Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man vurdere ekspression af et stort array af gener på den klonale niveau. Single-celle RT-qPCR producerer meget pålidelige resultater med en stærk følsomhed for hundreder af prøver og gener.
Abstract
Genekspression heterogenitet er en interessant funktion til at undersøge i lymfoide populationer. Genekspression i disse celler varierer under celleaktivering, stress eller stimulation. Encellede multiplex genekspression muliggør samtidig vurdering af snesevis af gener 1, 2, 3. På det encellede niveau, multiplex genekspression bestemmer befolkning heterogenitet 4, 5. Det giver mulighed for sondringen af befolkningen heterogenitet ved at bestemme både den sandsynlige mix af forskellige prækursorer stadier blandt modne celler og også de mange forskellige celle responser på stimuli.
Medfødte lymfoide celler (ILC) er for nylig blevet beskrevet som en population af medfødte effektorer af immunresponset 6, 7. I denne protokol, celle heterogenitet ILC hanpatic rum er undersøgt i homøostase.
I øjeblikket er den mest anvendte teknik til at vurdere genekspression er RT-qPCR. Denne metode foranstaltninger genekspression kun ét gen ad gangen. Derudover kan denne metode ikke estimere heterogenitet af genekspression, da der er behov for flere celler til én test. Dette fører til målingen af den gennemsnitlige genekspression af befolkningen. Ved vurdering stort antal gener, RT-qPCR bliver en tids-, reagent-, og prøve-forbrugende metode. Derfor afvejninger begrænse antallet af gener eller cellepopulationer, der kan evalueres, hvilket øger risikoen for manglende det globale billede.
Dette håndskrift beskriver, hvordan encellede multipleks RT-qPCR kan anvendes til at overvinde disse begrænsninger. Denne teknik har nydt godt af de seneste mikrostrømning teknologiske fremskridt 1, 2. Reaktioner, der opstår i multiplex RT-qPCR chips ikke excBehov for nanoliter-niveau. Derfor encellede genekspression, såvel som samtidig multipel genekspression, kan udføres i en reagent-, prøvetagningsmo og omkostningseffektiv måde. Det er muligt at teste celle gen signatur heterogenitet på den klonale niveau mellem celledelmængder i en population på forskellige udviklingsstadier eller under forskellige betingelser 4, 5. Arbejde på sjældne populationer med et stort antal forholdene på enkeltcelle-niveau ikke længere en begrænsning.
Introduction
I løbet af de sidste par år, har medfødte lymfoide celler (ILCs) i stigende grad blevet undersøgt. På trods af deres manglende antigen-specifikke receptorer, de tilhører den lymfoide afstamning og udgør vigtige Skildvagter for vævshomeostase og inflammation. ILCs øjeblikket opdelt i tre grupper baseret på deres ekspression af transkriptionsfaktor kombinationer og deres evne til at producere cytokiner 6, 7.
ILCs bidrager til en lang række homeostatiske og patofysiologiske situationer i forskellige organer via specifik cytokinproduktion 8, 9. For at kunne forstå betydningen af disse celler, er det vigtigt at bestemme de forskellige ILC subpopulationer pr orgel og at identificere deres udviklingsmæssige forhold. Derudover har fænomener af plasticitet mellem de forskellige undersæt været relateret. Ved at studere heterogenitetaf cellerne til stede i et organ, er det muligt at afgrænse deres stadium af modning og til at skelne deres specifikke funktioner.
For at illustrere teknikken med single-celle multipleks RT-qPCR blev hepatiske ILCs udvalgt, med særlig vægt på deres heterogenitet inden for samme ILC gruppe (type 1 ILC) 10. Først ved anvendelse af flowcytometri, blev tre distinkte ILC populationer kendetegnet i leveren. Gruppe 1 ILC udgør ca. 80% af de medfødte effektorer, mens de to andre populationer er sjældne hepatiske ILC populationer (mindre end 5% af de medfødte effektorer). Disse populationer blev sorteret ved hjælp bredt udtrykte celle-overflade markører for ILC befolkninger. Som et resultat, sorteret ILC populationer i leveren ser stort set ens ene til den anden.
Single-celle multipleks RT-qPCR har vist sig som en af de bedste teknikker til straks at undersøge heterogenitet disse populationer 11
Dernæst ved at sortere alle celler med en global ILC fænotype, er en bred oversigt over den multiple-genekspression af leveren ILC befolkninger opnået, selvom de repræsenterer ekstremt sjældne befolkninger. Mikrofluidapparat-baserede chip muliggør eksperimenter med endnuen lille mængde cellemateriale. Som følge heraf kan der opnås genekspressionsprofilerne af sjældne cellepopulationer. Brug online gen signatur analyse software, celle population klynger og potentielle celle relationer kan undersøges. Derfor kan funktionelle tests udføres for at validere clustering data på in vivo-niveau.
Snesevis af genekspressioner kunne vurderes samtidig på flere hundrede eller flere enkelte celler på den samme chip 3, 11, 12. Design af assayet er den længste og vigtigste del af eksperimentet. Bestemmelsen af de gener, der er relevante for den hypotese der skal testes er altafgørende for at opnå relevante resultater. For det andet er der behov for intern kontrol (såsom kendte overflademarkører anvendes til sortering) og specifik kontrol. Dette er afgørende for at teste primeramplifikation specificitet, effektivitet amplifikationen, og than fravær af primer konkurrence. Derfor arbejder med encellede multipleks RT-qPCR er en tidsbesparende teknik, som multiple-genekspression af en celle vurderes samtidig.
Brug den samme chip og blanding af reagenser til alle celler begrænser de mulige fejl manipulation og giver mulighed for reproducerbarhed mellem prøverne. Helt, de forskellige aspekter af encellede multipleks RT-qPCR muliggør fremstillingen af højt pålidelige resultater på den klonale niveau, med en stor grad af følsomhed for en bred vifte af prøver og gener. De opnåede resultater giver kraftfulde og robuste data for biostatistiske tests.
Dette kan opnås på grund af den mikrofluid aspekt af fremgangsmåden, som giver mulighed for arbejde på meget små mængder af materiale og fører til udtømmende resultater. Endelig hjælp af online software, er det muligt at sammenligne de ønskede populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter dyr blev godkendt af af Institute Safety Udvalget for Pasteur i overensstemmelse med det franske landbrugsministerium og EU-retningslinjerne.
1. Forbered en 96-brønds Single-celle Sortering Plate
- Forbered pre-amplifikation mix i et 1,5 ml rør ved tilsætning af 5,0 pi specifik retro-transkription puffer, 1,3 pi lav ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) TE-buffer (10 mM TE, pH 8, og 0,1 mM EDTA-opløsning; 0,2 uM filtreret ), og 0,2 pi Taq DNA polymerase per brønd (figur 1a).
- På en plade med 96 brønde, distribuere 6,5 pi præ-amplifikation mix i hver brønd (op til 48 brønde). Denne plade er den 96-brønd enkelt-cellesortering plade.
BEMÆRK: Brug af en elektronisk pipette anbefales til denne protokol. Det giver mulighed for præcise og reproducerbare målinger volumen og sparer tid.
2. Single Cell Dissociation 3. Single-celle Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) 4. Pre-forstærkning 5. Forbered en 96-brønd Sample Plate 6. Forbered en 96-brønds Assay Plate 7. Single-celle Gene-udtryk Chip 8. Kør Chip 9. Data Analysis 
BEMÆRK: Slutvolumenet i hver brønd i 96-brønds prøveplade bør være 9 pi.
BEMÆRK: Når du bruger almindeligt udtrykte ILC celle-overflademarkører, er 3 befolkninger defineres: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα +, og NKp46 - IL-7Rα +. Alle populationer er sorteret afstamning - CD3 - CD4 - CD45,2 +.
BEMÆRK: Forskellige celletyper kan sorteres på den samme 96-brønds enkelt-cellesortering plade (figur 2).
BEMÆRK: Den korrekte positionering af hver celle på 96-brønds enkelt-cellesortering plade er afgørende. En plade layout bør holdes på et regneark. Pladen layout vil blive anvendt i de næste flere trin (figur 1b) 14. Efterlad en brønd indeholdende 0,2x assay mix og præ-amplifikation mix på 96-brønds prøveplade uden celler. Dette godt anvendes som en no-input kontrol. Efterlad to rækker af 6 brønde for et cDNA fortynding. Disse brønde anvendes som kontroller for primer effektivitet (figur 1b). 
Figur 3: Pre-amplifikation program. For at have nok materiale, er præ-amplifikation af specifikke målgener på sorterede enkeltceller påkrævet. 96-brønds enkelt-cellesortering plade er indlæst på en thermocycler at følge præforøgelsesfasen program. De præ-amplifikationsprodukter fortyndes derefter med lav EDTA TE-buffer og kan anvendes straks eller frosset ved -20 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal.
BEMÆRK: For at undgå gentagen nedfrysning og optøning af primerne, distribuere primere til præ-forstærkning mix og for 96-welll Assaypladen samtidigt.
BEMÆRK: Ingen væske skal spildt over chippen. 
Figur 4: Single-celle multiplex gen-udtryk chip belastning. Disse trin kræver great præcision, især under overførslen af 96 brønde til enkelt-celle multiplex gen-udtryk chip. For at undgå indlæsning af fejl og misplacements, er det stærkt anbefales at arbejde sekventielt. Lydstyrken tages for hver overførsel bør kontrolleres under pipettering processen. Endelig er det vigtigt at undgå eventuelle bobler og fjerne dem i tilfælde af dannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
BEMÆRK: "Standard-10min-Hotstart.pcl" er den mest anvendte program til enkelt-celle multipleks RT-qPCR.
ACt = Ct prøve - Ct intern kontrol
Fold Change = 2 - (ΔCtsample-ΔCtnegative kontrol)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lymfoide populationer vise stor mangfoldighed i genekspression. I denne protokol, blev leveren ILC rum heterogenitet undersøgt ved hjælp af enkelt-celle multipleks RT-qPCR genekspression. I modsætning til andre genekspression teknikker, encellede multipleks RT-qPCR genekspression muliggør arbejde på flere populationer, selv de sjældneste, samtidig. Denne specificitet, kombineret med en høj følsomhed på klonale niveau, giver mulighed for undersøgelse af forskelle i gen signaturer i en befolkning og mellem sjældne populationer. Som et eksempel blev gen-underskrifter 3 ILC befolkninger fra lever fra 4 uger gamle mus vurderes. En befolkning er hyppig nok til at blive let identificeres, mens de to andre er sjældne (mindre end 1% af slægt-negative celler) i leveren.
En 96-brønds enkelt-cellesortering plade og en 96-brønds assayplade blev fremstillet før leveren dissection og dissociation (figur 1). Hver blanding blev udarbejdet under en steril hætte og distribueret med en elektronisk pipette for volumen præcision og reproducerbarhed. Alle reagenser blev vortexet før pipettering at opretholde homogenitet. Efter tilberedning kan den 96-brønd cellesortering plade fryses indtil cellesortering, og den 96-brønds celle assayplade kan fryses indtil IFC loading.
Levere blev dissekeret og dissocieret til enkelt-cellesuspensioner. Celler blev farvet og sorteret på optøede 96-brønds encellede sortering plader. Anvendelse af FACS blev 3 ILC populationer sorteret baseret på bredt udtrykt ILC markører (figur 2). Efter cellesortering blev cDNA syntetiseret, og specifikke målgener blev amplificeret (figur 3 og tabel 2). Efter præ-amplifikation trin blev cDNA fortyndet i lav EDTA TE-buffer. Primere og cDNA fra enkelte celler blev fyldt på IFC chip (Fital 4 og 5a). De opnåede resultater (figur 7a) blev forenklet for lettere læsning og analyse (figur 7b). Eksempler på korrekt eller forkert indlæste chips er vist (figur 5). En FAM figur af en lagt korrekt chip (figur 6) med forskellige amplifikationsfremgangsmåder signaler vises.
Resultaterne viser, at efter korrekt cellesortering, præ-amplifikation og lastning, ILC befolkning forekommer heterogen til genekspression i leveren hos voksne vildtypemus (figur 7). Ved hjælp af online software, celle-specifikke genekspression signaturer (figur 7 og 8) og celle population relationer (Figur 8) kunne identificeres. Hver ordnet befolkning har et specifikt gen signatur beriget i genekspression. For eksempel celler sorteres som NKp46 - IL-7Rα + har enriched ekspression af RORC, den vigtigste transkriptionsfaktor af gruppe 3 ILCs; Rora, en RORC -homologous transkriptionsfaktor; og Il-23R og Cxcr6, to vigtige receptorer i gruppe 3 ILC hepatiske markører i leveren. De samme observationer kan gøres med NKp46 + IL-7Rα - og NKp46 + IL-7Rα + populationer. Hver celle er markeret for rengøring genekspression (HPRT, loven, og GAPDH) for at udelukke ugyldige brønde; mindst to husholdning gener skal udtrykkes til at overveje de værdier som gyldige.
Interessant, denne teknik giver mulighed for definition af to subpopulationer af NKp46 + IL-7Rα - baseret på gen-signaturer. Forskelle mellem de to underskrifter skal valideres af andre sæt af forskellige funktionelle eksperimenter.
![Figur 2]("/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg")
Figur 2: FACS celle strategi. Billeder er repræsentative for isolerede leverceller fra 4 uger gamle mus. (A) FSC-A / SSC-A gating, (b) FSC-H / FSC-W dublet diskrimination, (c, d, og e) i live, slægt-negative CD45,2 + CD4 - CD3 - celler gating. (F) Ved hjælp af bredt udtrykte ILC celle-overflademarkører, vi definerede 3 populationer: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα +, og NKp46 - IL-7Rα +. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: ROX figurer af korrekt (et) Og forkert (b) indlæst chips. (A) Korrekt indlæst encellede multiplex gen-udtryk chip skal vises med lige linjer og rækker. Hver reaktion kammeret er fyldt og har samme dimension. (B) Ukorrekt indlæst encellede multiplex gen-udtryk chip. Tomme linier og rækker af reaktionskamre vises (grøn firkant), samt bøjning linjer (blå firkant). Disse funktioner kan skyldes forkert "PRIME" eller "Load" trin, samt til resterende bobler i IFC brønde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: FAM (fluorescein amidit) figur af en korrekt indlæst chip. Efter nogle få cyklusser (afhængig af prøverne og på primeren s vurderet), bør forskelle i reaktion kammer lysstyrke vises. Reaction kamre med en forstærkning signal skal vises lysere (blå firkant) end reaktionskamre med ingen eller lav forstærkning signaler (grøn firkant). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Heat map opnået før (a) og efter (b) ændringer. (A) Direkte varme map opnås uden analyse eller ændring af assay / prøve orden. (B) Modificeret zonekort opnået efter prøven og assay navn definition. Ingen input brønde (blå firkant) fås hvis ingen amplifikation finder sted. Ineffektive primere (grøn firkant). cDNA fortynding test (lilla firkant). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Single-celle population klyngedannelse. En dataanalyse software anvendes til at bestemme etablering af samarbejde mellem populationer. Gratis klyngedannelse software er tilgængelige online. Ved at vurdere hele ekspressionsprofil af en enkelt celle, kan softwaren vise gen signaturer og cellepopulation relationer. Hvert felt repræsenterer en celle: blå er NKp46 + IL-7Rα -, rød er NKp46 + IL-7Rα +, og grøn er NKp46- IL-7Rα +. Hver population har et specifikt gen signatur. Inden for NKp46 + IL-7Rα - befolkning, kan to underskrifter ses, der attesterer, at befolkningen heterogenitet.4858 / 54858fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
| primere | |
| ACTB | Il-23r |
| Aes | Il-2RA |
| Ahr | Il-2RB |
| Bcl2 | II-7RA |
| c-myc | Klr5 |
| Cbfb | LEF1 |
| CD27 | Ncr1 |
| Cd49a | Nfil3 |
| Cd49b | Notch1 |
| CXCR5 | Notch2 |
| Cxcr6 | Rora |
| Eomes | RORC |
| Ets1 | RUNX3 |
| Foxo1 | Tbx21 |
| GAPDH | Tcf3 |
| GATA3 | Tcf7 |
| GM-CSF | Tle1 |
| Hes1 | Tle3 |
| HPRT | Tsc22d3 |
| ID2 | Tnfrsf11a |
| Il-12rb2 | Tox |
| Il-18r1 | Zbtb16 |
| Il-1rl1 | Zbtb7b |
| Il-22 | |
Tabel 1: Primer liste.
Tabel 2: Pre-amplifikation program. Hvert trin i præ-amplifikation program vises med de fuldstændige oplysninger vedrørende tid, temperatur, og antallet af cykler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man få udtømmende genekspression information på klonale niveau. Her undersøgte vi lever ILC rum heterogenitet. Efter encellede sortering af forskellige ILC populationer (baseret på bredt udtrykte ILC overflademarkører) blev prøver præ-forstærket til specifikke forhåndsudvalgte gener. Derefter blev den opnåede cDNA og primere påsat en multipleks RT-qPCR mikrofluid chip. Endelig opnåede vi ekspressionen af 48 forskellige gener fra 48 enkeltceller. Genekspression resultater blev analyseret via en online software til at undersøge gen signatur og celle population relationer.
Den væsentligste fordel ved denne teknik er muligheden for at vurdere multiple genekspression samtidigt. Det giver også arbejde på klonale niveau, og i meget sjældne populationer. I modsætning til konventionelle RT-qPCR metoder, encellede multipleks RT-qPCR har ingen gennemsnitsberegning effekt, da genekspression vurderes på det klonale niveau. Dermed, Kan påvises og analyseret heterogenitet inden for en population. Single-celle RT-qPCR udtryk tillader arbejde på meget sjældne befolkninger, da kun meget få celler er nødvendige for at opnå bred information om genekspression. Endvidere kan forskellige populationer af celler testes på den samme plade. Dette muliggør påvisning af forskelle i gen signatur mellem befolkninger og med online dataværktøjer, vurderingen af celle population relationer. Denne teknik giver andre fordele. Single-celle multipleks RT-qPCR har den fordel af de seneste mikrofluide fremskridt. Mængderne er nødvendige i IFC kamre ikke overstiger det nanoliter-niveau. Således er lavere mængder af reagenser anvendes, hvilket reducerer omkostningerne til eksperimenter. Endelig er det samlede antal pipetteringstrin reduceret, således at begrænse muligheden for pipetteringsfejl. Trinene er samtidigt for alle cellerne og kan gøres med en multikanalpipette, muliggør arbejde på en hurtig og tidsbesparende måde. Opnåede resultater påden klonale niveau er reproducerbare, pålidelige, og kan bruges til at udføre robust dataanalyser.
Single-celle multipleks RT-qPCR har dog præsentere nogle begrænsninger. Første, denne teknik nødvendiggør dyrt og særligt udstyr, såsom en mikrofluid chip, et mikrofluid chip controller, og en specifik thermocycler. I modsætning til konventionelle RT-qPCR metoder, denne teknik er tids- og reagens-besparelse, eftersom, med konventionel RT-qPCR, er talrige undersøgelser er nødvendige for at opnå statistisk signifikante sammenligninger. I denne protokol, præsenterer vi en procedure for at opnå genekspression i 48 gener. 96-96 multiplex RT-qPCR mikrofluide chips er tilgængelige. Disse chips kan vurdere genekspression i 96 gener fra 96 celler på samme tid. Under cellesortering, er der behov for et antal startende celler minimum, eftersom præcision og celle renhed skal være maksimal. Men selv med et lille antal celler, er det stadig muligt at sortere til enkelt-celle multipleks RT-qPCR gen expression (trin 3). Endelig encellede multipleks RT-qPCR er en følsom metode. Forskellige prøver skal udføres, før du starter sådanne eksperimenter. For eksempel til primer målspecificitet, primere bør testes til amplifikation effektivitet og for den relative konkurrence for målet.
Flere trin i protokollen skal udføres med forsigtighed. De manipulationer af små volumener kombineret med et stort antal prøver og assays samtidig øge risikoen for pipettering fejl (trin 1, 4, 5, 6, og 7). Alle anvendte reagenser og blandinger bør vortexet før pipettering for at sikre en homogen opløsning. Fordampning under pre-forstærkning (trin 4) kan også påvirke de endelige resultater. Pladerne skal altid forsegles korrekt med en passende dækning film. Sortering strategi skal være meget præcis (trin 3) for at undgå døde celler eller flere celler i brønde i pladerne. FACS sorteringsmaskiner er nu udstyret med enkelt-celle sortering index software, der kan optage hvilken specifik celle blev sorteret i hver brønd. Dette nye værktøj vil være af interesse for bestemmelse af, om gen-signaturer er korreleret til celle-overflade markør intensitet. Sample og assay positioner på chips skal tilrettelægges omhyggeligt, da dette er afgørende for eksperimentet (trin 1, 5 og 6). Endelig udvælgelse af primere (trin 1 og 6) er et kritisk trin. Hver primer skal vælges på grundlag af tidligere beskrevne resultater eller forventede resultater. Et tilfældigt valg af primere i sættet af vurderede gener kan forringe den endelige udlæsning af forsøget. Endvidere primere, der korrelerer med celleoverfladen markør anvendes til cellesortering skal anvendes som kontroller med husholdning gener.
Vurdering multiplex genekspression på klonale niveau tilbyder en bedre karakterisering af leveren ILC heterogene rum end i tidligere forskning. Denne teknik, der leveres af online software, beskriver mere præcist different delmængder af ILC i leveren ved homøostase end undersøgelser kun bruger celle-overflademarkører. Endvidere er det muligt at betragte cellepopulation relationer og opbygge differentierings- net. De gen-signaturer, baseret på enkelt-celle genekspression, er også vigtige redskaber til at skelne celle population funktioner og til at undersøge mulige roller. Encellede multiplex RT-qPCR er en af de bedste teknikker til en genekspression assay at få pålidelige data. Disse data er let håndterbare med bioinformatik software 15. Med hensyn til andre teknikker til genekspression undersøgelser, såsom microarrays eller RNA-sekventering, encellede multipleks RT-qPCR tilbyder høj følsomhed. Andre tilgange til enkelt-celle analyse er blevet beskrevet og kan anvendes som komplementære teknikker til enkeltcelle-multipleks RT-qPCR 15, 16. Desuden kan teknikken udføres med enhver primerkombination, allowing-brugere til at se på personlige gen signaturer. Mange andre programmer kan bruges med denne teknik. For eksempel kan tidsforløbet genekspression af celler i hele udviklingen gøres for at vurdere ændringen af den molekylære profil under udviklingen. Lægemiddelvirkninger på celler kan også undersøges med lægemiddel fortynding for at bestemme tærsklen af lægemiddel effektivitet på genekspression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 ml syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fetal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 ml tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1,000 µl tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
