Summary
Последовательные криопроводники секции собираются для того, чтобы гистологические приложений и обогащение РНК для измерения экспрессии генов с использованием соседних областей от одной мыши скелетных мышц. Высококачественная РНК получают из 20 - 30 мг объединенных криосрезах и измерений непосредственно сопоставлены между приложениями.
Abstract
С помощью этого метода последовательных криосрезы собираются для того, чтобы обе микроскопии приложений для гистологического исследования тканей и обогащения РНК для экспрессии генов с использованием соседних регионов от одной мыши скелетных мышц. Как правило, это является сложной задачей для достижения адекватного гомогенизации небольших образцов скелетных мышц, поскольку объемы буфера может быть слишком низкой для эффективного применения шлифования, но без достаточного механического разрушения, архитектура плотной ткани ограничивает мышцы проникновения буферных реагентов, в конечном счете вызывает низкий выход РНК. Следуя протоколу, которые сообщаются здесь, 30 мкм срезы собирают и объединяют позволяя cryosectioning и последующее игла гомогенизация, чтобы механически разрушить мышцы, увеличивая площадь поверхности, обнаженную для проникновения буфера. Основные недостатки метода является то, что она требует криостат, и она является относительно низкой пропускной способностью. Тем не менее, высокого качества РНК могут быть получены из небольших образцов объединенном мuscle криосрезы, что делает этот метод доступным для многих различных скелетных мышц и других тканей. Кроме того, этот метод позволяет совпадающая анализы (например, гистопатологии ткани и экспрессии генов) из смежных областей одной скелетной мышцы так , чтобы измерения можно непосредственно сравнивать между приложениями для уменьшения экспериментальной погрешности и для снижения репликативные экспериментов на животных необходимо источник небольшую ткань для несколько приложений.
Introduction
Целью данной методики является сделать несколько экспериментальных анализов с помощью различных методов, таких как выражение гистологии и генов, доступных из одного небольшого скелета источника мышечной ткани. Микроскопия приложения являются наиболее чувствительными к образцу методов сохранения, которые необходимо тщательно контролировать, чтобы ограничить образование кристаллов льда артефактов во время криоконсервации. Таким образом, развитие метод основан на передней большеберцовой (TA) мышца замороженные частично покрыта встраивание смолы в охлаждаемой жидким азотом 2-метилбутан ванны -140 ° С в качестве исходного материала для обоих иммунофлюоресценции микроскопии и анализа экспрессии генов.
Необходимость использовать один и тот же исходный материал для различных технических подходов особенно важно для внутримышечных инъекций экспериментов на основе которых левые и правые мышцы представляют различные условия, одно экспериментальное и один элемент управления. Например, в исследованиях регенерации мышц, один мюSCLE вводят токсин , чтобы вызвать повреждение тканей широко распространенное в то время как контралатеральной мышца служит в качестве транспортного средства с впрыском контроля 1. Точно так же исследования генной терапии для мышечных нарушений , как правило , начинают с проверки вектора генной терапии путем внутримышечной инъекции в сравнении с пустым вектором, не связанного вектора или управления транспортным средством на контралатеральной стороне 2. Таким образом, не представляется возможным источником каждой ТП мышцы на другое приложение.
Общие стратегии борьбы с этой проблемой являются: я), чтобы использовать другую группу мышц для каждого приложения, б) использовать дополнительные мышей, или III), чтобы отрезать кусок мышцы для каждого приложения. Тем не менее, существенные различия между группами мышц затрудняют сравнение данных из отдельных приложений, а также дополнительные животные увеличивают расход и плохо обоснованным, если существуют другие альтернативы. Разделив мышцы после рассечения на источник различных приложений является наилучшим вариантом яп много случаев. Тем не менее, мышечные части часто слишком малы , чтобы использовать размельчение под жидким азотом или механическим методам заточной для гомогенизации 2-5. Как мышца является высокоэффективным структурным ткани упакованы с внеклеточным матриксом и сократительных белков, неадекватной механической гомогенизации приводит к низкому выходу последующей ДНК, РНК или белка. Подробно здесь метод позволяет небольшое количество ткани от одного источника мышцы для использования в различных приложениях, а также включение cryosectioning и иглы растирание улучшает механическую гомогенизацию для лучшего выхода РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных были одобрены Университета Джорджии Institutional уходу и использованию животных комитета при использовании животных протокола A2013 07-016 (Бидл).
1. Криоконсервация нефиксированной скелетных мышц
- подготовка
- Вырежьте пробки на небольшие квадраты (примерно 1 см х 1 см) с лезвием бритвы, писать на пробке с тонким наконечником маркера, который устойчив к 2-метилбутана для идентификации источника мыши и мышцы, и сделать очень неглубокий порез (примерно 1 мм) по всей верхней поверхности. Вставьте пластиковую покровное в разрез, чтобы использовать для ориентации ткани. Повторяйте, пока пробка не будет готова к каждой ткани, чтобы быть криоконсервации.
- Получение жидкого азота, 2-метилбутан, встраивая смолу, низкотемпературный термометр, Пробки, рассечение инструментов, и изучение мыши.
ВНИМАНИЕ: Жидкий азот представляет собой сжатый газ , который при нагревании может взорваться. Носите лабораторный халат, низкотемпературные перчатки и средства защиты лица при обращении с жидкостью пTrogen; контакта с кожей или глазами может вызвать ожоги или обморожения. 2-метилбутан является легковоспламеняющийся, токсичный, здоровье и опасность для окружающей среды. Использовать средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки, защитные очки), откройте фондовый контейнер в вытяжном шкафу, передавать небольшое количество, необходимое для замораживания (как правило, от 200 до 400 мл) в отдельный контейнер, который может быть плотно закрыты, и избегать вдыхания , - Эвтаназии мышей с утвержденным методом эвтаназии под анестезией. Если коротко, то вставить мышь в ингаляционную камеру с 2,5% изофлуран в кислороде из изофлурановым испарителем, подождите, пока 20 секунд после того, как мыши не перестанет двигаться, чтобы проверить наличие рефлекса педали. Когда рефлекс педали отрицательный, эвтаназии исследовании мыши по цервикальной дислокации 6.
Примечание: Эвтаназия методы требуют одобрения комитетом по институциональной этике. - Удалить кожу, перекрывающую дистального задней конечности и сократить дистальных передних сухожилия чуть выше лодыжки с тонкой точкой Диссефикция ножницы. Возьмитесь дистальные сухожилия с тонким пинцетом и осторожно потяните вверх и в сторону коленного сустава при одновременном сокращении боковой фасции, чтобы освободить мышцы. Потяните мышцы из перпендикулярно от колена и сделать окончательный разрез акцизными ТА мышцы 7.
Примечание: Мышца ТА используется здесь в качестве примера, но любая мышь скелетных мышц или сердце может быть заменен на ТП в данном протоколе, если это соответствует экспериментальным целям пользователя. Единственным ограничением является то, что ткань должна быть достаточно мала, чтобы добиться быстрого криоконсервации всей его глубине; Рекомендуется максимальный размер ткани размером 1 см х 1 см. - Повторите на противоположной ноге, и рассекать любые другие ткани, которые будут собраны. Выполнение рассечение как можно быстрее, чтобы ограничить деградацию тканей перед тем криоконсервации.
- Orient каждая мышца для поперечных сечений по ее предварительно меченных пробки. Stand мышцы перпендикулярно к пробке с дистальным сухожилием касаясь пробку и верхнюю часть мышц добзаканчивая далеко, в вертикальном положении на покровное.
- Криоконсервируют все ткани для гистологического анализа как можно быстрее после вскрытия, предпочтительно в течение 5 мин, но определенно не более чем на 15 мин время, прошедшее с euthanization исходного животного.
- Криоконсервация
- Начало охлаждения криоконсервации ванну пять минут до конца рассечение. Залить 2-метилбутан в сообщение стакане открытой металлической на глубину около 3 см. Налейте жидкого азота в изолированный контейнер на глубину от 2 до 4 см. Установите мензурку 2-метилбутана в жидкий азот; азот закипит. Избегайте разбрызгивания азота в стакан 2-метилбутан.
ВНИМАНИЕ: Подготовить замораживании ванну в вытяжном шкафу или хорошо проветриваемом помещении. - Вставьте низкотемпературный термометр в 2-метилбутана для контроля температуры и часто размешать с вилкой, чтобы обеспечить равномерное охлаждение. Продолжайте перемешать и охладить до 2-яthylbutane достигает -140 ° C, при добавлении нового жидкого азота к внешней ванны по мере необходимости.
Примечание: -140 ° C является оптимальной температурой для минимизации кристаллов льда артефактов в полосатых мышц; другие ткани могут криоконсервируют лучше всего при различных температурах (например, мозга, -90 ° С). - Применить вложение смолы только к нижнему 35 - 50% мышцы, где она встречает пробку и сразу же падение пробку в 2-метилбутана при -140 ° C. Быстро повторяют до 8 тканей на замораживание партии. Перемешивают в течение 30 сек, очищая дно стакана, чтобы гарантировать, что ткани не замерзают в затвердевающий 2-метилбутана.
- Используйте вилку, шумовкой или больших щипцов, чтобы вытащить каждую пробку ткани из 2-метилбутана. Быстро удалить покровное, промокните избыток 2-метилбутан в стакан, а затем опустить пробковой ткани в ванну наружного азота. Повторите эти действия для всех остальных пробками в стакане.
- Образцы переноса в жидком азоте или на сухом льду до-80 ° C морозильник для хранения.
- Если какие-либо ткани остаются для криоконсервации, повторите шаги 1.2.3 1.2.4. Добавить еще 2-метилбутан в стакан или жидким азотом до внешней ванны по мере необходимости и повторное охлаждаться до -140 ° С. Утилизировать используется 2-метилбутана как опасные отходы.
- Начало охлаждения криоконсервации ванну пять минут до конца рассечение. Залить 2-метилбутан в сообщение стакане открытой металлической на глубину около 3 см. Налейте жидкого азота в изолированный контейнер на глубину от 2 до 4 см. Установите мензурку 2-метилбутана в жидкий азот; азот закипит. Избегайте разбрызгивания азота в стакан 2-метилбутан.
2. Собрать криосрезах для гистологического и РНК-приложений
- Приготовление.
- Предварительно взвешивают ДНКазы / РНКазы автоклавного трубки на аналитических весах. Затем переместите его в криостат камеру для предварительного охлаждения. Повторяйте, пока трубы не будут готовы для всех пробах и cryosection должны быть собраны.
- Для скелетных мышц секционирования, подтверждают, что температура криостат камера -21 до -22 ° С его внутренним термостатом. Передача любых контейнеров с тканями, чтобы разрезать на камеру и дайте контейнер (ы) для уравновешивания до температуры криостата в течение по крайней мере за 15 минут до открытия.
- Вставьте новый одноразовый криостата лезвие, С другой стороны , удалить существующий лезвие, спрей с обеззараживающим раствором РНКазы, промыть DDH 2 O и вставьте в криостат для охлаждения. Спрей чистой ткани с 70% этанолом и осторожно протрите лезвия и лезвия прижимную платформу.
- Спрей чистую ткань с обеззараживающим раствором РНКазы и протирают криостата щетки. Спрей ткани с DDH 2 O, снова протрите щетки и установить их в криостат камере на чистую поверхность.
ВНИМАНИЕ: Криостат Лезвие должно быть покрыта ограждением ножа , когда он не используется. Кроме того, раствор обеззараживание РНКазы токсичен и замерзнет с образованием осадка в холодной камере криостата. Поэтому обращаться с осторожностью и избегать его применения в криостат камере.
- Спрей чистую ткань с обеззараживающим раствором РНКазы и протирают криостата щетки. Спрей ткани с DDH 2 O, снова протрите щетки и установить их в криостат камере на чистую поверхность.
- В криостата камере, поместите гривенник размера капли (примерно 300 мкл) встраивания смолы на теплую образца патроне, установите пробку ткани поверх смолы, нажмите вниз, а затем установите патрон в фрeezing рельс или на быстром замораживании элемента, если доступно.
- После того, как вложении затвердеет смолы (белый), добавить дополнительное вложение смолы в верхней части пробки, вокруг нижнего 35% от ткани и нажмите тепла экстрактор в вложению смолы для быстрого замораживания, чтобы лучше стабилизации ткани. Подождите 5 мин до секционирования, чтобы смола полностью затвердеет.
- Убедитесь, что зажим образца находится в крайнем нижнем положении, наиболее удаленном от лезвия. Вставьте ткань образца патрона в зажим образца.
- Cryosection подготовка.
- Ослабить держатель держатель лезвий, установить угол зазора лезвия до 10 ° (или под углом, соответствующим несущей лопасти используется), и снова затянуть. Отпустите тормоз и поверните маховик, чтобы опустить мышцу в сторону лезвия. Оцените близкое расстояние между тканью и лезвием, затем переместите ткань подальше от ножа и задействуйте руки колесный тормоз.
- Ослабить регулировки высоты lèveR и переместить держатель лезвий вперед или назад, соответственно, если конец ткани составляет более чем приблизительно 2 мм от ножа или если лезвие ударяет ткань. Затянуть и опустите ткань снова, чтобы проверить расстояние от лезвия. Повторите регулировки, пока диск не будет от 1 до 2 мм от конца ткани путем визуальной оценки.
- Опустите ткань в сторону лезвия и оценить угол ткани для поперечных сечений. Зафиксировать маховик и отпустить рычаг зажима образца. Вставьте зажим образца влево или вправо до тех пор, горизонтальная ориентация ткани перпендикулярно к лезвию.
- Нажмите образец зажим вверх или вниз, чтобы отрегулировать "у" ориентации, чтобы срезы ткани будет перпендикулярно длинной оси мышцы. Затянуть рычаг зажима образца.
- Используйте ход и тонкой подачи вперед для продвижения образца, пока он не коснется лезвия. Если искать участки с определенной глубины ткани, сбросить сумму толщин раздела нулю (верхняя часть ткани).
- Установите криостат дифферента функции с толщиной сечения на 30 мкм. Вырезать и отбрасывать секции до тех пор , заранее выбранная глубина для сбора ткани не будет достигнута (например, 400 мкм от вершины).
- Сбор криосрезах для экстракции РНК.
- Откройте трубу для сбора секций и поместить его рядом с несущей лопасти. С помощью предварительно охлажденный, чистую щетку, чтобы подобрать каждой секции, как это будет вырезана из лезвия и передать cryosection в трубку. Повторяйте, пока объединенные секции не весят 30 мг или желаемой глубины ткани достигается.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для взрослых мышей передней большеберцовой, коллекция из глубины тканей приблизительно от 400 до 4000 мкм, обычно дает 25 - 40 мг. Использование металлических щипцов для передачи участков в пробирку не рекомендуется, поскольку участки имеют тенденцию придерживаться и группироваться на металлической поверхности. - Если вложение смолы окружает мышечную cryosection, блокировка ручного тормоза и использовать лезвие бритвы, чтобысбрить небольшие кусочки смолы, пока не будет только тонкий слой вокруг верхней части мышцы. Режьте всегда смолы с лезвием под углом от мышцы.
Примечание: Тонкий слой встраивание смолы не существенно ухудшать вниз по течению препарата РНК. Если толщина встраивание смола присутствует, использовать щетки, чтобы дразнить его подальше от мышцы перед перемещением cryosection в трубку сбора. - В качестве альтернативы, бассейн секции на держателе лезвия и передачи в объеме в трубу сбора.
Примечание: Тем не менее, этот метод имеет тенденцию быть медленнее, и участки, более вероятно, придерживаться и слипаются, что может снизить эффективность иглы гомогенизацией в последующих стадиях. - Быстро поместить Отстоявшийся cryosection трубку в аналитический баланс и отчет трубки веса. Немедленно вернуть трубку к холодной криостата камере для поддержания температуры секции возле -20 ° С. Рассчитайте массу объединенных секций.
Примечание: Если для выделения РНК будет происходить на рекламуifferent день, не хранить Отстоявшийся cryosection трубки при -80 ° С до использования.
- Откройте трубу для сбора секций и поместить его рядом с несущей лопасти. С помощью предварительно охлажденный, чистую щетку, чтобы подобрать каждой секции, как это будет вырезана из лезвия и передать cryosection в трубку. Повторяйте, пока объединенные секции не весят 30 мг или желаемой глубины ткани достигается.
- Соберите криосрезах для гистологии.
- Нажмите кнопку толщины сечения для прекрасных секционирования и используйте стрелки, чтобы установить толщину криостат секции до 7 мкм (или другой толщины соответствующего раздела, как правило, от 6 до 10 мкм).
Примечание: Разбавитель секций (от 6 до 10 мкм), следует использовать для гистологических приложений, чтобы гарантировать, что красящие реагенты могут проникать в глубину среза ткани. Тонкие секции могут быть взяты из любой глубины во время cryosectioning, но более глубокие участки, являются предпочтительными, так как встраивание смолы, которая увеличивается с глубиной ткани, не ухудшает гистологическую окрашивания. - Вырезать и отказаться от 4 до 7 секций, чтобы получить последовательную, ровную поверхность ткани. Обратите внимание на глубину ткани.
- Вырезать раздел и ориентировать его на поверхности носителя лезвия. Возьмите секцию, быстро и нежно касаясь теплой (комнатной температуры) стекло микроскопараздел на носителе лезвия. Вернуть слайд до комнатной температуры. Продолжайте, пока желаемое количество слайдов не получается. Обратите внимание на глубину окончательной ткани.
Примечание: Сбор второй участок (дубликат) для каждой ткани рекомендуется. - С полным секционирования, включите ручной тормоз колесо, вернуть образец в положение заднего большинства, и снять патрон ткани. Используйте криостата элемент тепла, чтобы расплавить вложение смолы, держащего пробковой ткани на образец патрона. Удалить пробковой ткани, сухой тканью, и вернуться к хранению.
- Повторите процедуру с шага 2.1.2 для каждой оставшейся ткани. Разрешить слайды высохнуть в течение 20 минут после того, как последняя ткань установлена. Затем используйте слайды для гистологического или специфического окрашивания или замораживанием при -80 ° С в коробке слайд, пока они не потребуются.
- Нажмите кнопку толщины сечения для прекрасных секционирования и используйте стрелки, чтобы установить толщину криостат секции до 7 мкм (или другой толщины соответствующего раздела, как правило, от 6 до 10 мкм).
3. Выделение РНК из консервированной криосрезах
- Выделение РНК
- Переместить трубку (ы) объединенных в пул криосрезах на льду. Немедленно добавьтеорганический реагент экстракции РНК при соотношении приблизительно 1 мл реагента на 50 мг веса cryosection, обычно 600 мкл на пробирку.
ВНИМАНИЕ: Выделение РНК реагенты являются токсичными, коррозионные и раздражающим. Следуйте инструкциям производителя по безопасному обращению. - С помощью 1 мл шприц с иглой 18 калибра, начертить РНК-экстракции жидкость вверх и ополаскивают стенки трубки, пока все ткани не суспендируют в растворе. Постарайтесь свести к минимуму пузырьки воздуха во время иглы гомогенизации.
- Используйте кончик иглы помять и рассеивать любые слипаются криосрезах и куски, прилипшие к стенке трубы. Triturate гомогенизировать при прохождении пробы вверх и вниз через иглу для пяти ударов, а затем вернуть образец в лед. Повторите оба шага три-пять раз, или столько раз, сколько необходимо, чтобы сорвать все комки и пройти пробу легко через иглу.
- Удалите иглу 18 калибра и заменить его 22 калибра иглы. Осторожно трiturate образца в течение пяти ударов, а затем возвращают в лед образец. Повторите тритурационного три-четыре раза, чтобы достичь очень мелкодисперсную гомогената ткани.
Примечание: Если частицы ткани начинают блокировать иглу при составлении образца, изгнать все пробы из шприца и переключиться обратно на 18 иглы калибра для дальнейшей гомогенизации. Дополнительный этап растирание в порошок с 25 или 26 калибра иглы могут быть добавлены, чтобы получить максимальный выход. Тем не менее, игла может засориться поэтому существует риск образца разливания. - Перемещение образца от льда до комнатной температуры. Выдержите в течение 5 мин для разрушения молекулярных комплексов.
- В вытяжном шкафу, добавляют 0,1 мл 1-бром-3-хлорпентан (БКП) на 1 мл реагента, используемого для выделения РНК (этап 3.1.1), как правило, 60 мкл на пробирку. Встряхните трубку энергично вручную в течение 15 сек (Не вихрь). Инкубируйте образца при комнатной температуре в течение 2-х до 3 мин. Затем центрифугу в течение 15 мин при 12000 х г и 4 ° С.
ВНИМАНИЕ: - Осторожно собрать верхнюю водную фазу (бесцветный), содержащий РНК и перенести его в чистую пробирку. Добавить равный объем 70% -ного этанола (в DEPC воды) и вихрем перемешать. Выдержите при комнатной температуре в течение до 10 мин.
Примечание: средний и нижний интерфазная фенол-BCP фазы могут быть обработаны для геномной ДНК и белка, соответственно, в соответствии с инструкциями изготовителя или собраны в фенол-БКП опасных отходов контейнер для надлежащей утилизации.
- Переместить трубку (ы) объединенных в пул криосрезах на льду. Немедленно добавьтеорганический реагент экстракции РНК при соотношении приблизительно 1 мл реагента на 50 мг веса cryosection, обычно 600 мкл на пробирку.
- очистки РНК.
- Следуйте инструкциям производителя для образца связывания, промывки и элюции с незначительными вариациями 8. Например:
- Поместите аликвоты ДНКазы / РНКазы воды в бане с температурой 37 ° или инкубатор для предварительного тепло для стадии 3.2.4.
- Добавить образец РНК из 3.1.8 выше в колонне очистки и центрифугирование образца в течение 15 секпри 12000 х г при комнатной температуре. Налейте поток через обратно в ту же колонку и повторного центрифуге. Повторите еще один раз, чтобы максимизировать связывание РНК, а затем отбрасывать окончательный поток через.
- Выполните шаги мыть в соответствии с инструкциями изготовителя 8. Применить 700 мкл промывочного буфера (не этанол) с колонки, спина в течение 15 сек при 12000 мкг, и отбросить поток через.
- Добавьте 500 мкл промывочного буфера (с этанолом) в колонну спина в течение 15 секунд при 12000 х г, и отбросить поток через. Повторите этот шаг один раз.
- Спин пустую колонку в течение 1 мин при 12000 х г, чтобы высушить мембрану.
- Перенесите столбец спина к чистой RNase-, ДНКазы свободной трубки. Добавьте 40 мкл подогретого ДНКазы / РНКазы воды (от 3.2.1) к центру мембраны колонны. При комнатной температуре, инкубировать в течение 2 мин, а затем центрифугировать в течение 2 мин при 12000 х г.
Примечание: Объем элюции 40 мкл составляет примерно 1,3 мкл на мг оригиналаткани 30 мг объединенных криосрезах. Регулировка громкости элюирования в зависимости от обстоятельств для различного веса исходной ткани, но не снижают ниже 32 мкл. Второй элюирования, используя приблизительно 0,7 мкл на мг исходной ткани, могут быть добавлены, чтобы увеличить общий выход РНК. - Анализ РНК (колонка элюирования) для концентрации и чистоты с помощью спектрофотометра, электрофорез, и / или Bioanalyzer. Хранить РНК при -80 ° С до тех пор , пока требуется для последующих применений, таких как обратной транскрипции для количественной ПЦР 4.
Примечание: Лечение ДНКазы рекомендуется перед использованием РНК в последующих применений. Эта процедура может быть выполнена на некоторых колонках очистки РНК перед стадией промывки, в этой конкретной точке следующий столбец элюирования, или на аликвоты РНК в качестве первого шага в любом вниз по течению приложения. РНК должна быть стабильной в течение нескольких лет.
4. Анализ гистологического по Иммунофлуоресцентного Staininг мышечной криосрезах
- Простой протокол иммунофлюоресценции.
- Используйте гидрофобный ручку, чтобы окружить группу секций на каждом слайде. Аккуратно уронить PBS в кружком области (приблизительно 80 мкл для небольшой площадью поверхности до 500 мкл для большой площади поверхности), стараясь не прикасаться к тканям. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
Примечание: При использовании замороженных слайдов, удалить слайды от -80 ° C морозильника и инкубировать при комнатной температуре в течение от 20 до 30 мин, чтобы разморозить и высушить, а затем продолжить, как указано выше. Требуется, по меньшей мере, две горки: одна экспериментальная слайд инкубировать в первичных и вторичных антител; и один элемент управления слайд для которых первичное антитело исключается, "единственный" вторичный контроль. - Совет бегунок слейте PBS. Добавить 5% осла сыворотки в PBS (блокирующий раствор) в окружностью области; будьте осторожны, чтобы гарантировать, что участки мышц не высыхают. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин (или до нескольких часов в камере влажности).
- Приготовьте раствор первичного антитела для анализа регенерации мышц. Смешать блокирующего раствора, с антителом eMHC (1:40), и антителом против ColVI (1: 1000). Подготовьте примерно 150 мкл, 300 мкл или 500 мкл для малых, средних или больших площадей скольжения, соответственно. Вихревые в течение 5 секунд, а затем центрифугировать в течение 2 мин при 15000 х г в гранулах любой осадок.
- Для экспериментальных слайдов, кончик бегунок слейте блокирующего раствора, а затем добавляют раствор первичного антитела из п.4.1.3. Для вторичного управления слайде, кончик бегунок слейте блокирующего раствора, а затем добавляют свежий раствор блокирующего (без антител). Инкубируйте слайдов в камере влажности при температуре 4 ° С в течение ночи.
Примечание: Когда пипеткой растворы антител на предметные стекла, всегда тянуть жидкость из верхней части трубы первичного раствора антитела, не нарушают никакого осадка в нижней части трубы. - Совет слайды слейте раствор. Добавьте по каплям PBS к кружком области каждого слайда, чтобы помыть, налить наконечниквыключите, а затем добавить еще PBS и инкубировать в течение 3-х до 5 мин. Повторить в общей сложности трех стирок.
Примечание: Время стирки является достаточно гибким и может быть увеличена до 20 мин при желании. Как правило, число изменений решение является более важным, чем время. - Подготовка вторичного раствора антител для всех слайдов (в том числе вторичного управления горкой) с использованием 1: 500 разведение красного и зеленого флуорофоров связью вторичными антителами для обнаружения мыши IgG1 (eMHC) и кролика IgG (ColVI) и 1: 10000 разбавления DAPI ядерной пятно.
- Например, смешайте 1 мкл DAPI с 9 мкл DDH 2 O , чтобы сделать 1:10 разбавление DAPI. Затем, в течение мкл конечного объема 500, добавить 1,0 мкл анти-мышь IgG1-красный + 1,0 мкл анти-кроличьи IgG-зеленый + 0,5 мкл 1:10 DAPI до 447,5 мкл блокирующего раствора. Вихревой смешивать и центрифугировать в течение 2 мин при 15000 х г в гранулах любой осадок.
Примечание: В идеале, все вторичные антитела должны быть из того же вида хозяина.
- Например, смешайте 1 мкл DAPI с 9 мкл DDH 2 O , чтобы сделать 1:10 разбавление DAPI. Затем, в течение мкл конечного объема 500, добавить 1,0 мкл анти-мышь IgG1-красный + 1,0 мкл анти-кроличьи IgG-зеленый + 0,5 мкл 1:10 DAPI до 447,5 мкл блокирующего раствора. Вихревой смешивать и центрифугировать в течение 2 мин при 15000 х г в гранулах любой осадок.
- Совет слайды, чтобы слейте последнюю промывку PBS. Добавьте вторичное раствор антител, чтобы покрыть все ткани. Накройте слайды, чтобы защитить их от света и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
Примечание: Все вторичные антитела должны быть проверены, чтобы иметь минимальную перекрестную реактивность с другими видами в двойных экспериментах маркировки. - Вымойте слайды, как описано в разделе 4.1.5. После последней промывки кончик бегунок слейте PBS и установите предметное стекло на ткани. Добавить 3 до 4 капель водной монтажной сред вдоль одной стороны.
- Установите край покровного стекла только до внешнего края монтажной сред. С помощью щипцов, медленно опустите покровное в сторону ткани, а затем отпустите покровное и аккуратно нажмите на него в нужном положении. И, наконец, осторожно нажмите каждый уголок покровное, чтобы стабилизировать его.
- Защита слайды от света и хранить при температуре 4 ° С до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения, нанесите тонкий слой лака для ногтей по краю йе покровное, чтобы помочь предотвратить сползание от высыхания.
- Используйте гидрофобный ручку, чтобы окружить группу секций на каждом слайде. Аккуратно уронить PBS в кружком области (приблизительно 80 мкл для небольшой площадью поверхности до 500 мкл для большой площади поверхности), стараясь не прикасаться к тканям. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Гистологическая оценка.
- Изображение слайды, использующие эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии с соответствующими фильтрами для обнаружения eMHC (красный); ColVI (зеленый); и DAPI окрашенных ядер (синий), как правило , с использованием 20X объективной 1,5.
- Убедитесь , что флуоресцентный сигнал от экспериментальных слайдов отличается от вторичного управления слайд для демонстрации специфичности обнаружения eMHC и ColVI 4.
Примечание: eMHC положительные регенерирующие волокна должны быть видны из приблизительно от 2 до 7 дней после травмы мышц и переменно у мышей с мышечной дистрофией. Коллаген VI присутствует во внеклеточном матриксе окружающих мышечных волокон, кровеносных сосудов и нервов, а также в больших пучков соединительной ткани пери- и epimysium. DAPI ядерной пятно полезно для идентификации мышечных волокон с центральными ядрами по сравнению с периферийным ядер, указывающие на регенерацию волокон, а также наличие Infiltrating клетки. Некротические или травмированные волокна могут испачкать слабо с вторичным антителом мыши IgG из-за обнаружения эндогенных IgG, который проникает через волокна поврежденных мышечных мембран. - Для количественной оценки регенерации, возьмите перекрывающихся микроскопа фотографии с каждым флуоресцентным фильтром через все изображение. Объедините изображения eMHC, ColVI и DAPI для каждого места , а затем выровнять фотографии реконструировать карту всего раздела 1,5.
- Использование программного обеспечения для анализа, подсчета количества eMHC положительных волокон и общее количество волокон, чтобы вычислить недавнюю регенерацию (100 * (# eMHC + волокна / # всего волокна)). Кроме того , подсчитывают количество центрально ядросодержащих волокон из общего количества волокон для измерения регенерации в течение более длительного периода (100 * (# CN + волокна / # Всего волокон)) 1,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышцы cryosection РНК высокого качества и обеспечивает достаточный выход для большинства применений
Анализы шестнадцати скелетных мышечных препаратов РНК приведены в таблице 1 , с использованием 19,4 до 41 мг суммированных передней большеберцовой (TA) мышцы от 8 контрольных мышей. И левые (L) , и правая мышцы (R) TA были подготовлены в экспериментах регенерации с мышцами , собранных через 3 дня после продольного внутримышечной инъекции 25 мкл физиологического раствора или 10 мкМ cardiotoxin , чтобы вызвать повреждение мышц , используя методы , ранее сообщалось , 1. Как показано в таблице 1, A260 / 280 отношения для мышц cryosection РНК , как правило , близка к 2 или выше , в этих представительных выборках. В качестве "чистой" РНК считается иметь А260 / 280 2,0 и A260 / 280 от 1,8 до 2,2, чистота образцов cryosection РНК отлично 9. Полное восстановление РНК обычно ОвеR 10 мкг на образце с выходами 0,18 до более чем 1 мкг общей РНК на мг исходной ткани, что обеспечивает достаточное количество материала для большинства последующих применений. Следует отметить, что концентрация РНК общую РНК экстрагировали, и выход РНК на мг исходной ткани от ТА мышц 3 дня после травмы токсин был значительно выше, чем от физиологический раствор вводили ТП. Это говорит о том, что улучшается однородность, когда структура мышц нарушается обширной травмой и / или что есть увеличение транскрипции генов и / или стабильность РНК в 3 дня регенерирующей мышцы. Сохранение качества РНК оценивали с помощью простого 1х ТАЕ / 1,5% агарозном геле в 1 мкл мышечной cryosection РНК после того, как образцы хранили при -20 ° С в течение 18 месяцев. Видные 18S и 28S рРНК полосы все еще очевидны в образцах , демонстрирующих высокое качество РНК, даже при неоптимальных условиях хранения (Рис . 1А)
Мышцы cryosection РНКподдерживает вниз по течению приложений
Один микрограмм РНК на объединенном образце cryosection обрабатывали ДНКазы и обратной транскрипции с олиго дТ праймеров. После обработки РНКазой, общий объем обратной транскрипции кДНК 30 мкл. Простой неколичественными ПЦР с избыточным усилением проводили, чтобы подтвердить жизнеспособность кДНК. Миогенный регулирующий фактор 4 (Mrf4), фактор транскрипции с повышающей регуляции дифференцировки мышц, амплифицировали с использованием праймеров сообщалось ранее мыши, чувствуют 5'-CTACATTGAGCGTCTACAGGACC и антисмысловые 5'-CTGAAGACTGCTGGAGGCTG 10, от 2 мкл шаблон с использованием стандартной ПЦР. Был надежной, специфической амплификации 234 п.н. Mrf4 фрагмент из левого и правого образцов ТА кДНК, но не ОТ- (РНК включены, но не обратной транскриптазы), RT DDH 2 O (обратной транскрипции с РНК - матрицы нет), или DDH 2 O контроля ПЦР (рис. 1В)Те же образцы в трех экземплярах для Mrf4 и mOaz1 опорного управления 4 количественной оценки с использованием относительного усиления и пассивной ссылки флуоресценции в режиме реального времени системы ПЦР. Mrf4 была выражена в 0,097 раза в токсин впрыскивается правой ТП по сравнению с физиологическим раствором впрыскивается левого ТП, рассчитанного по методу ΔΔCt 4. Это похоже на предыдущие доклады низкой экспрессии Mrf4 3 дня после повреждения токсина из - за потери зрелых мышечных волокон 11. Для сравнения согласованности cryosection РНК для количественной ПЦР, значения Ct сравнивали для эталонного гена mOaz1. Из шести образцов, mOaz1 транскрипт был обнаружен при среднем Ct из 17,242 ± 1,483 SD, тогда как среднее Ct был 36,332 ± 3,61 SD в контрольных образцах ОТ- (п = 4). Плотный группировка сигналов mOaz1 Ct по образцам предполагает, что РНК, выделенной из ТА мышечных криосрезах выполняет, как ожидалось в вниз по течению экспрессии РНК анализа.
Примеры непрямой иммунофлуоресценции окрашивания 7 мкм передней большеберцовой участков мышц от контрольных мышей однопометница через 3 дня после инъекции токсина показаны обнаружить регенерирующие волокна (рисунок 2). Обе секции были собраны из мышцы менее чем 150 мкм, из региона, который будет использоваться для анализа РНК на глубине от 4,5 до 4,6 мм от проксимальной поверхности мышц. Эмбриональные тяжелой цепи миозина (eMHC, красный) обнаруживает регенерирующие волокна, коллаген VI (ColVI, зеленый) описывает мышечные волокна, и DAPI пятна ядер синий, в соответствии с протоколом 4. Регионы с концентрированной ядерной инфильтрата (синий сигнал) указывают на участки повреждения токсина , как это видно при активации eMHC положительных вновь регенерирующих мышечных клеток. Целый раздел карты как в этом примере используются для количественного определения регенерации путем вычисления доли embryoniс тяжелой цепи миозина , экспрессирующих волокна (красные, вновь регенерируется) или централизованно ядросодержащие волокна , как сообщалось ранее 1. Примечательно, что на удивление небольшое повреждение в мышцах TA на рисунке 2А. В то время как существуют различия между инъекциями, типичные инъекции токсина влияют на гораздо большую часть мышцы отсека 1, как показано на фигуре 2В. Таким образом, этот гистологический анализ позволяет предположить , что травма токсина на рисунке 2А был минимальным , и является важным инструментом для интерпретации данных экспрессии генов из смежных мышц cryosection образца РНК. Если вся мышца была использована для приготовления РНК с помощью стандартных методов шлифования, неожиданно небольшой травмы площадь этого образца сделало бы его выбросом, который бы перекос вниз по течению анализы. Вместо этого спаривания гистологическое квантификацию из той же мышцы позволяет прямое измерение степени травмы от соседних участков. Это позволяет использовать incluкритерии Sion / исключения, чтобы гарантировать, что все образцы, включенные в РНК ниже по течению анализа отвечают минимальный порог травмы или нормализации РНК анализа в зависимости от размера травмы.
Рисунок 1: Оценка качества РНК из консервированной Muscle криосрезах. A) 18S и 28S рибосомных РНК полосы занимают видное место в РНК из объединенных криосрезах мышц через 18 месяцев после получения РНК. Б) неколичественную ПЦР для Mrf4 следующей обратной транскрипции. 200 и 300 п.о. полосы лестницы ДНК обозначены. RT-, реакции обратной транскрипции с РНК-матрицы, но без обратной транскриптазы. RT-H 2 O, обратной транскрипции с DDH 2 O, не РНК - матрицы. Н 2 О, нет ПЦР - матрицы управления с DDH 2 O. В этих опытах токсин вводили в правый передней большеберцовой (RTA) и солевых промs вводили в левый (LTA). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Пример гистологического Карты для мышечной регенерации исследований. А, В) составлены карты однослойных большеберцовой участков передней большеберцовой мышцы 3 дня после инъекции токсина показаны примеры плохой (А) и нормального (В) токсин-индуцированного повреждения. Белые штучной области каждой карты раздела представлены в виде вкладных изображений для просмотра более высокого увеличения, красный, эмбрионального миозина тяжелой цепи; зеленый, коллаген VI внеклеточного матрикса белок; синий, DAPI окрашивающий ядра. Масштаб бар, 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры,
Таблица 1: Представитель РНК выход и чистоту Измерения из консервированной Muscle криосрезах. Шестнадцать передней большеберцовой (TA) мышцы рассекают и Собранные пробы cryosection были обработаны для РНК. Очищенная РНК (1 мкл) анализировали с помощью nanospectrophotometer. Статистика колонки были выполнены в электронной таблице, групповые сравнения проводились с использованием статистического программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для достижения наилучших результатов с помощью этого метода, сохранить вложение смолы, ограниченного нижней трети или половине мышцы во время криоконсервации ткани, потому что избыток смолы замедлит коллекцию объединенных криосрезах и может увеличить вложение загрязнения смолы в изоляции РНК. Кроме того, особое внимание в ходе иглы гомогенизации важно, чтобы максимизировать доходность и минимизировать вероятность засорения иглы. Протокол может быть изменен с помощью шприца Luer-Lok для защиты от потери образцов, если игла блокируется и требует высокого давления, чтобы сместить помеху. Дополнительный этап игла гомогенизацию с иглой калибра 25 или 26 также могут быть добавлены, чтобы получить суспензию тонкую ткань для дальнейшего усиления выхода РНК. В то время как хлороформ может быть заменен на ППГ, это не рекомендуется , поскольку BCP является менее токсичным и приводит к снижению уровня загрязнения геномной ДНК в водной фазе при экстракции органической РНК 12. Увеличениетолщина секции для объединенных криосрезах более 30 мкм также не рекомендуется, так как гомогенизация будет менее эффективным.
Если выход РНК ниже требуемого уровня, различные стратегии могут быть использованы для увеличения нефтеотдачи, таких как: а) увеличение количества миллиграмм исходного материала для возможного увеличения урожайности; б) уменьшить толщину раздел ниже 30 мкм, чтобы улучшить механическую гомогенизацию ткани; III) увеличение продолжительности пробы инкубации и иглы гомогенизации в реагенте органической экстракции для улучшения механических и химических тканей нарушения; и IV), если кусками ткани остаются, выполняют второй стадии экстракции с более жесткой иглы гомогенизации. С другой стороны , может быть тканеспецифичные соображения, такие как дополнительные стадии разделения фаз и осаждения для образцов с высоким содержанием протеогликанов 13. Во время очистки на колонке с РНК, больший объем элюции может быть использован и выполнение второго элюирование может маximize полного восстановления РНК, но за счет концентрации РНК. осаждение пост-колонна спирт может быть использован для концентрирования РНК, если низкая концентрация вызывает беспокойство с этой модификацией. Если деградация РНК является проблемой, что сокращает время на криоконсервации во время вскрытия, более строгая очистка криостата поверхностей и инструментов , чтобы свести к минимуму RNase экспозиции, выполняя шаг иглы гомогенизации в холодной комнате, добавление ингибитора РНКазы реагента к криосрезах 14 и частые замена РНКазы решений каждый из них может помочь предотвратить или свести к минимуму воздействие РНКазами и снижения активности расщепления. Вполне возможно, что на короткое время купания ткани в реагенте ингибитора РНКазы после рассечения, но прежде, чем криоконсервации, могут еще больше уменьшить деградацию образца. Однако предварительные эксперименты должны быть выполнены, чтобы гарантировать, что любое такое лечение не приводит к увеличению кристаллов льда или других артефактов во время криоконсервации.
В то время как эмбриональнаятяжелой цепи миозина / коллаген VI непрямой иммунофлуоресценции используется здесь в качестве примера для мышечного анализа травмы, тонкие криосрезы установлены на предметные стекла микроскопа из этих экспериментов могут быть использованы для любого соответствующего гистологического пятна, которые могут быть проведены на замороженных срезах, в том числе методов иммунофлуоресцентных с поста -fixation и гематоксилин / эозином. Действительно, адаптация к простому протоколу иммунофлуоресцентного представленная здесь, может оказаться необходимым. Например, анти-мышиные вторичные антитела используются для обнаружения мыши первичного антитела (например, eMHC) может также обнаружить эндогенные иммуноглобулины мыши в ткани - мишени. Такие эндогенные антитела обычно накапливаются в поврежденных или некротических мышечных волокон в поврежденных или дистрофического мышцы, вызывая фон иммунофлуоресцентного окрашивания. Вторичный слайд-контроль (с первичным антителом пропущенной) всегда должны быть рассмотрены с целью оценки специфичности окрашивания. Если эндогенный фон антитело является проблематичным, этапы предварительной блок должен бытьдобавляется к протоколу , чтобы предотвратить или свести к минимуму обнаружение эндогенных иммуноглобулинов мыши 15.
Основные ограничения метода является то, что она требует криостат и это отнимает много времени, что делает его относительно низкую пропускную способность. Например, специалист в области техники был в состоянии обрабатывать до 16 мышц для объединенных криосрезах и предметные стекла микроскопа (8 слайдов с повторяющимися секциями всех 16 тканей) приблизительно от 9 до 10 ч. Для новичков в cryosectioning, коллекция объединенных криосрезах от 2 до 4 образцов может быть разумно освоены после криостата обучения и одной или двух сессий практики, вместо этого, качество криосрезы получение для гистологии потребовалось больше опыта. Таким образом, оборудование, время, или обучение факторы могут сделать этот метод менее полезным для более мягких тканей, которые могут быть хорошо гомогенизируют с ручным пестиком гомогенизатора.
По сравнению с не-криостата методов гомогенизации, подготовка полосатых мышц РНКs сообщалось из мышечных биопсий с РНК выходами от 0,05 до 0,7 мкг РНК предварительно мг мышцы 16 и, в последнее время от 0,27 до 1,08 мкг РНК на мг мышцы 17. Таким образом, способ, описанный здесь, обеспечивает РНК урожаи таким же хорошим или лучше, чем без криостата методов с дополнительным преимуществом позволяет спаренный гистологических анализов из смежного области одного и того же образца. Следует отметить, что предыдущее исследование также используется cryosectioning для гомогенизации в позвоночном ткани и так же обнаружили , что cryosectioning ткани повышается эффективность гомогенизации для выделения РНК 13. Когда этот метод был испытан в бычьих образцов скелетных мышц, средний выход РНК на пробоподготовки 4,09 ± 0,36 мкг, на нижнем конце нормального диапазона , указанного здесь 13. Лазерная захвата микродиссекции является еще одной альтернативой для сбора ткани для экстракции РНК из cryosection. Лазерный захват превосходит этого метода объединенном cryosection вчто она позволяет Специфичность собрать только желаемое подмножество ячеек из секции и оно может быть выполнено на участке одной ткани до 50 мкм толщиной 18. Тем не менее, коллекция микро-расчлененный образца может быть трудным и соответствующее оборудование не получили широкого распространения, что делает складочный cryosection гомогенизация более доступными для исследователей. Когда оба метода доступны, предпочтение для анализа ткани субрегион для приложения нуждаются лишь небольшие РНК количествах бы пользу лазерного захвата микродиссекции в то время как складочный cryosection гомогенизация лучше всего, когда анализ субрегион менее важны и необходимы более высокие количества РНК.
Хотя гистологические и РНК методы изоляции находятся в центре внимания здесь, Отстоявшийся метод cryosection легко адаптируется для приготовления белковых лизатов для Вестерн-блот-анализа или измерения активности фермента. Например, объединенные криосрезы из сердца солюбилизировали для Западной блоттинг 4 Aй Объединенные криосрезы от ТП гомогенизируют для сукцинатдегидрогеназы анализов активности митохондриальной функции 5. В качестве альтернативы, геномную ДНК и белковые фракции могут быть отделены от других фаз в процессе органической экстракции после выделения РНК, обладает потенциалом для получения геномной ДНК, белка, РНК и гистологические измерения из одной ткани после одного сеанса криостата.
В целом, основное преимущество этого метода заключается в увеличении экспериментальной гибкости, позволяя несколько аналитических подходов, требующих различных подготовки проб из одной ткани. Метод является наиболее подходящим для мышц и других тканей с обширным внутри или вне клетки структуры, что снижает эффективность работы пестиком на основе гомогенизацией ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 ml syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
References
- Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049 (2016).
- Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
- Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
- Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
- Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20 (2016).
- AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx 1-102 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
- Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
- Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
- Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
- Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20 (2015).
- Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
- Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
- Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
- Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
