(भ्रूण गोजातीय सीरम, FBS) इस प्रोटोकॉल माउस भ्रूणीय स्टेम सेल का संग्रह (mESC) -conditioned मध्यम (mESC-मुख्यमंत्री) सीरम से निकाली गई के लिए एक तरीका प्रदान करता है – और फीडर (माउस भ्रूणीय fibroblasts, MEFs) एक सेल के लिए मुक्त शर्तों मुक्त दृष्टिकोण। यह उम्र बढ़ने और बुढ़ापे से जुड़े रोगों के उपचार के लिए लागू किया जा सकता है।
The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य माउस सीरम और फीडर मुक्त संस्कृति की स्थिति से भ्रूण स्टेम सेल (mESC) -conditioned मध्यम (mESC-मुख्यमंत्री) को इकट्ठा करने और अपने जैविक कार्यों को चिह्नित करने के लिए है।
सामान्य तौर पर, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) उनके pluripotency और आत्म नवीकरण 1-3 के लिए क्षमता के कारण पुनर्योजी चिकित्सा और सेल थेरेपी के लिए काफी संभावना है। हालांकि, स्टेम सेल के प्रत्यारोपण के प्रत्यक्ष ऐसे प्रतिरक्षा अस्वीकृति और ट्यूमर गठन 4,5 के रूप में कई सीमाओं की है। इसलिए, एक सेल मुक्त दृष्टिकोण पुनर्योजी चिकित्सा और उम्र बढ़ने के हस्तक्षेप 6.7 के लिए एक वैकल्पिक रणनीति चिकित्सकीय प्रदान कर सकता है।
बुढ़ापा ऊतकों और अंगों की उम्र बढ़ने, विकास की गिरफ्तारी, बदल सेल फिजियोलॉजी, और व्यवहार का एक स्थायी राज्य की विशेषता के लिए एक सेलुलर समकक्ष के रूप में देखा जाता है। एजिंग कैंसर सहित प्रचलित रोग, हृदय रोग, टी के लिए मुख्य जोखिम कारक है2 मधुमेह ype, और neurodegeneration 8। उम्र बढ़ने के स्पष्ट विशेषताओं में से एक के ऊतकों के पुनर्योजी क्षमता है, जो स्टेम सेल उम्र बढ़ने और थकावट 9 के कारण होता है में गिरावट आई है। कई महत्वपूर्ण अध्ययन में इस तरह के rapamycin 9, resveratrol 10, और मेटफार्मिन 11, और रक्त जनित प्रणालीगत कारकों, अर्थात् GDF11 12, लगातार उम्र बढ़ने में देरी और जीवन अवधि का विस्तार करने की क्षमता है के रूप में औषधीय अणुओं से पता चला है।
वर्तमान अध्ययन में, mESC-मुख्यमंत्री सीरम बिना सीरम कारकों और MEFs से स्रावी कारकों के प्रदूषण को बाहर करने के लिए (भ्रूण गोजातीय सीरम, FBS) और फीडर (माउस भ्रूणीय fibroblasts, MEFs) परतों काटा गया है। इन शर्तों में एक सीरम और फीडर मुफ्त सीएम कि फलस्वरूप mESC-विशिष्ट स्रावी कारकों की सटीक पहचान सक्षम करने के लिए अनुमति दी।
इस प्रस्तावित प्रोटोकॉल अत्यधिक कुशल, अपेक्षाकृत लागत प्रभावी है, और आसान हैसंचालित करने के लिए। इस तकनीक mESC व्युत्पन्न घुलनशील कारकों के लक्षण वर्णन है कि एक विरोधी वार्धक्य प्रभाव मध्यस्थता कर सकते हैं, जो उम्र बढ़ने जुड़े रोगों और अन्य पुनर्योजी के लिए हस्तक्षेप करने की ओर एक सुरक्षित और लाभप्रद संभावित सेल मुक्त चिकित्सकीय दृष्टिकोण के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है उपचार।
सीरम और फीडर मुफ्त mESC-मुख्यमंत्री के सफल संग्रह के लिए, निम्नलिखित सुझावों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण कारक mESC-मुख्यमंत्री के संग्रह के लिए जल्दी पारित होने mESCs का उपयोग कर रहा है। इससे ?…
The authors have nothing to disclose.
इस शोध बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम (2013R1A1A2060930) और मेडिकल रिसर्च सेंटर कार्यक्रम (2015R1A5A2009124) कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन के माध्यम से (एनआरएफ), विज्ञान, सूचना और संचार प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित है, और भविष्य की योजना का समर्थन किया था। इस शोध भी अस्पताल बीमार बच्चे के लिए (एच सुंग) से एक शुरू हुआ ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित है। हम इस पांडुलिपि और डॉ एनड्रास नागी संपादन जी -4 mESC लाइन उपलब्ध कराने के लिए उनके उत्कृष्ट मदद के लिए लौरा Barwell और सारा जे एस किम को धन्यवाद देना चाहूंगा।
DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto |
-mycin. | |||
L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2mM |
Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100uM |
β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100uM |
Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100units/ml |
OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
X-gal | Sigma | #B4252 | 1mg/ml |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5mM |
potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5mM |
NaCl | Sigma | #S7653 | 150mM |
MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2mM |
Mytomycin C | Sigma | #M4287 | 10ug/ml |
Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50ug/ml |
TRIzol | Ambion | #15596018 | |
M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
Bottle top filter, | Corning | #430513 | 0.2μm |