Qui vi presentiamo un protocollo per misurare la forza di interazione fra una superficie inorganica ben definita e sia peptidi o aminoacidi mediante spettroscopia forza singola molecola utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM). Le informazioni ottenute dalla misurazione è importante per capire meglio la interfase materiale peptide-inorganico.
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Articolo metodologico
Intuizioni le interazioni di aminoacidi e peptidi con materiali inorganici Uso singola molecola Forza Spettroscopia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le interazioni tra proteine o peptidi e materiali inorganici portano a diversi processi interessanti. Per esempio, combinando proteine con minerali porta alla formazione di materiali compositi con proprietà uniche. Inoltre, il processo indesiderabile di biofouling è iniziata dal adsorbimento di biomolecole, principalmente proteine su superfici. Questo strato organico è uno strato di adesione per i batteri e permette loro di interagire con la superficie. La comprensione delle forze fondamentali che governano le interazioni all'interfaccia organico-inorganico è quindi importante per molti settori della ricerca e potrebbe portare alla progettazione di nuovi materiali per applicazioni ottiche, meccaniche e biomediche. Questo documento illustra una tecnica di spettroscopia di forza singola molecola che utilizza un AFM per misurare la forza di adesione tra entrambi peptidi o amminoacidi e superfici inorganiche ben definiti. Questa tecnica comporta un protocollo per fissare la biomolecola alla AFMpunta attraverso un covalente linker flessibile e misure di spettroscopia di forza singola molecola al microscopio a forza atomica. Inoltre, l'analisi di queste misure è incluso.
Introduzione
L'interazione tra proteine e minerali inorganici porta alla costruzione di materiali compositi con caratteristiche distintive. Questo comprende materiali ad elevata resistenza meccanica e proprietà ottiche uniche. 1, 2, ad esempio, la combinazione del collagene proteina con l'idrossiapatite minerale genera sia ossa molli o duri per diverse funzionalità. 3 peptidi brevi possono anche legare materiali inorganici con elevata specificità. 4, 5, 6 La specificità ....
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Protocollo
1. Tip modifica
- Acquisto nitruro di silicio (Si 3 N 4) cantilever AFM con punte di silicio (raggio sbalzo nominale di ~ 2 nm).
- Pulire ogni cantilever AFM mediante immersione in etanolo anidro per 20 min. Lavaggio a temperatura ambiente. Poi trattare il cantilever esponendoli a O 2 plasma per 5 min.
- Sospendere le punte pulite sopra (3 cm) una soluzione contenente metiltrietossisilano e 3- (amminopropil) triethoxysilane in un rapporto di 15: 1 (v / v) in un essiccatore sotto atmosfera inerte (azoto o argon) e collegare l'essiccatore a una pompa a vuoto. Vuoto per 2 ore per formare un monostrato di ques....
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Risultati
La figura 1 mostra la procedura di modifica punta. Nella prima fase, un trattamento al plasma cambia la superficie della punta nitruro di silicio. La punta presenta gruppi OH. Questi gruppi poi reagire con i silani. Al termine di questa fase, la superficie della punta sarà coperto da free gruppi -NH 2. Queste ammine libere saranno poi reagire con Fmoc -PEG-NHS, un linker covalente. Il gruppo Fmoc del linker PEG viene rimosso mediante pipyridine, un reagente ri.......
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Discussione
I passi 1.3, 1.4 e 1.7 nel protocollo devono essere effettuate con una vasta cura e in modo molto delicato. Nel passo 1.3, la punta non deve essere in contatto con la miscela silano e il processo di silanizzazione deve essere effettuata in atmosfera inerte (umidità libera). 45 Questo viene fatto al fine di prevenire la formazione di strati e perché le molecole di silano facilmente subiscono idrolisi in presenza di umidità. 45
Nel passo 1.4, tem.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Borsa di Reintegrazione Internazionale Marie Curie (EP7). P. D. riconosce il sostegno del Consiglio Israeliano per l'Istruzione Superiore.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nitruro di silicio (Si3N4) AFM cantilever con punte in silicone | Bruker (Camarilo, CA, USA) | MSNL10, raggio nominale cantilever ~2 nm | |
| Metiltrietossisilano | Acros Organics (New Jersey, USA) | Per la silaylazione della punta AFM | |
| 3-(Aminopropil) trietossisilano | Sigma-Aldrich (Gerusalemme, Israele) | Per la silaylazione della punta AFM | |
| Triisopropilsilano | Sigma-Aldrich (Gerusalemme, Israele) | Utilizzato per la deprotezione dei peptidi | |
| N-etildiisopropilammina | Alfa-Aesar (Lancashire, Regno Unito) | Utilizzato per la modifica della punta | |
| Trietilammina | Alfa-Aesar (Lancashire, Regno Unito) | Utilizzato per la punta modifica | |
| Piperidina | Alfa-Aesar (Lancashire, Regno Unito) | Utilizzato per la deprotezione Fmoc | |
| della punta Fluorenilmetilossicarbonil-PEG-N-idrossisuccinimide (Fmoc-PEG-NHS) | Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germania) | Utilizzato come linker flessibile covalente (MW = 5.000 Da) | |
| 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluronio esafluorofosfato (HBTU) | Alfa Aser (Heysham, Inghilterra) | Utilizzato come reagente di accoppiamento. | |
| N-metil-2-pirrolidone (NMP) | Acros Organics (New Jersey, USA) | Utilizzato come solvente nella procedura di modifica della punta | |
| DMF (dimetilformammide) | Merck (Darmstadt, Germania) | Utilizzato come solvente nella procedura di modifica della punta | |
| Cloroformio | Bio-Lab (Gerusalemme, Israele) | Utilizzato come solvente nella procedura di modifica della punta | |
| Etanolo (anidro) | Gadot (Netanya, Israele) | Utilizzato come solvente nella procedura di modifica della punta | |
| Acido trifluoroacetico (TFA) | Merck (Darmstadt, Germania) | ||
| Anidride acetica | Merck (Darmstadt, Germania) | ||
| Peptidi | GL Biochem (Shanghai, Cina). | ||
| Fenilalanina e tirosina | Biochem (Darmstadt, Germania) | ||
| Dispersione del 30% di TiO2 nella miscela del solvente 2-(2-metossietossi) etanolo (DEGME) e dell'etile 3-etossipropionato (EEP) | Applied Vision Laboratories (Gerusalemme, Israele) | (30%) nella miscela del solvente 2-(2 metossietossi) etanolo (DEGME) e dell'etil-3-etossipropionato (EEP). Utilizzato per la preparazione di substrati TiO2 | |
| Substrati di mica | TED PELLA, INC. (Redding, California, USA) | Diametro 9,9 mm |
Riferimenti
- Addadi, L., Weiner, S. Control and design principles in biological mineralization. Angew. Chem., Int. Ed. 31 (2), 153-169 (1992).
- Meyers, M. A., Chen, P. Y., Lin, A. Y. M., Seki, Y. Biological materials: Structure and mechanical properties. Prog. Mater. Sci. 53 (1), 1-206 (2008).
- Villee, C. A. J.....
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Ristampe e permessi
