Dit protocol verschaft een werkwijze voor het verzamelen van muis embryonale stamcellen (mES) -geconditioneerd medium (mES-CM) verkregen uit serum (foetaal bovine serum, FBS) - en feeder (muis embryonale fibroblasten MEF) vrij voorwaarden voor een cel -gratis aanpak. Het kan dienstig voor de behandeling van veroudering en veroudering-geassocieerde ziekten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het verzamelen van serum en Feeder-vrij muis embryonale stamcellen geconditioneerd medium voor een Cell-free Approach
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De capaciteit van embryonale stamcellen (ESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) om verschillende celtypen te genereren, heeft nieuwe wegen geopend op het gebied van regeneratieve geneeskunde. Echter, ondanks hun voordelen, is het tumorigene potentieel van ESCs en iPSCs lange tijd een belemmering geweest voor klinische toepassingen. Interessant is dat aangetoond is dat ESCs verschillende oplosbare factoren produceren die weefselregeneratie kunnen bevorderen en cellulair verouderen kunnen vertragen, wat suggereert dat ESCs en iPSCs ook kunnen worden gebruikt als een celvrije interventiemethode. Daarom is er veel vraag naar de methode voor het verzamelen van muis-embryonaal stamcel (mESC)-geconditioneerd medium (mESC-CM) met minimale besmetting van serumcomponenten (foetaal bovien serum, FBS) en feedercellen (muis embryonale fibroblasten, MEFs). Hier demonstreert de huidige studie een geoptimaliseerde methode voor het verzamelen van mESC-CM onder serum- en feeder-vrije omstandigheden en voor de karakterisering van mESC-CM met behulp van verouderingsgeassocieerde meerdere uitlezingen. Dit protocol zal een methode bieden om pure mESC-specifieke secretoire factoren te verzamelen zonder serum en feeder besmetting.
Inleiding
Het doel van dit protocol is om de muis te verzamelen embryonale stamcellen (mES) -geconditioneerd medium (mES-CM) van serum en feeder-vrije kweekomstandigheden en zijn biologische functies te karakteriseren.
In het algemeen zijn embryonale stamcellen (SER) hebben een groot potentieel voor regeneratieve geneeskunde en celtherapie als gevolg van hun pluripotentie en capaciteit voor zelf-vernieuwing 1-3. De directe transplantatie van stamcellen heeft verschillende beperkingen, zoals afstoting en tumorvorming 4,5. Daarom kan een cel-vrije benadering van een alternatieve therapeutische strategie voor de regeneratieve gen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Een schema van de serum- en voedingsvrije CM collectie protocol wordt weergegeven in figuur 1.
1. Materialen (Voorbereiding van de MEF, Medium, platen, en oplossingen)
- Bereid 500 ml van medium tot de cultuur van de MEF. Aangevuld Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 10% FBS (ESC kwaliteit), 50 eenheden / ml penicilline en 50 mg / ml streptomycine.
- Isoleer MEF uit embryo's na een vaste routine protocol 13 en te onderhouden in MEF medium.
- Bereid 500 ml van medium tot de cultuur van de mESCs. DMEM aangevuld met 15% FBS en 2 mM L-glutamine, 100 uM niet-essentiële amino....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Oorspronkelijk worden mESCs bijgehouden op een MEF feeder in mES medium met FBS en andere supplementen (figuren 1A en 2A). CM werd verzameld mESCs verminderd serum medium zonder voedsterlaag, FBS of andere supplementen (figuren 1B en 2B). Deze cultuur voorwaarde stelt ons in staat om te verzamelen mES-specifieke geconditioneerd medium zonder mogelijke besmetting door de factoren uit de feeder, FBS of andere supplementen........
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Voor de succesvolle collectie van serum en feeder-free mES-CM, moeten de volgende suggesties in overweging worden genomen. De meest kritische factor is het gebruik van vroege passage mESCs voor het verzamelen van mES-CM. Eerder is aangetoond dat vroege passage mES-CM heeft betere anti-aging effect vergeleken met late passage mESCs. De passage aantal mESCs gemeld hun ontwikkelingspotentieel 16 en pluripotentie 17 beïnvloeden.
Terwijl aanvulling behoeft de bijzondere kenm.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door de Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) en de Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) door de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschap, ICT, en Toekomst Planning. Dit onderzoek wordt ook ondersteund door een Start-up exploitatiesubsidie van de Hospital for Sick Children (HK Sung). We willen graag Laura Barwell en Sarah JS Kim bedanken voor hun uitstekende hulp bij het bewerken van dit manuscript en Dr. Andras Nagy voor het verstrekken van de G4 mES lijn.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin en 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
Referenties
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
