여기에서는 아지드 함유 아미노산을 유전적으로 통합한 후 균주 촉진 아지드-알킨 고리첨가(SPAAC)에 의해 아지드를 화학 프로브와 결합하여 항체 조각에 화학적 프로브를 부위 특이적으로 도입하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
그들의 구조와 기능을 연구하는 단백질로 화학 프로브를 소개 할 수 현재 많은 화학 도구가 있습니다. 유용한 방법은 유 전적으로 bioorthogonal 관능기를 함유하는 천연 아미노산을 도입하여 단백질 결합이다. 이 보고서는 사이트 별 항체 결합에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 아 지드 - 함유 아미노산의 유전자 도입하고, 변형 촉진 지드 - 사이클로 알킨 (SPAAC)에 의한 접합 반응의 실험 세부 사항을 포함한다. 이 변형 촉진 반응은 생리적 pH와 온도에서 반응 분자의 단순한 혼합으로 진행하고, 구리 (I) 이온 및 구리 킬레이트 배위자와 같은 추가의 시약을 필요로하지 않는다. 따라서,이 방법은 일반적으로 단백질 결합 항체 약물 접합체 (ADC)는 개발에 유용 할 것입니다.
서론
대장균에서 P는 -methoxyphenylalanine의 유전 적 결합이보고 된 이후, 한 100 개 이상의 비 천연 아미노산 (UAAs가) 성공적으로 다양한 단백질에 통합되었습니다. 이들 중에서도 UAAs 1-3 bioorthogonal 관능기를 함유하는 아미노산은 광범위하게 연구하고, 최대 비율을 표현하고있다. UAAs에 사용되는 bioorthogonal 기능 그룹은 케톤, 4 지드, 5 알킨, 6 cyclooctyne, 7 테트라, 8 α, β 불포화 아미드, 9 노보 넨, 10 transcyclooctene, 11, 시클로 [6.1.0] -nonyne을 포함한다. 각 작용기는 장점과 단점이 있지만 (11), 아 지드 - 함유 아미노산이 가장 광범위 단백질 접합에 사용되어왔다. P -Azidophenylalanine (AF), 아지도 - 함유 아미노산 중 하나가 용이 가능하며, 그 혼입 efficiency이 우수합니다. 이 아미노산을 함유하는 변이체 단백질은 구리 촉매 고리 화하거나 SPAAC 의해 cyclooctynes ....
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프로토콜
1. 플라스미드 건설
- 그의 6 -tag와 대상 항체 유전자 (pBAD-HerFab-WT)을 표현하는 것 발현 플라스미드 (pBAD-HerFab - L177TAG)를 구축하고, 앰버 코돈과 류신-177의 코돈을 대체 (TAG) 27 사용 종래의 부위 특이 적 변이 법.
재료의 표를 참조하십시오. - 진화의 tRNA 티르와 아미노 아실 tRNA의 합성 (Aars의) 한 쌍의 유전자를 포함하는 또 다른 발현 플라스미드 (pEVOL-AFRS)를 구축합니다. UAAs의 효율적인 통합을 위해 특별히 디자인 된 플라스미드 벡터, pEVOL을 사용합니다. 상세한 정보 및 플라스미드 복제 프로토콜은 이전 보고서에 기재되어있다. (28)
- 시중에서 판매하는 플라스미드 준비 키트를 사용하여 높은 품질의 플라스미드 DNA를 얻습니다. ~ 1.8의 280 분의 260 비율은 정제 된 DNA에 최적입니다. 필요한 경우, DNA의 순도를 확인하는 1 % 아가 로스 겔 전기 영동을 수행한다.
2. 문화 준비
- 전기
- 20 ....
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결과
이 연구에서, 항체 단편은 부위 - 특이 적 단편에 아 지드 - 함유 아미노산을 도입하고, 변형 cyclooctyne로 돌연변이 된 항체 단편을 반응시켜 형광 물질과 결합 (도 1)이었다. HerFab은 AF가 지드 - 함유 아미노산으로 통합되었다하는 대상 항체 단편으로서 선택 하였다. AF로 교체 HerFab 잔사를 선택하려면 HerFab의 X 선 결정 구조 분석 하였다. 잔류 물을 30 중요한 요구 사항은 효율적인 결합 반응에 대한 그것의 결합 친화 감소 및 용매 접근성을 최소화하기 위해 항체 결합 부위에서 충분한 거리를 포함한다. 잔류 물이 잘 항체의 외부로 노출 및 항체 결합 부위에서 멀리 떨어져있는 두 개의 면역 글로불린 도메인의 인터페이스 근처에 위치하기 때문에 위치 177에서 류신은 괜찮은 후보이었다.
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토론
단백질에 비 천연 아미노산의 유전 결합 단백질 변성에 사용되는 다른 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 중요한 장점 중 1-3 하나는 단백질의 종류는 일반적으로 적용됩니다. 원칙적으로, 표적 단백질 및 단백질의 표적 부위를 선택에는 제한이 없다. 그러나 UAA와 구조적 또는 기능적으로 중요한 잔기의 치환은 목적 단백질의 구조와 기능을 변화 될 수있다. 일반적으로, 용매에 노출되는 등 잔류와 상호 작용하지 않는 잔류 물은 UAAs의 통합을 위해 선택된다. 따라서, 고해상도의 결정 구조에서 구조적 정보 UAA 혼입 최적의 위치를 선택하기 위해 사용된다. 30 UAAs의 혼입이 기술적으로 용이하고 간단한 돌연변이가 필요하기 때문에, 여러 사이트가 용이하게 목표 단백질의 원하는 기능을위한 최적의 잔기를 선택 스크리닝 할 수있다.
이 프로토콜에서, AF는 유전자 항체 단편에 도입되어, 돌연변이 단편 SPAAC를 사용하여 부위.......
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공개 사항
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1입니다. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | 원하는 위치에 amber stop codon (TAG)을 선택적으로 포함시킵니다. Ko, W. et al. 균주 촉진 아지드-알킨 순환첨가에 의한 효율적이고 부위 특이적인 항체 라벨링. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A. 및 Schultz, P. G. E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| 에티듐 브로마이드 | 알파 Aesar | L07482 | 1 g |
| LB 육수 | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. 배양 준비 | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm 전극 갭, 50 |
| 암피실린 나트륨 | Wako | 018-10372 | 25g |
| 클로람페니콜 | Alfa Aesar | B20841 | 25g |
| 한천 | SAMCHUN | 214230 | 500g |
| SOC 매체 | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. HerFab-L177AF의 발현 및 정제 | |||
| 3.1 Herfab-L177AF의 발현 | |||
| >p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| 염산, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA 디소듐 염 이수화물, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| 수크로오스 | 시그마 | S9378 | 500 g |
| 라이소자임 | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 | |||
| Ni-NTA 수지 | QIAGEN | 30210 | 25mL |
| 폴리프로필렌 컬럼 | QIAGEN | 34924 | 50/팩, 1mL 용량 |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| 인산나트륨 일염기성, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1kg |
| 염화나트륨, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1kg |
| <강한>4. Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)cy5.5-ADIBO 를 사용한 정제된 HerFab-L177AF와 Alkyne 프로브의 결합 | |||
| ; | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. 라벨링된 HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL 원심 필터 | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μ L 용량 |
| 6. 라벨링된 HerFab 및 형광 겔 스캐닝의 SDS-PAGE 분석 | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10g |
| NuPAGE LDS 샘플 버퍼, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10mL |
| MES 러닝 버퍼 | Thermofisher | NP0002 | 500mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE 젤 | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie 브릴리언트 블루 R-250 | Wako | 031-17922 | 25g |
| Typhoon 9210 가변 모드 이미저 | Amersham Biosciences |
참고문헌
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G.
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재인쇄 및 허가
