למרות שתאים פוליפלואידים מתרבים נחוצים לניתוח חוסר יציבות כרומוזומלית של תאים פוליפלואידים, יצירת תאים כאלה מתאים אנושיים שלא עברו טרנספורמציה אינה קלה. הדו"ח הנוכחי מתאר הליכים פשוטים יחסית להקמת תאים טטרפלואידים מתרבים ללא אוכלוסייה דיפלואידית מפיברובלסטים אנושיים רגילים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים פוליפלואידים (בעיקר טטרפלואידים) נצפים לעתים קרובות בנגעים פרה-ניאופלסטיים של רקמות אנושיות וחוסר היציבות הכרומוזומלית שלהם נחשב כאחראי לסרטן ברקמות כאלה. למרות שתאים פוליפלואידים מתרבים נדרשים לניתוח אי יציבות כרומוזומלית של תאים פוליפלואידים, יצירת תאים כאלה מתאים אנושיים שלא עברו טרנספורמציה היא מאתגרת למדי. אינדוקציה של טטרפלואידים על ידי חומרים כימיים מביאה בדרך כלל לתערובת של אוכלוסיות דיפלואידיות וטטרפלואידיות, ורוב המחקרים השתמשו במיון או שיבוט תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה על ידי הגבלת דילול כדי להפריד בין תאים טטרפלואידים לתאים דיפלואידים. עם זאת, הליכים אלה גוזלים זמן ומייגעים. הדו"ח הנוכחי מתאר פרוטוקול פשוט יחסית לגרימת תאים טטרפלואידים מתרבים מפיברובלסטים אנושיים רגילים עם זיהום מינימלי על ידי תאים דיפלואידים. בקצרה, הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: עצירת תאים במיטוזה על ידי דמקולצין (DC), איסוף תאים מיטוטיים לאחר ניעור, דגירה של תאים שנאספו עם DC למשך 3 ימים נוספים, ודגירת תאים בתווך נטול תרופות (הם מחדשים את התפשטותם כתאים טטרפלואידים תוך מספר ימים). בהתאם לסוג התא, ניתן להשמיט את אוסף התאים המיטוטיים על ידי ניעור. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ומעשית להקמת תאים טטרפלואידים מתרבים מפיברובלסטים אנושיים רגילים. תאים טטרפלואידים שהוקמו בשיטה זו יכולים להוות מודל שימושי לחקר חוסר יציבות הכרומוזומים והפוטנציאל האונקוגני של תאים אנושיים פוליפלואידים.
מבוא
Polyploidy נצפתה לא רק ברקמות מקצועיות של מינים יונקים אלא גם במגוון של מצבים פתולוגיים, כגון סרטן ומחלות ניווניות. תאים polyploid (בעיקר tetraploid) הם נצפו לעתים קרובות בנגעים preneoplastic של רקמות אנושיות, כגון נגעים intraepithelial 1,2 או קשקש ושט בארט של 3,4 צוואר הרחם, ואת כבר נחשב כמקור לתאי aneuploid ממאיר ברקמות אלו 5 , 6. למרות זאת הוא הציע מרה של tetraploid לתאי aneuploid יכולה להיות אירוע מכריע בשלבים המוקדמים של tumorigenesis, המנגנונים המעורבים בתהליך זה אינם מובנים במלואם. זה גם בגלל שאין מודל במבחנה כבר זמין שבו תאים אנושיים polyploid nontransformed יכול להפיץ.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבית תאים
- להשיג את התאים כדי לגרום tetraploidy. נכון להיום זה כבר אישר כי טכניקה זו יכולה להיות מיושם על שורות תאים פיברובלסטים האדם TIG-1, ב"ג, IMR-90 ו טלומרז-הנציח TIG-1 (TIG-HT).
- לגדל תאים בינוניים מינימום הכרחי עם שינוי α או בכל מדיום תרבית תאים אחר מתאים לסוג התא להיחקר בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עובר חום מומת (FBS) על ידי דוגרי 5% (v / v) CO 2 אווירה על 37 מעלות צלזיוס. תאים מעבר כל 3 או 4 ימים לא יעלו על צפיפות subconfluent.
הערה: רמת הכפלת אוכלוסייה (PDL) י....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מניסיוננו, תאים TIG-1 יכול להתבצע כמעט tetraploid לחלוטין על ידי טיפול רציף פשוט עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל DC במשך 4 ימים (איור 2 א). לעומת זאת, זנים פיברובלסטים אחרים, כגון ב"ג או IMR-90, ותאי TIG-HT, הפכו תערובת של דיפלואידי ואוכלוסיות tetraploid הבאים אותו הטיפול, ובידוד של תאי mitotic בשיטה שייק פעמי יש צורך במהלך טיפול DC (בדרך כלל 16 - 18 שעות לאחר תחילת הטיפול) (2B הדמוי, C). לאחר טיפול נוסף עם DC במשך.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אחת הבעיות העיקריות אינדוקציה של tetraploidy מתאי דיפלואידי ידי חומרים כימיים, בין אם על ידי מעכבי cytokinesis או על ידי מעכבי ציר, הוא שתאי הופכים לרוב תערובת של אוכלוסיות דיפלואידי ו tetraploid, ותאי tetraploid יש להפריד בין תאי דיפלואידי. רוב הגישות הנפוצות לבידוד תרמי של אוכלוסייה tetraploid ללא תאים דיפלואידי להשתמש FACS או שיבוט על ידי הגבלת דילול. עם זאת, נהלים אלה הם מייגע ולא קלים לביצוע. בדו"ח זה, אנו מציגים פרוטוקול חדש להקים תאים tetraploid שגשוג ללא אוכלוסייה דיפ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרים.
תודות
אנו מודים לגברת מטסומוטו על הסיוע הטכני.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| MEM-ואלפא; | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| תמיסת דמקולצין (10 μ g/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent ערכות BD | Biosciences | #340242 | לבדיקת פלואידיה של DNA על ידי זרימה ציטומטריית |
| כרומוזום אנושי רב צבעוני FISH בדיקה 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | יש צורך בערכת מסננים מיוחדת ותוכנה לניתוח mFISH |
| מערכת הדמיה של Isis עם תוכנת mFISH | יש צורך בערכת בדיקה מיוחדת | MetaSystems |
מקורות
- Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
- Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
