Создание пролиферативный тетраплоид клеток из нетрансформированных фибробластах человека

Краткое содержание

Хотя пролиферативные полиплоидные клетки необходимы для анализа хромосомной нестабильности полиплоидных клеток, создание таких клеток из нетрансформированных клеток человека является непростой задачей. В настоящем докладе описываются относительно простые процедуры создания пролиферативных тетраплоидных клеток, свободных от диплоидной популяции из нормальных фибробластов человека.

Аннотация

Полиплоидные (в основном тетраплоидные) клетки часто наблюдаются в предопухолевых поражениях тканей человека, и считается, что их хромосомная нестабильность ответственна за канцерогенез в таких тканях. Несмотря на то, что пролиферативные полиплоидные клетки необходимы для анализа хромосомной нестабильности полиплоидных клеток, создание таких клеток из нетрансформированных клеток человека является довольно сложной задачей. Индукция тетраплоидии химическими агентами обычно приводит к смешению диплоидных и тетраплоидных популяций, и в большинстве исследований использовалась сортировка или клонирование клеток, активируемых флуоресценцией, путем ограничения разведения для отделения тетраплоидных клеток от диплоидных. Однако эти процедуры являются трудоемкими и трудоемкими. В настоящем отчете описан относительно простой протокол индуцирования пролиферативных тетраплоидных клеток из нормальных фибробластов человека с минимальным загрязнением диплоидными клетками. Вкратце, протокол состоит из следующих этапов: остановка клеток в митозе демеколцином (ДК), сбор митотических клеток после стряхивания, инкубация собранных клеток с ДК в течение еще 3 дней и инкубация клеток в безлекарственной среде (они возобновляют пролиферацию в виде тетраплоидных клеток в течение нескольких дней). В зависимости от типа клеток, сбор митотических клеток путем стряхивания может быть опущен. Этот протокол обеспечивает простой и осуществимый метод создания пролиферативных тетраплоидных клеток из нормальных фибробластов человека. Тетраплоидные клетки, созданные с помощью этого метода, могут быть полезной моделью для изучения хромосомной нестабильности и онкогенного потенциала полиплоидных клеток человека.

Введение

Полиплоидии наблюдается не только в специализированных тканях млекопитающих, но и в различных патологических состояниях, таких как рак и дегенеративные заболевания. Полиплоидных ( в основном тетраплоидных) клетки часто наблюдаются в предраковых поражений тканей человека, таких как рак пищевода ^1,2 или плоскоклеточного интраэпителиальных поражений Барретта шейки ^3,4, и рассматривались как источник злокачественных анеуплоидных клеток в этих тканях ^{5 , 6.} Хотя предполагается, что превращение тетраплоид в анеуплоидных клеток может стать важным событием на ранних стадиях онкогенеза, механизмы, участвующие в этом процессе, полностью не поня....

Протокол

1. Культура клеток

1. Получение клеток, чтобы вызвать тетраплоидия. На сегодняшний день было подтверждено, что этот метод может быть применен к фибробласты клеточных линий человека ТИГ-1, BJ, IMR-90 и теломераза-увековеченную TIG-1 (TIG-ХТ).
2. Рост клеток в минимальной основной среде с модификацией & alpha; или любой другой среде для культивирования клеток, подходящей для типа клеток, чтобы изучаться с добавлением 10% (об / об) инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), путем инкубирования в 5% (об / v) атмосфере СО ₂ при 37 ° С. Прохождение клетки каждые 3 или 4 дня не должна превышать плотность субконфлюентные.
   ....

Результаты

По нашему опыту, клетки TIG-1 могут быть сделаны почти полностью тетраплоид простой непрерывной обработкой 0,1 мкг / мл DC в течение 4 дней (Рисунок 2А). В противоположность этому, другие фибробласта штаммы, такие как BJ или кондиционированной IMR-90, а также клетки TIG-ХТ, стала смесь диплоидных и тетраплоидных популяций следующих той же обработке, и выделение митотических клеток с помощью вытряхиваемого метода необходимо в течение лечения постоянным током (обычно 16 - .......

Обсуждение

Одна из основных проблем в индукции тетраплоидия из диплоидных клеток с помощью химических агентов, либо с помощью ингибиторов цитокинеза или ингибиторами шпинделя, является то, что клетки часто становятся смесью диплоидных и тетраплоидных популяций, и тетраплоидные клетки должны быть отделены от диплоидных клеток. Наиболее распространенные подходы к выделению тетраплоидной населения, свободного от диплоидных клеток используют FACS или клонировании путем ограничения разведения. Тем не менее, эти процедуры являются трудо.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
MEM-α	Sigma-Aldrich	M8042-500ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
FBS	Sigma-Aldrich	172012-500ML
Раствор демеколцина (10 μ г/мл в HBSS)	Sigma-Aldrich	D1925-10ML
BD CycleTES Plus наборы реагентов ДНК	BD Biosciences	#340242	Для исследования плоидности ДНК методом проточной цитометрии
Хромосома человека многоцветный FISH зонд 24XCyte	MetaSystems	#D-0125-060-DI	Необходим специализированный набор фильтров и программное обеспечение для анализа mFISH
Система визуализации Isis с программным обеспечением mFISH	Необходим специализированный комплект щупов	MetaSystems