼吸困難、運動不耐性を含むそれらの症状、および末梢組織における体液貯留です。これは、先進国¹における死亡の主な原因です。別にサルコメアタンパク質またはイオンチャネル²における突然変異によって引き起こされる継承心筋から、心筋機能障害は、高血圧、心臓弁膜症、肥満、および糖尿病^3を含む医学的状態、種々の方法により生じさせることができます。最終的には心不全^3,4につながる循環要求を満たすために不十分な心臓のポンプ能力、に心筋の構造、電気伝導、およびエネルギー代謝のリードの変化。心不全のメカニズムを調査し、したがって、心臓血管研究の分野において重要です。心不全の進行につながる分子メカニズムを識別することは、最終的に新規治療標的または有用なバイオマーカーの発見を助けることができます5に心不全とキー臨床的特徴を共有する心不全の動物モデルを開発することが重要です。

心臓肥大及びリモデリングが心不全の発症において重要な役割を果たしています。高血圧性心疾患は、心臓肥大およびヒト患者¹に見られる不適応リモデリングの主要な寄与因子です。これらの人間の条件を模倣するために、動物モデルは、多くの場合、外科的処置を介して確立されます。具体的には、横方向または腹部大動脈は、最終的に心臓内の圧負荷につながる左心室に対する抵抗力を高めるために狭窄することができます。この現象は通常、心臓血管系の機能的な要求を満たすために、心臓肥大、心筋細胞の生理学的補償をもたらします。しかし、機能的な需要は、心臓線維症およびcontracにつながる、通常の生理学的代償機構を無効にしますタイルの減損。横方向の大動脈狭窄（TAC）手術は、多くの場合、大動脈弓から開胸、機械換気、および胸腺の分離および脂肪組織を含む複雑な手順を伴います。これとは対照的に、腹部大動脈狭窄は、単純な実験手法^6-8を必要^とします 。腹部大動脈は、左右の腎動脈との間に、手術中の狭窄です。心肥大およびリモデリングは、数週間腹部大動脈狭窄手術^6-8後に観察することができます。彼らは、横大動脈狭窄手術^9,10によって生成されたものと同様の堅固な高血圧性心疾患を生じさせます。ここで、我々は、効率的な再現性の高い、かつ低侵襲性の方法を用いて、ラットで腹部大動脈狭窄を行うためのプロトコルを記述します。腎動脈に隣接し、腹部大動脈を4-0絹糸により形成さ0.72ミリメートルループによって絞られます。手術、心臓肥大およびremodelin後10週間gを観察することができます。腹部大動脈狭窄誘発性心肥大のラットモデルは、病気のメカニズムや病態生理学、ならびに潜在的な治療薬の開発を研究するためのプラットフォームを提供します。

Protocol

全ての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する指針に従って行わ米国国立衛生研究所によって公開（NIH公開番号85-23、1996年改訂）しました。このプロトコルはにより、国立台湾大学の施設内動物管理使用委員会によって定められたガイドラインに基づいて承認されました。

1.動物の手術

1. ホーニング石の上に針の先端を鈍化により、22 G注射針を準備します。ペンチを使用して、直角に針をひだのあります。
2. 手術前に、必要な手術器具や材料、ならびに回復ケージを準備します。使用前にすべての機器および外科用品をオートクレーブ。
3. 200グラムの周りにラットを維持し、食物および水に自由にアクセス制御された温度（21±2℃）で12時間の明/暗サイクルの下でそれらを保ちます。各グループに少なくとも6匹のラットが含まれます。ペントバルビタールでラットを麻酔または別の適切な麻酔薬（0.5ミリリットル、腹腔内を75mg / kg）を。尾の反射をテストすることによって、麻酔の深さを確認してください。
   注：テール反射の欠如は、適切な麻酔の指標です。
4. 体温を維持するために加熱パッドで手術台に仰臥位にラットを置きます。外科的な汚染を避けるために、動物のバリカンヘアリムーバーローションでラットの腹部を剃ります。手術前にベタジンまたは別のクレンジング試薬ときれい-坊主腹部をスクラブ。
   注：これは、作業中は無菌領域を維持することが重要です。
5. メスで、腹部の正中線に沿って2cmの切開を行います。通常の生理食塩水を使用して、手術中に湿った腹部臓器を維持します。後部腹膜領域にある下大静脈を露出させるためにコットンボールを使用して、側に慎重に消化器官を置き換えます。並置され、通常は上にある腹部大動脈を、識別下大静脈の左。
   注：腹部大動脈は、心拍数に合わせて脈動する容器です。
6. 下の血管を明らかにピンセットで腹膜を貫通。静かに腎動脈に隣接する腹部大動脈を隔離し、右の起源と左腎動脈との間に腹部大動脈の下に8センチメートル長4-0絹縫合糸を渡します。
7. 縫合糸と緩い二重結び目を作ります。直径3mmのループを残して、ループ内の鈍化と曲がっ22 G針を配置します。大動脈と針の周りに結び目を締めて、直径0.7mmの収縮を達成するために、直ちに針を取り除きます。
8. 6-0吸収性縫合糸材料と腹腔を閉じます。単純結節縫合で筋肉や皮膚切開を縫合。感染を防ぐために、ヨードチンキで手術部位を洗浄。
9. それは十分な意識を取り戻すまで、自由な移動によって示されるように、慎重に動物を観察しますおよび食物摂取。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。術後の痛みを防ぐために、アセトアミノフェン（0.5ミリリットル中300ミリグラム/ kg、腹腔内）でラットを扱います。
   注：制度的政策によって承認されたように、ユーザは、鎮痛薬を投与すべきです。

2.組織および血液サンプル採取

1. 10週間後の手術では、ラットを計量し、ペントバルビタール（0.5ミリリットル、腹腔内を75mg / kg）で、それを麻酔。手術前に、その尾の反射をテストすることによって、麻酔の深さを確認します。金属製のトレイにラットを置きます。
2. メスを用いて首の正中線に沿って2cmの切開を行います。気管を露出するためにピンセットで慎重に筋肉を変位させます。気管に平行であり、心拍数と時間的に脈動頚動脈を識別するために慎重に観察します。
3. EDTAでコーティングされた採血管に頸動脈から血液を採取します。すぐに遠心分離機2,000×gで15分間、血液および血漿を収集します。必要になるまで-80℃で血漿を保管してください。
4. 剣状突起の正中線の周りに、胸部に5cmの切開を行います。鋭いピンセットでダイアフラムを突き刺します。ハサミを使用して、心臓を露出するために、両側の半ば鎖骨ラインに沿って肋骨を切断して除去します。心臓と血管の境界線に沿って慎重に心を切り出します。組織をつかんずに静かに心を削除します。
5. 灌流針に大動脈トランクを結びつけることによって修正されたランゲンドルフ灌流装置に心をマウントします。クレブス緩衝液で心臓灌流（110 mMの塩化ナトリウム、2.6のKClを含有する1.2mMのKH ₂ PO _4、1.2mMのMgSO ₄を、25mMのNaHCO ₃を、および11 mMグルコース[pHが7.4]）は、血液を洗い流します。心を計量し、心臓重量対体重比を算出します。氷上で4％パラホルムアルデヒドで心臓を修正しました。パラホルムアルデヒド蒸気はTOXであるため、マスクを着用することを忘れないでくださいIC。

3.組織線維症の定量化

1. 組織切片デバイス上でパラホルムアルデヒド固定心臓組織を置き、2ミリメートルの厚さの切片を切りました。包埋カセットに組織切片を置きます。段階的なアルコール浴一連の組織を脱水（50％、75％、95％、1時間毎、100％）。
2. 1時間ワックスに最終的に1時間キシレンで組織に浸潤し。包埋カセットに浸透組織を置き、パラフィンワックスに埋め込むことができます。ミクロトームまで室温でパラフィンブロック中に包埋組織を保管してください。
3. 厚さ4μmの切片に埋め込まれた組織をスライス。 45ºCの水浴中でセクションを配置します。角度で水浴中にスライドガラスを浸し、徐々にスライドへの部分的な付着を可能にするためにパラフィン切片のエッジに近づきます。
4. 組織切片の下で潜在的なエアポケットを除去するために、より良い取り付けを容易にするために、お風呂の中と外にスライドを移動します。ドライトン彼は1時間37ºCでスライドし、組織染色、室温で保管してください。
5. タンクにスライドを置きます。 30分間キシレンでスライドを脱パラフィン化し、最後に蒸留水で（3分間それぞれ95％、75％、50％）を順次希釈アルコールでそれを再水和します。完全に1時間組織切片をカバーするために十分なピクロシリウス赤色の溶液を使用してください。 2変更のための0.5％酢酸溶液中でスライドを洗浄し、その後無水アルコールで2回のすすぎを行います。
6. スライドを空気乾燥し、カバースリップで合成樹脂でスライドをマウントします。可視光フィールドでスライドを撮影。
   注：写真の中の赤い部分は、200Xの倍率で顕微鏡下ピクロシリウス赤のプラスゾーンを示しています。線維症¹¹の程度を示す総面積、オーバーピクロシリウス赤のプラスゾーンの割合を計算します。

4.ブラッドトロポニン定量

1. 血漿トロポニンレベルを定量酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を使用。重複の各サンプルをアッセイ。負荷血漿50μlの、適切なウェルに抗体カクテル50μlの。プレートを密封し、400rpmでプレートシェーカー上で室温で1時間インキュベートします。
   注：血漿中の心臓トロポニンは、心臓傷害のマーカーです。
2. 液体を吸引し、洗浄緩衝液250μlの3回各ウェルを洗浄します。最後の洗浄後、プレートを反転し、過剰な液体を除去するために清潔なペーパータオルに対してそれをブロット。
3. 各ウェルにテトラメチルベンジジン基質100μlを加え、400rpmでプレートシェーカー上で暗所で10分間インキュベートします。各ウェルに停止液100μLを加えます。混合するために1分間プレートシェーカー上でプレートを振ります。 450nmでの光学密度（OD）を記録します。
   注：トロポニン濃度がOD値に比例します。

Representative Results

10週間の腹部大動脈狭窄、手術後、得られた心臓の病状を分析しました。心臓の組織学は、体重に対する心臓重量の比を計算することによって、心臓におけるコラーゲンの量を検出することによって測定しました。心臓の損傷は、プラズマ心筋トロポニンの濃度を測定することにより確認しました。

図1Aに示すように、より高い心臓重量対体重比（ 図1B）、心肥大の指標によって示されるように、心臓の大きさは、腹部大動脈狭窄、手術後に拡大しました。ピクロシリウス赤染色を使用して、増加したコラーゲン含有量（赤）で染色された線維性心筋は、通常領域（イエロー、 図2）から区別することができます。心臓線維症は、Cと比較して、腹部大動脈狭窄手術（ 図2B）の後に増加しました ontrols（ 図2A）。結果は、血漿トロポニン濃度（ 図3）と相関します。増加したトロポニン濃度は圧力の過負荷時の心臓リモデリングと傷害が発生したことを示します。まとめると、明らかに心臓損傷における腹部大動脈狭窄の結果は、心臓肥大、および組織リモデリングをマーク。

図1： 圧負荷時の心肥大 （A）代表心臓と（B）は、心臓重量対体重比は、10週間の腹部大動脈狭窄の手術後に示されています。データが行わ6つの独立した実験の平均±SEMを表します。群間の差は、スチューデントのt検定によって評価しました。 * P <コントロール対0.05。 8fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2： 圧負荷時の心臓線維症。
ピクロシリウス赤染色は増加コラーゲン発現を明らかにしました。 （A）代表ピクロシリウスレッド染色（スケールバー= 200μm）とし、10週間の腹部大動脈狭窄手術後の線維化面積の（B）の割合。データが行わ6つの独立した実験の平均±SEMを表します。群間の差は、スチューデントのt検定によって評価しました。 * P <0.05対対照。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図3： 圧負荷時の心臓損傷。
血漿トロポニン濃度は10週間腹部大動脈狭窄、手術後に測定しました。データが行わ6つの独立した実験の平均±SEMを表します。群間の差は、スチューデントのt検定によって評価しました。 * P <0.05対対照。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G syringe needle	BD Biosciences	309572
EDTA Blood Collection Tubes	BD Biosciences	REF365974
4-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2515N
6-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2150N
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	441244
Acetaminophen	Sigma Aldrich	A7085
Picrosirius red solution	Abcam	ab150681
Cardiac troponin kit	Abcam	ab200016
Imagequant	Molecular Dynamics
Langendorff	ADInstruments	ML870B2