Summary
진핵 세포 발현을 위해 디자인 된 카르복시 말단에 GFP 태그 컨스 부호화 TMEM184A는 혈관 세포에서 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별을 확인하기위한 분석에 사용 하였다.
Abstract
새로운 단백질 선호도 기반 격리 및 생물 정보학 분석을 통해 확인하면, 그들은 종종 크게지지 않은 있습니다. 예측 된 시퀀스 내의 특정 펩타이드에 대한 항체는 일부 현지화 실험을 할 수 있습니다. 그러나, 다른 항체와의 상호 작용에 종종 배제 할 수 없다. 이러한 상황은 단백질 서열 분석에 의존 세트를 개발하기위한 기회를 제공했다. 특히, 단백질의 C 말단에 GFP 코딩 서열에 연결된 유전자 서열을 함유하는 작 제물을 수득하고 이러한 목적으로 사용 하였다. 실험 지역화 리간드 친 화성을 특징, 기능 및 이득은 원래 설계 헤파린 수용체 1과 TMEM184A의 식별을 확인하기 위해 수행되었다. 또한, 막 구조는 토폴로지 질문 상세한 단백질 - 리간드 상호 작용을 어드레싱 연구에 사용될 수있다. 본 보고서는 아칸소를 제공합니다쉽게 다른 새로운 단백질을 위해 적용 할 수있는 혈관 세포에서 발현되는 GFP-TMEM184A 구조를 기반으로 실험 프로토콜의 플랜지.
Introduction
새로운 기능에 대한 후보 단백질의 식별은 종종 부분 서열 결정 하였다 선호도 기반 격리 프로토콜에 따라 달라집니다. 새로 확인 된 단백질의 최근 사례는 횡단 단백질 184A (TMEM184A), 헤파린 친 화성 상호 작용 1 일 이후에 확인 된 헤파린 수용체 및 TgPH1, 포스의 PI (3,5) P (2) (2)를 결합하는 플렉스 트린 상동 도메인 단백질을 포함한다. 다른 신규 한 단백질의 식별은, 등 비타 의한 것과 펩티드의 직접적인 서열 분석을 포함한다. 누가 미리지지 않은 유전자에서 3 단백질 제품을 식별하는 트랜스 펩티드를 사용했다. 이와 유사하게, 신규 한 단백질 서열의 확인은 새로운 4TM 단백질 (4)의 식별 앞서있어서 단백질 패밀리의 검색 생물 정보학을 이용하여 달성 될 수있다. 아쿠아 포린 가족 유전자 서열의 검사 등이있다그래서 새로운 기능 5 새로운 회원의 식별을 얻었다. 식별 한 후, 단백질의 기능 분석은 종종 예컨대 아쿠아 포린 마찬가지로 단백질 기능에 대한 구체적인 분석을 이용하여 조사 할 수있는 다음 단계는 전형적이다.
가능하면, 새로 확인 된 단백질의 기능은 특정 효소 또는 유사한 생체 외 기능 분석으로 관찰 할 수있다. 새로운 단백질의 많은 기능은 체외 분석에서 만 그대로 세포 또는 유기체에서 발생하는 복잡한 상호 작용에 의존하기 때문에 항상 적용되지 않습니다. 그러나, 생체 내 분석은 그들이 유전자 서열에 의존하는 방식으로 설계되어야한다. 세포 배양 및 / 또는 간단한 모델 생물에서 최저 단백질 / 기능 식별 6 뒷받침하는 근거를 제공 할 수 있습니다. 전술 한 바와 같이 식별 된 신규 단백질,이 기능을 확인하기 위해 단순히 단백질 노크 종종 불충분D 유전자 서열에 의존 생체 기능 분석의 디자인은 신규 한 단백질의 특성에 중요해진다.
최저의 식별과 일치하는 결과를 얻었다 후 헤파린 수용체로서 TMEM184A 최근 식별은 친 화성 크로마토 그래피와 MALDI MS 1을 사용하는 (즉, 혈관 평활근 및 내피 세포에서 염증 반응에서 확산 변조), 7은 분석의 컬렉션을 개발할 수있는 기회를 제공 . 최근의 검토 헤파린은 다양한 성장 인자, 이들의 수용체, 세포 외 매트릭스 성분, 세포 부착 수용체와 다른 단백질 8 구체적으로 작용 함을 확인 하였다. 혈관계, 헤파린 및 헤파 란 설페이트 프로테오글리칸에 수백 9 단백질과 상호 작용 (헤파린 유사한 구조 헤파 란 황산 사슬 함유). 기능적으로 그쪽을 확인하려면t TMEM184A는 헤파린 흡수 및 결합에 관여하고, TMEM184A의 유전자 구조를 이용 기술이 개발되었다. 본 보고서는 GFP-TMEM184A에 기초 분석법 모음 헤파린 수용체 TMEM184A 등의 신원 확인에 사용하기 위해 구성 포함한다.
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Protocol
GFP 단백질 구조 1. 디자인
- 구입 또는 설계 및 제작 문제의 단백질에 기초 GFP 태깅 구조.
참고 : 구입 한 구조를 들어, 표준 벡터 일부 또는 다음과 같은 제안을 모두 포함하는 상업 실험실에서 사용할 수 있습니다 : 그것은 막 단백질 인신 매매에 방해가 덜하기 때문에 막 단백질의 경우, GFP의 C 말단 위치를 선택합니다. 관심의 유전자와 해당 단백질의 C 말단이 콤팩트 단백질 도메인으로 접혀 믿을만한 이유가있는 경우 GFP 사이의 확장을 고려한다. 일반적으로 진핵 세포 발현을위한 구조를 선택하지만, 박테리아 시스템에서 생산을 구성 할 수 있습니다. GFP의이 단백질 활성을 방해 할 수있는 몇 가지 실험 GFP 원하는 경우 제거 될 수있는 (예 TEV 단백질 분해 효소에 대한 같은) 절단 부위를 포함한다. 이러한 현지화 또는 선호도에 대한 추가 태그로 다른 삽입 추가고유 상호 작용 (예을 His6). 이는 본원에 기재된 분석에 필요하지했지만, GFP 전에 GFP의 제거가 필요한 경우, 다른 분석을 용이하게하거나, 유전자를 직접 인접 유용하다.
혈관 세포 2. GFP-TMEM184A 식
- 배양 내피 또는 이전에 1, 6, 7보고 된 0.2 % 젤라틴 코팅 된 조직 배양 접시에서 혈관 평활근 세포.
- 5 ㎖ 세포 배양 트립신 용액을 추가 (/ w 0.5 % V)을 세정 100mm, 이상 세포의 합류 접시. 셀이 단지 상기 플레이트로부터 방출 될 때까지 37 ℃에서 인큐베이션하고, 멸균 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에 세포를 옮긴다.
- 트립신의 활성을 제한하는 셀 / 트립신 용액에, 루틴 배양에 사용 된 트립신 억제제 (예를 들어, 일반 배양액의 동일 부피)을 추가한다. approxim에서 5 분 동안 세포 펠렛ately 600 XG (또는 적절한 속도와 시간은 표준 조직 배양을위한 세포 펠렛). 뜨는을 대기음.
- 시각 세포의 양을 제한 HeBS (헤 페스 - 완충 염) 전기 완충액 1 ㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛 또는 현탁액이다. 얼음에 세포 현탁액을 놓고 얼음에 나머지 단계를 수행한다.
참고 : 펠렛 전에 재 부유에 HeBS로 한 번에 세척 할 수 있습니다. - 20 μg의 / ㎖ DNA의 최종 농도를 달성하기 위해 세포에 GFP 태깅 TMEM184A 플라스미드 충분한 볼륨. GFP 구조에 대한 동일한 프로토콜을 사용합니다.
- 일렉트로 큐벳에 HeBS의 셀 솔루션의 약 0.4 mL를 넣습니다. 사용하기 전에 큐벳을 사전 진정.
- 다음 조건을 사용하여 세포를 Electroporate : 지수 형 감쇠 500 μF, ∞ 옴, 170 V.을
주 : 특정 세포 유형에 대한 전압을 최적화한다. 내피 세포와 평활근의 cel와 예비 연구L 타입이 주목 최적의 전압 값, 예를 들어 열을 결정하기 위해 GFP-vinculin 구조로 이루어졌다.- 전기를 최적화하기 위해, (일부 표준 셀 유형에 대한 조건을 포함) 장비 제조업체의 권고로 시작합니다. 원하는 구조 또는 제어 형광 단백질 원하는 구조의 크기와 형광 특성과 유사한 구성 사용한다.
참고 : 작은 핵산 큰 구조보다 더 쉽게 세포를 입력 표시되므로 단지 형광 단백질과 구조는 하나보다 더 많이 표현하기 쉽습니다. - 세포 생존 능력, 형광 구조체 24, 48 시간 후 발현 된 세포의 비율, 그리고 식의 강도를 결정하기 위해 형광 현미경을 사용한다.
참고 : 생존이 낮 으면 약간의 전압 및 / 또는 시간을 줄이십시오. 문화 표면에서 세포의 방출과 반환 사이의 최단 시간 목표문화에 세포의 생존을 향상시킬 수 있습니다. 생존 높고 발현이 낮은 경우 시간 또는 제 2 펄스 약간 증가 구조체 흡수를 향상시킬 수있다. 최적의 조건과 표현은 세포 유형에 따라 다를 것입니다. 구조물을 발현하는 세포의 비율이 높지만, 강도는 강도를 향상시킬 수의 DNA 농도를 증가시키고, 단백질 반감기뿐만 아니라 발현에 따라 달라질 최적 강도 시간 동안 형질 감염된 세포를 모니터링 낮은 경우. 염색 강도 항 GFP 항체로 GFP의 면역 형광 염색에 의해 필요한 경우, 일부 분석을 위해 확대 될 수있다
- 전기를 최적화하기 위해, (일부 표준 셀 유형에 대한 조건을 포함) 장비 제조업체의 권고로 시작합니다. 원하는 구조 또는 제어 형광 단백질 원하는 구조의 크기와 형광 특성과 유사한 구성 사용한다.
- 전기 한 후, 영상 또는 조직 배양 접시로 된 커버와 함께 여섯 30mm 조직 문화 우물에 세포를 시드. 문화 표준 세포 배양 방법을 사용하여 세포.
- 선택 사항 : 모든 HeBS의 전기 버퍼를 제거하기 위해 24 시간 후 배지를 교체합니다.
GFP-TMEM 3. 시각화184A 현지화
- 최소 24 시간 동안 배양 한 후 PBS 부드러운 흔들림로 세포를 씻어. GFP의 퇴색을 방지하기 위해 밝은 빛에 노출을 제한합니다.
- 부드러운 흔들림 함께 RT에서 15 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정한다. 세포를 Permeabilize 하시려면 수있는 메탄올 함유 시약을 사용하지 마십시오. 이 리간드의 상호 작용을 평가하기 위해 필요하지 않은 메탄올로 고정이 사용될 수있다.
주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 주의, 흄 후드에서 사용하고 올바르게 폐기하십시오. - 위와 같이 PBS로 씻어. 항체 기반의 얼룩은 아래 3.6를 참조하십시오.
- 마운트 Mowiol 또는 다른 적절한 장착 매체를 이용하여 커버 슬립을 슬라이드.
- GFP의 여기 및 발광 스펙트럼에 대한 적절한 필터 세트와 공 촛점 또는 형광 현미경을 사용하여 이미지 슬라이드. 초점 현미경이 때문에, Z 평면에서의 샘플을 분리하는 기능이 바람직하다. 한때을위한 그레이 스케일 이미지를 저장TIF 형식으로 antitation 목적으로 (그림을위한 풀 컬러 이미지에 추가).
- 세포에 의해 발현 WT TMEM184A과의 비교를 위해, 예 TMEM184A 서열의 펩티드 (들)로 제조 된 일차 항체를 사용하여 면역 다른 세포를 제조 한. GFP-TEMEM184A 식별은 GFP에 대한 항체를 사용하여 달성 될 수있다. 동일 현미경 기술에 의해 두 세포 샘플을 평가합니다.
4. 로다 민 - 헤파린 GFP-TMEM184A 형질 세포와 바인딩 및 colocalization을
- 배지에 첨가 μg의 100 / ㎖의 헤파린 로다 세포를 GFP-TMEM184A가 발현 치료 및 셀 특정 시간, A7r5 세포 일반적 미만에서 10 분 동안 배양 할 수있다. 헹구고 3.1 및 3.2으로 수정합니다.
참고 : 최적의 시간과 리간드의 농도는 세포 반응을 얻을 리간드와 이미지 강도의 형광 강도에 따라 달라집니다. 이 정광그것은 다른 분석법 (11)이 50 % 이상 반응을 초래하기 때문에 헤파린 이온을 채용 하였다. 이 농도 표준 형광 현미경 기술을 사용하여 시각이므로 그것을 증가시킬 필요가 없었다 수있다. 세포 낮은 형광 라벨이없는 헤파린 결과 로다 민 - 헤파린의 희석, 따라서 이미지와 양을 더 어렵다. - 때문에 GFP - TMEM184A 형질 전환에 결합 로다 민 - 헤파린을 정량 형질 GFP-TMEM184A없이 동일한 세포를 준비합니다.
- 이미지 적절한 GFP (488 ㎚)와 로다 민 (543 ㎚) 여기 및 방출과 함께 공 초점 현미경을 사용하여 세포 (500 - GFP에 대한 530 nm의 로다 민보다 큰 560 ㎚) 값은 공동 현지화를 결정합니다. 통계를 얻기 위해 적어도 세 별도의 실험에서 최소한 50 세포의 이미지를 얻습니다. 실험에서 동일한 설정을 유지하고, 일 (아무 치료 예를 들어, 형질 세포)를 제어 샘플 (들)을 사용에서 여러 실험 분석을 위해 데이터를 표준화하는데 사용될 수있다.
- 결합 정량 각 셀 / 흡수를 결합 상대 로다 민을 결정하기 위해 컴퓨터 프로그램을 사용하여 이미지를 조사한다.
주 :이 분석을위한 편리하고 처음에 그 형식으로 저장되지 않은 경우 많은 컴퓨터 프로그램에 스케일을 회색으로 변환 할 수있는 TIF 이미지를 사용한다. 이미지 J (프리웨어)를 본 분석에 사용하고 공간 및 화소 강도는 이미지의 사용자 정의 된 영역에 대해 측정 할 수 있도록 하였다.- 형광 이미지 내에서 세포에 동그라미를 그리고 그 공간 내에서 강도를 결정하기 위해 측정 도구를 사용하는 자유형 도구를 사용합니다.
주의 : 이러한 측정은 다양한 형상과 다른 셀들과 비교하는 방법을 제공하는 사용자 정의 영역 (전체 세포, 핵 등)의 총 농도를 계산하기 위해 필요한 정보를 제공한다. 배경의 영역에 걸쳐 강도가보고 될 수 있음을 의미하고, 그 용이분석을위한 배경 강도의 컬렉션입니다. - 스프레드 시트로 내보내기 강도를 곱한 면적을 계산하고 지역의 같은 양의 배경을 뺄 수 있습니다. 통계적 유의성을 얻기 위해 충분한 세포 / 실험 형광 / 평균 셀.
- 형광 이미지 내에서 세포에 동그라미를 그리고 그 공간 내에서 강도를 결정하기 위해 측정 도구를 사용하는 자유형 도구를 사용합니다.
로다 민 - 헤파린에 GFP-TMEM184A 5. 형광 공명 에너지 전달
- 형질 전환 된 세포를 준비하고 3.1 200 μg의 / ML의 로다 민 - 태그 리간드와 함께 품어. 형광 리간드와 배양 시간이 셀 타입 의존합니다. 만 PFA로 수정, 및 이미징에 대한 슬라이드를 탑재합니다.
- (-; FRET 685 내지 566) 첫째, 로다 민 방출에 대한 405 nm의 이미지를 흥분. 둘째, GFP (493의 이미지 - 530)에 대한 488에 흥분하고, 셋째, (- 685 566에서 이미지) 로다 민 561에 흥분. GFP-TMEM184A없이 또는 로다 민 - 헤파린없이 컨트롤이 중요하다.
로다 민 - Hepari 6. 라이브 셀 이미징n은 통풍 관
- 라이브 세포 이미징을 위해 설계된 각각의 요리에 GFP-TMEM184A에게 형질 감염된 세포 종자 및 프로토콜 3에서와 같이 취급합니다.
주 : 필요한 세포의 수는 원하는 세포 유형 및 밀도에 의존한다. 세포를 카운트하지 않는, 세포 현탁액에있는 시간의 양을 최소화한다. 여섯 35mm 라이브 영상 접시로 100mm 합류 접시에서 종자 세포는 48 시간 후에 세포를 근처 합류 얻었다. - 48 시간 후, 페놀 레드없는 배지로 배지를 교체한다.
- 온도를 유지하고 현미경을 집중 온난화 단계와 공 초점 현미경으로 세포의 접시를 전송합니다.
- 피펫 100 μg의 / ML의 로다 민 - 헤파린 접시에 가볍게 섞는다.
- 즉시 라이브 영상을 녹화 시작합니다. 헤파린의 어떠한 세포 흡수는 뷰 영역 내에서 발생하지 않으면, 적어도 하나의 녹색 소포는 로다 민 라벨을 함유하는 세포를 식별하기 위해 약간 접시를 움직인다.
참고 : 이미징 여기 및 방출 특성이 있습니다헤파린 흡수 프로토콜 (섹션 5)에 대한 동일. 이미지 간의 시간은 약 16 S이었다. 실험과 현미경의 조건은 일반적으로 화상이 얻어 질 수있는 속도를 결정한다.
배양 된 세포에서 GFP-TMEM184A 및 GFP 7. 분리
- 배양액을 제거하고 PBS로 세척 한 후, 2 ㎖의 0.2 % (대조군 결합 분석 용) GFP-TMEM184A 또는 GFP를 발현하는 세포의 150mm 플레이트 프로테아제 억제제 (w / v)의 CHAPS 1X PBS 용액을 추가한다. , 접시에서 세포를 긁어 얼음에 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 세포 / CHAPS 솔루션을 배치하고 활용하여 잘 섞는다. GFP의 태그 아래의 결합 분석을 위해 표백되어 있는지 확인하기 위해 밝은 빛의 모든 단계를 완료합니다.
- 구체적으로 GFP-TMEM184A (또는 적절한 GFP 제어)를 결합하기 위해, 상기 용액을 2 μg의 / ㎖ 비 오티 닐화 항 GFP 항체를 추가로 요동 4 ℃에서 밤새 배양한다.
- 500 μL를 추가적어도 5 mL의 0.2 % CHAPS / PBS와 원심 분리기 약 3 ~ 5 분 동안 600 XG에 스트렙 타비 딘 - 아가 로스 비드. 뜨는을 제거합니다. 신선한 CHAPS / PBS 때마다 두 번 이상 반복합니다. 항체 및 세포 용액에 구슬을 추가하고 구슬이 GFP 또는 GFP-TMEM184A에 결합 된 바이오틴 방지 GFP 항체에 결합 할 수 있도록 락으로 4 ° C에서 밤새 품어.
- (7.3에서와 같이) 원심 분리하여 구슬을 펠렛과 결합되지 않은 물질을 제거. 씻어 적어도 5 mL의 0.2 % CHAPS / PBS가 / 프로테아제 억제제를 추가합니다. 반복 세척 및 원심 분리 적어도 효과적으로 어떤 언 바운드 단백질을 제거하는 배.
- 최종 세척을 제거한 후, 항체-GFP 바인딩 (무료 GFP-TMEM184A 또는 무료의 결과로 해리 3 분 동안 얼음에 (염산을 사용하여 2.0으로 산도) PBS 0.2 M 글리신 / 0.2 % CHAPS 1 mL의 구슬을 품어 GFP). 매 30 초를 눌러 부드럽게 섞는다.
- 원심 분리는 약 600 × g으로하고, 정제 된 (P)을 함유하는 상등액을 전송할5 ㎖의 1 M 중탄산 나트륨 (7 pH를 가지고)로 즉시 중화 하였다 새로운 15ml를 튜브에 rotein.
- 10,000 달톤의 분자량 컷 - 오프 원심 농축기를 사용하여 샘플을 집중 (공급 업체에서 권장하는 원심 분리 속도를 사용). 용적이 약 0.5 mL의 도달하면, 0.2 % CHAPS / PBS를 추가한다. 집중보다 0.2 % CHAPS를 계속 추가 / PBS 0.2 %의 CHAPS의 최소 10 권 (시간 시작 샘플 볼륨) / PBS가 추가 될 때까지.
- 절연 GFP 또는 GFP 표지 된 단백질의 양의 추정치를 결정하기 위해, 280 nm에서 흡광도 판독을 획득하고 동일한 완충액에 소 혈청 알부민 또는 다른 조절 단백질로부터 제조 된 표준 곡선과 비교.
주 : 흡광 계수의 차이에 의해,이 농도를 추정하지만, 샘플을 낭비하지 않고 추가 분석을 용이하게하기 위해 대략 단백질 농도를 제공 할 수있다. 정확한 단백질 농도를 억제 할 수있다샘플과 동일한 완충액에 표준 단백질을 제조하는 특정하게 마이크로 - 로우리 단백질 검정을 사용하여 채굴. 단리 된 단백질의 추가의 분석은 예상 분자량과 비교 (GFP 항체의 검출을 이용한) 분리 된 단백질을 웨스턴 블로 팅에 의해 달성 될 수있다. 대안 적으로, TMEM184A 항체의 사용은 예측 구조 크기의 밴드 초래해야하지만, 이합체 (또는 고차 올리고머) 샘플에 존재하는 경우 또한 WT TMEM184A 대역에서 발생할 수도있다. 순도의 추정치는 출발 물질의 분취 량에서 전체 단백질 대 샘플로부터 단리 된 총 단백질에 대한 오 염색함으로써 얻을 수있다.
8. 체외 헤파린 결합 분석
- 진탕 200 μL 0.2 % CHAPS로 5 분 / PBS 세 번 세척하여 검은 아비딘 코팅 된 96 웰 플레이트를 준비합니다. 동일한 세정 절차를 이용한 동일한 무도장 블랙 96- 웰 플레이트를 준비한다. 준비합니다(세중에서) 실험 샘플 레이아웃은 분석 기간 동안 수행합니다. GFP의 표백을 확인하기 위해 헤파린없이 표준 헤파린 농도, 버퍼 컨트롤 및 GFP 샘플을 우물 우물을 포함합니다.
주 : 최적화 단리 또는 리간드의 상호 작용 버퍼가 해당 단백질 다른 경우, 최적의 버퍼 시스템 플레이트 제제 및 세정 모두를 수행. - GFP가 원하는 바인딩 아비딘 - 코팅 된 플레이트의 모든 웰에 60 pmol의 / 잘 바이오틴 안티 GFP의 100 μL를 추가합니다. 항체의 양은 단지 웰 높은 친 아비딘을 포화시키기에 충분하다.
- 만 제어 목적에 사용되는 모든 우물 (아무 GFP 또는 GFP-TMEM184A이 원하는 바인딩)에 버퍼를 추가합니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트 커버 웰을 밀봉. 진탕하면서, 실온에서 2 시간 동안 배양.
참고 : 우물과 배양 시간에 추가 볼륨은 공급자의 추천을 기반으로합니다.
- 만 제어 목적에 사용되는 모든 우물 (아무 GFP 또는 GFP-TMEM184A이 원하는 바인딩)에 버퍼를 추가합니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트 커버 웰을 밀봉. 진탕하면서, 실온에서 2 시간 동안 배양.
- 모든 우물을 세 번 씻으200 μL 0.2 % CHAPS / PBS로 5 분.
- 아비딘 - 코팅 된 플레이트에 우물을 적절한 떨고로 실온에서 1 시간 동안 배양 5 nmol의 / 잘 GFP-TMEM184A 또는 GFP의 100 μL를 추가합니다. 8.3로 다시 씻으십시오.
참고 : 단백질이 농도는 모든 사이트가 초과 GFP 또는 GFP-TMEM184A 포화되었는지 확인하기 위해 선택되었다. 이는 동일한 양의 단백질이 각 웰에 결합하는 것이 중요하다. 단백질의 낮은 양 또한 플레이트 단백질의 여러 농도를 배양하고 결합되지 않은 단백질을 비교 분석 리간드 결합하고 남은 미 결합 단백질을 평가함으로써 검사 될 수있는 가능성을 사이트 포화 것이다. - 형광 표지 된 헤파린의 다양한 농도를 준비, 즉, 10, 25, 50, 75, 100, 200 μg의 / ㎖, 0.2 % CHAPS에서 / PBS. 어둠 속에서이 모든 남은 작업을 수행하십시오.
참고 : 이전 농도를 준비에, 다른 리간드에 대한 특정 농도가 PROTEI에 대한 결정되어야한다문제의 n 개의 대상입니다. 가장 낮은 농도는 플레이트 리더 검출해야한다. 따라서, 먼저 사용 된 완충 시스템에서 정확하게 검출 할 수있는 범위를 결정하는 것이 중요하다. 이어서 결합 측정을 얻기 위해 필요한 범위를 결정한다. 10 μg의 / mL의 아래 플루 오레 신 - 헤파린의 농도는 지속적으로 사용 된 버퍼 조건에서 플레이트 리더에 등록하지 않았습니다. 마찬가지로 로다 헤파린 다른 분석에서 예에서 사용 된 반면, 상기 버퍼 상태에서, 플레이트 리더에서 가시화 될 수 있으며, 바인딩에 필요한 농도에서, 표준 형광 측정은 형광으로 재현 한 차이가 없었다. - 모두 아비딘 코팅 및 비 코팅 된 플레이트에 아비딘 - 코팅 된 플레이트와 농도의 표준 우물에 적절한 테스트 우물에 형광 헤파린 100 μL를 추가합니다. 진탕 RT에서 10 분 동안 품어. 어둠 속에서 판을 유지 (또는 호일 포함).
- 판 것이란를 사용하여데르 플레이트와 아비딘 - 코팅 된 플레이트의 초기 형광 (총) 고정화 GFP-TMEM184A와 웰에서 발광 또는 GFP 양의 대조군 웰에 헤파린의 초기 형광 방출을 기록한다. 필요한 경우, 최저 및 최고 농도와 형광 헤파린의 검출을 보장하기 위해 장비 이득을 조정한다.
주 : 플레이트 리더 위에서 우물을 읽고 그 조정의 경우 우물에 최적의 위치에 읽고 특정합니다. 당해 연구를위한 최적의 위치는 웰 아래 약 75 %였다. 플레이트 리더와 함께 사용할 정보 검은 플레이트에 결합 된 시료의 분석을 읽기 위해 문제의 플레이트 리더에 고유 제안을 제공해야한다. - 고정 GFP-TMEM184A 또는 GFP와 우물에서 언 바운드 형광 헤파린을 제거하고 비 코팅 검은 접시에 해당하는 우물에 배치합니다. 바로 형광 방출을 읽어보십시오.
- 신선한 0.2 % CHAPS를 100 μL를 추가 / PBS 다시 INTO 웰 이로부터 형광 헤파린을 제거하고, 형광 발광을 판독 하였다.
- 8.9 배 - 반복 8.8 단계를 반복합니다.
참고 : 코팅 된 플레이트에서이 수치는 GFP 또는 GFP-TMEM184A 우물에 남아있는 형광 헤파린을 나타냅니다. 상당한 형광을 상기 제 3 결합되지 않은 샘플에서 발견되면, 추가적인 세척이 발생한다. 형광 각 세척으로 제거 할 계속되면, 리간드의 결합 선호도가 낮은 수 있습니다 및 조건을 다시 평가되어야한다. 마지막 독서는 결합 된 헤파린 독서를 구성한다. - 각 세척에 대한 번호를 획득 무도장 판에서 제거, 언 바운드, 샘플에서 녹음 형광 방출. 이들은 "언 바운드"수치입니다.
- 각 웰에 첨가 헤파린의 정확한 수준을 확인하기 위해 8.7에서 얻어진 총 헤파린 발광 값을 사용한다. 값에서 평균 배경 판독 값을 뺍니다.
참고 : 웰스 어떤 형광 헤파린없이 때문에 항체, GFP 및 버퍼에 대한 배경 역할을합니다. 결과 평균즉 배경은 배경의 값을 얻기 위해 반복한다. 바운드 및 언 바운드 측정 값에서 빼기 평균 배경 측정 값은 실제 값을 얻을 수 있습니다. - 총 형광 헤파린 헤파린의 양 대 발광의 비율을 결정하기 위해 추가 대 발광의 플롯을 이용한다.
참고 : 항체 단독으로, 또는 항체 및 항원 형광의 일부 담금질의 결과. 따라서, 총 헤파린 8.7에 명시된 바와 같이, 헤파린 첨가 전체에 기초하여 결정 하였다. - GFP의-TMEM184A 케이스와 GFP 경우 모두에서 삼중 대한 추가 헤파린 대 보정 헤파린 결합 플롯.
- 특정 농도에 대한 모든 세척에서 언 바운드 측정 값을 추가하여 무료 리간드를 결정합니다.
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Representative Results
이론적으로, 어떤 DNA의 형질 전환은 친 유성 형질 전환 시약으로 수행 할 수있는 세포로 구성,하지만, 이전 보고서는 GFP의보다 효과적인 형질은 전기 (12)를 사용하여 내피 세포로 구성한다 나타냅니다. 여기서 제공되는 프로토콜은 통상적으로 사용되는 주 유래 내피 세포 및 평활근 세포의 80 % 이상에서 발현은 GFP-구성하였습니다. 고용 구조의 디자인은 빠른 속도로이 구조를 제공 할 수있는 상업적으로 사용할 수있는 시스템을 사용했다. 주요 용도는 최적의 진핵 세포 단백질 발현 및 주요 고려 사항이었다 계속 구조물 생산과 함께 위치 문제, 멤브레인에 따라서 정확한 전달에 집중했다. 포함 할 수 있습니다 기타 고려 사항 : 접힌 영역의 일부인 C 말단, 둘다 특별한 능력이있다 구내의 가능성과 다르게 지역화 된 단백질 또는 단백질에 대한 GFP의 다른 위치NG가 GFP (프로테아제 절단 부위를 추가) 및 2 친 화성 부위를 제거한다. 후자는 GFP 구조체의 정제 및 결합 분석을위한 표면에 안정화시키는 다른 방법을 제공한다. TMEM184A에 대한 다른 상업 항체 염색 패턴을 확인하려면, 혈관 세포 표현 GFP-TMEM184A 상업 항체로 염색 동일한 세포에 비교 하였다. 적어도 72 시간에 걸쳐 축적 등장 GFP-TMEM184A의 형질에 미치는 영향 분배 후 시간의 길이. 형질 최적의 식의 결과 후 시간의 길이는 세포의 종류에 따라 다양하며 각 기술에 최적화되어야한다. 시간이 지남에 따라 더 GFP 레이블은 요정 핵 지역에 있었다. 취급에 따라, GFP 표백도 발생했습니다. 이 결과는 세포 표면에서 TMEM184A 및 항체 염색 (도 1)으로 관찰 현지화 유사한 요정 핵 다른 소포 구조에서 GFP-TMEM184A을 나타냈다. 차 세포에서
형광 리간드 (로다 헤파린)의 사용 시간에 따른 리간드와 수용체의 공동 현지화 평가를 용이하게하고,이 라벨은 가능한 라이브 영상 (도 2, 영화 1)를 수행 하였다. 도 2c는 405 nm에서 흥미로운 GFP 의해 촬상하지만, 로다 민 (중간 화상)으로부터 방출 포착 하였다. GFP 여기는 물론 제한된 방출을 얻었다 405 nm에서 한정되지 않지만, 이것은 로다의 여기 및 거짓 FRET 신호를 방지한다. 마찬가지로, FRET - induc에드 로다 민 방출은 희미했다. 만 로다 민 - 헤파린과 GFP-TMEM184A 식 컨트롤 있지만 로다 민 - 헤파린, 그리고 다른 사람에서 405 nm의 여기에 더 로다 민 방출이 없었다. 이후, 총 GFP (왼쪽 화상) 및 총 로다 민 (오른쪽 이미지) 각각의 형광 물질에 대한 표준 여기 / 방출 파장을 이용하여 측정 하였다. C의 데이터는, 상기 리간드와 GFP-TMEM184A의 공동 현지화를 지원한다. A7r5 세포에 비해 RAOEC에서 로다 민 - 헤파린 흡수는 더 이상 배양이 필요합니다. FRET에 대한 증거는 로다 민 - 헤파린없이 또는 형질 감염되지 않은 세포에서 세포에서 관찰되지 않았다. 이상적인 실험은 리간드와 아무 공동 현지화가 없어야한다 다른 표면 GFP-구조를 포함한다.
취득 또는 기능의 회복은 GFP 단백질 구조와 로다 민 - 헤파린으로 수행 할 수 있습니다. 이 발현 수준과 리간드 공동 증거로 GFP를 사용할 수있는 기회를 제공현지화와 상호 작용을 정량화 할 수 있습니다. 구체적으로는, 헤파린 흡수는 A7r5 셀 (도 3) 형질 구조체 GFP-TMEM184A 증가 하였다. 매우 제한된 로다 헤파린을 차지 안정 최저 셀 1을 제조하고, 이들 함수의 게인이 평가 될 수있는 시스템을 제공했다. GFP-TMEM184A 구조의 형질 다시 야생 형 세포 이상 (그림 3)의 수준에서 로다 민 - 헤파린을 내면화 할 수 세포에서 발생했습니다. "더 헤파린"이미지가 최저 구조에 대한 기자로 GFP를 표현합니까 안정 최저 세포 인 것을 주목해야한다. 표시된 이미지의 관찰 배경 형광이 세포에서 높았다.
이 리간드와 상호 작용하는 다른 단백질의 가능성을 감소시키는 리간드 특이성 결정 용 절연 수용체를 사용하여 일반적으로 도움이된다. GFP-PROTEI의 사용n 개의 구조는 단백질의 분리에 대한 핸들 역할을 할 수있는 GFP 태그로이 점에서 상당한 이점을 제공하고 추가로 단백질과 항체 또는 다른 친 화성 시약의 가능한 상호 작용을 방지 할 수 있습니다. GFP는 세포 집단에서 발현 동일하고 동일한 GFP 연관 절차를 이용하여 분리 될 수있다. 이는 리간드 상호 작용의 연구를위한 조절 단백질을 제공한다. TMEM184A 시스템에서, GFP-TMEM184A는 제어 GFP 모든 헤파린 (도 4)에 결합하지 않은 반면, 항 GFP 항체 친화 절차는 특이 적 결합, 가포 헤파린 초래하여 분리.
일반적으로, 구조에 GFP 태그 단백질의 단부에 배치된다. C- 말단 위치는 막에 올바른 단백질 인신 매매를 용이하게한다. 폴딩 토폴로지가 아닌 경우에 따라서, 멤브레인의 특정 측면에 GFP의 이용은 막 단백질의 특정 토폴로지에 대한 증거를 제공 할 수있다lready 알려진. (예컨대,도 5에서와 같이) GFP에 대한 항체로 면역 염색 단순 비 투과성이 세포에서 항체의 액세스에 기초 GFP의 위치에 대한 증거를 제공 할 수있다. 항 GFP 항체 표백해도 GFP를 인식한다. 도 5에 도시 된 면역 염색은 세포막에서 GFP는 세포임을 예비 증거를 제공하는 GFP-TMEM184A 형질 세포 투과성으로없이 상당한 안티 GFP 염색을 제안한다. 분명히, 소포에서 세포 내 단백질은 또한 투과성이 세포에 염색된다. 도 2c에 FRET 화상이 제안 위상과 일치한다.
그림 1 : 세포에서 GFP-TEMEM184A 현지화는 TMEM184A 지역화 면역 형광에 의해 결정 확인합니다. A) BAOECs GFP-TMEM1로 형질84A는 4 % PFA로 고정되었다. Nontransfected 세포 중 얼음처럼 차가운 메탄올 (메탄올) 고정 및 permeabilization 또는 4 % (언급 한 바와 같이) 트리톤 X-100 permeabilization 다음 PFA로 처리 하였다. nontransfected 세포 TMEM184A (CTD)로부터의 C 말단 펩티드에 대한 항체 또는 TMEM184A (NTD)로부터의 N 말단 펩티드 TRITC 태그 보조 항 - 토끼 항체를 사용하여 염색 하였다. B) 클로닝 (A7r5 예) 및 차 (BAOSMC) 평활근 세포 유사하게 처리 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 로다 민 - 헤파린과 GFP-TMEM184A의 영상. A) GFP-TMEM184A와 일렉트로 A7r5s은 100 μg의 / ML의 로다 민 - 헤파린 처리 하였다시간이 표시된 후 4 % PFA로 고정. 이미지는 두 개의 실험을 대표한다. B) A7r5 세포는 GFP-TMEM184A와 로다 민 - 헤파린은 즉시 라이브 영상과 함께 추가 된 형질했다. 영화의 선택된 프레임 흰색 수직 막대가 로다 민 - 헤파린을 포함하는 GFP 입히는 소포의 초기 위치 파악을 가리키는 함께 표시됩니다. GFP의 라벨과 로다 민 함께 이동합니다. 스케일 바는 2 μm의 =. (A)에로 처리 C) RAOECs 프로토콜 3.5 참조 표준 설정에 대한 FRET 405 (GFP에 의한 흥분 형광 공명 에너지 전달을 위해 묘화)와 비교 하였다. 패널 A와 B의 두 시점은 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. 퓨, RP는 등. 1. 저작권 생화학 및 분자 생물학을위한 미국 사회. V 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 서평.
그림 3 : GFP-TMEM184A 형질이 기능의 게인을 제공합니다. A) 대폭 로다 헤파린의 낮은 수준은 예를 들어 이미지를 참조 야생형 A7r5s에 비해 안정된 최저 A7r5 세포에서 볼 수있다. 은 "더 헤파린"이미지 구조의 존재의 마커로서 GFP를 표현 안정적인 최저 세포이다. 스케일 바는 10 μm의 =. 모두 야생 형 및 안정적인 최저 세포에 GFP-TMEM184A의 B) 형질은 크게 3 개의 독립적 인 실험에서 / 조건 50 개 이상의 세포의 분석을 기반으로 이러한 세포의 로다 민 - 헤파린 신호를 증가시킨다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. Tukey의 테스트에 기초하여 p <0.0001. 이 그림은 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. 퓨, RP는 등. 1. 저작권 생화학 및 분자 생물학을위한 미국 사회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : GFP-TMEM184A 귀속 헤파린입니다. GFP-TMEM184A 또는 GFP 분리하고 아비딘 - 코팅 분석 플레이트에 결합했다. 플루 오레 신 - 1.111 nmol의 헤파린을 0.056 nmol의 농도로 첨가 하였다. 헤파린 519 nm에서 방출을 측정함으로써 결정 하였다 바인딩. GFP-TMEM184A (사각형). GFP 제어 (원). 이 그림은 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. 퓨, RP는 등. 1. 저작권 생화학 및 분자 생물학을위한 미국 사회. "_blank>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : GFP-TMEM184A과 막 토폴로지. GFP-TMEM184A 형질 세포 중 4 % PFA (위)와 고정 또는 4 % PFA로 고정 트리톤 X-100 (아래)를 사용하여 투과성이되었다. 세포는 안티 GFP 차 항체를 Cy3 표지 이차 항체와 동일하게 염색 하였다. 스케일 바는 10 μm의 =. 두 개의 서로 다른 실험이 표시됩니다. 보조 전용 염색 된 세포는 본질적으로 염색을 보이지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PLOAD / 55053 / movie.mp4 "대상 ="_ 빈은 "> 영화 1 :.. 로다 민 - 헤파린과 GFP-TMEM184A의 라이브 영상 (마우스 오른쪽 클릭하여 다운로드) A7r5 세포가도 2b에서와 같이 처리 한이 영화는 GFP-을 보여 TMEM184A와 함께 이동 상단에 로다 민 - 헤파린 소포. 영화의 병합 된 버전에 추가하여 별도의 컬러 버전. 도시 GFP와 소포 및 포함 로다 민은 원으로되어있다.
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Discussion
여기에보고 된 프로토콜은 혈관 세포 1 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별 확증 증거를 제공하도록 설계되었다. 최저 기술은 정기적으로 신규 단백질의 식별을 확인하기 위해 하나의기구로 사용된다. 그러나, 최저 후 일부 기능적 손실 후보 단백질 실제로 정확한 수용체 충분한 증거 (또는 다른 기능성 단백질)은 일반적 아니다. 이는 후보 단백질이 실제로 기능을 발휘한다는 증거를 갖는 것이 중요하다. GFP 태그 새로운 유전자에 대한 구조를 채용하는 기능 실험의 이득을 가능하게하고 GFP 선호도에 따라 태그 단백질의 분리를 용이하게한다. 이 프로토콜에서 사용되는 전기가 (셀의 80 % 이상이 구조를 나타냄) 구조체의 매우 높은 형질 전환 효율을 용이. 일렉트로 사용할 여부를 원하지 않는 경우에는, 다른 형질 전환 메커니즘이 사용될 수있다. 신규 단백질의 기능을 확인하는 GFP 태깅 구조를 선택하는 여러 가지 이점이있다. 우선, GFP는 형질 전환 유전자 발현에 대한 리포터로서 작용하며, 단백질의 발현이없는 세포주를 사용할 수없는 경우가 과발현 GFP를 통해 모니터링 할 수있다. 둘째, GFP 태그 펩타이드 리간드에 대하여 하나의 친 화성 또는 항체에 의존하지 않는 단백질을 정제하기위한 도구를 제공한다. 셋째, GFP 태그는 실제 유전자 생성물 마찬가지로 국소 여부를 결정하기 위해 표적 단백질 서열의 펩타이드 고유 대해 생성 된 항체를 사용하여 시각 복잡한 면역 현지화를 조사하기위한 도구를 제공한다.
유전자 구조와 기능 분석의 게인 신규 단백질 기능 (13)의 식별을위한 높은 처리량 스크리닝을 포함한 다수의 목적을 위해 사용되고있다. 이상적으로, 기능 분석의 이득은 잘 연구 복제 셀 리튬을 사용하는 것당해 유전자 (세포가 여전히 새로 발현 유전자의 기능을 허용 유전자 산물 협력 표현한다) 표현하지 않는 NE. 본 분석에서와 같이, 특정 태그가 GFP 구조체를 사용하면되는 GFP 단백질이 기능 할 수있는 셀을 사용하는 것이 중요하다. 따라서, 셀의 선택 기능이 정상 협력 단백질이 존재할 수 있도록 발생되는 세포 유형에 확률 함수에 의존. GFP 태그는 GFP 표지 된 단백질의 형광 분석 기능의 일부로서 따라야 할 경우에 감시 기능의 부가 방법을 허용 (예컨대,도 2 및도 3 참조). GFP는 어떻게 든 단백질의 기능을 변경하는 경우 이러한 연구에 대한 한 가지 제한이 될 것이다. 단백질의 C 말단에 GFP를 연결함으로써, 단백질의 대량 이미 명백한 기능 변경없이 연구되어 왔지만, 이러한 가능성이 존재한다.
Radioisotopica에서야 베드로 표시 리간드는 종종 그대로 전지 (11)에 결합하는 리간드를 연구하는 데 사용되었다. 그러나 이러한 분석은 결합 후 리간드 위치의 간단한 결정을 할 수 없으며 본 보고서에서와 같이 함께 리간드와 수용체의 비교를 용이하게하지 않습니다. GFP의 구조는 여기에 표지 된 막 단백질을 조사하도록 추가의 기회를 제공한다. 때문에 GFP 태그의 C 말단의 위치, 분석 걸쳐 형질 감염된 세포에서 GFP 태그의 위치를 검사 할 수있다. GFP 항체를 사용하여 면역 형광 (그림 5)와 permeabilization없이 항체에 액세스 할 GFP의 비교를 할 수 있습니다. GFP-TMEM184A의 추가 응용 프로그램은 로다 민 - 헤파린 (그림 2)와 colocalization을 같이 GFP 영상을 활용. 도 2c에 도시 된 바와 같이 로다 헤파린을 가진시키기 위해 GFP에서 발광을 허용 FRET를 이용하여 결합 및 세포 TRA 평가 흥미로운 방법을 제공한다fficking. 또한, 데이터가 GFP는 여기를 전송하는 로다 민 - 리간드 (10 나노 미터 이내) 충분히 가까이 있음을 나타냅니다 FRET. 리간드 작품 GFP에서 이러한 전송이 테트라 메틸 로다 민 (14) 태그 부갑상선 호르몬 출판 된 것을 증거. 대안 FRET 기술 (사진 표백 및 / 또는 컴퓨터 기반 이미징 패턴)도 여기에 예로서 도시 된 것보다 더 복잡한 분석을 위해 사용될 수있다. 마찬가지로, 후보와 다른 단백질의 상호 작용은 Albertazzi 등의 알에 의해보고 된 EGFP / mCherry 시스템으로 FRET에 최적화 된 형광 태그 FRET를 사용하여 검사 할 수 있습니다. 칼륨 채널 왕에 의해 연구와 동료들 (16)에 사용되는 (15) 및 CFP / YFP 및 GFP 쌍. 많은 새로운 작은 형광 분자는 예 (17)을 위해 설계되고있다. 이러한 분자는 GFP 표지 된 F 단백질과의 상호 작용을 FRET 경우의 수를 증가luorescent 리간드를 조사 할 수있다. 앞으로의 연구는 또한 구조는 유전자 기능의 순서 특정 측면을 결정하는 데 도움이 허용하는 유전자에 대한 변경 사항을 대상으로 포함 할 수있다. 단백질의 C 말단이 통상 내부 때 GFP 표지 된 막 단백질에 대한 하나의 제한이있다. 이러한 경우, 수용성 형광 리간드 분석이 가능하지 않을 수 FRET. 그러나, 다른 메커니즘은 여전히 단백질을 위해 할 수 있습니다 다른 구조물에 GFP를 배치하고, 여기에보고 된 다른 분석은 여전히 사용될 수있다.
GFP의이 단백질의 공정한 분리 가능하고 여기서 함수 지역화 및 생체 리간드 상호 작용 또한, GFP 표지 된 단백질은 항 GFP 항체 및 시험 관내 분석에서 이용하는 기능을 검사하기 위해 사용되는 절연 된 단백질을 사용하여 단리 할 수있다 비교적 격리 제어 (무료 GFP). 함께 이러한 분석은 일을 증명하는 데 필요한 강력한 추가 증거를 제공 할 수 있습니다후보 단백질 기능에 가설있다.
GFP는 조밀 한 구조 (18)로부터 멀리 연장 부위로 변성하지 않는 프로테아제 내성이기 때문에 또한, 세포의 제한 프로테아제 처리는 GFP 세포를 분리한다. 프로테아제 절단은 GFP 것은 부착 된 단백질 또는 설계 결합 영역에서 발생하는 것이다. 출시 된 제품은 GFP 서열 N- 말단 연장과 GFP 것입니다. 단백질의 C 말단이있는 GFP하여 부착하는 경우 트립신은 세포가 GFP를 공개해서는 안된다. 잠재적 인 제품의 예비 분석 트립신 발표 한 GFP 태그가 단백질 명확한 분자량 패턴을 제안 할 수있다. 많은 막 단백질의 경우, 이러한 기술은 그 GFP의 방출, 또는 부족에 의한 막 토폴로지에 대한 명확한 증거가 될 것입니다.
함께, 구체적인 분석이 제시 및 / 또는이 보고서에서 제안 된 기술 t의 다양한 샘플링을 제공모자는 형광 태그 구조로 시작하여 신규 한 단백질을 검사하는데 이용 될 수있다. 이러한 구조는 쉽게 시중에서 구할 수있다. 기술의 광범위한 사용할 수있는 기회는 제한된 예산에 아주 작은 실험실 그들을 경제적으로 가능합니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (PFA, methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96-well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in Figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in Figure 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35-mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm - C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10x solution |
References
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