Summary
Este é um método para criar uma estrutura de suporte de cultura de células 3-dimensional a partir da matriz extracelular pulmonar. pulmão intacto é transformado em hidrogéis que podem suportar o crescimento das células em três dimensões.
Abstract
Aqui é apresentado um método para o estabelecimento de múltiplos componentes hidrogéis de cultura de células para a cultura de células em pulmão in vitro. Começando com saudável en bloc tecido pulmonar de porcino, rato ou ratinho, o tecido é submergido perfundidos e em detergentes químicas subsequentes para remover os detritos celulares. Comparação histológica do tecido antes e depois do processamento confirma a remoção de mais de 95% de ADN de cadeia dupla coloração e alfa-galactosidase sugere a maioria dos detritos celulares são removidos. Após a descelularização, o tecido é, em seguida, liofilizado e cryomilled em um pó. O pó de matriz é digerido durante 48 horas numa solução de pepsina a digestão ácida e, em seguida, neutralizou-se para formar a solução Pregel. A gelificação da solução Pregel pode ser induzida através da incubação a 37 ° C e pode ser utilizada imediatamente após a neutralização ou armazenado a 4 ° C durante até duas semanas. Os revestimentos podem ser formados utilizando a solução Pregel sobre uma chapa não tratada para Capego ell. As células podem ser suspensas no Pregel antes de auto-montagem para alcançar uma cultura 3D, plaqueadas sobre a superfície de um gel formado a partir do qual as células podem migrar através do andaime, ou revestida sobre os revestimentos. Alterações à estratégia apresentada pode ter impacto na temperatura de gelificação, força ou tamanhos dos fragmentos de proteína. Além formação de hidrogel, o hidrogel de rigidez pode ser aumentada usando genipina.
Protocol
| Solução | filtro esterilizado | Instruções |
| 2 O DIH | sim | DIH 2 O; esterilizada por filtração |
| 0,1% de solução de Triton X-100 | sim | Sob hotte adicionar 100 uL de Triton X-100 a 100 ml solução DIH 2 O e agitar até à dissolução; filtro esterilizado. |
| 2% de desoxicolato Solução | sim | Sob exaustor adicionar 2 g solução de desoxicolato de sódio por 100 ml DIH 2 O e agitar até à dissolução; Filtrar em condições estéreis |
| 1 M NaCl | sim | Adicionar 58,44 g de NaCl para 1 L de DIH 2 O; agitar até se dissolver; filtro esterilizado |
| solução de DNase | sim | Adicione 12.000unidades de ADNase a 1 L DIH 2 O; Adicionar 0,156 g MgSO4 (Anidro), e 0,222 g de CaCl 2; agitar até se dissolver; filtro esterilizado |
| PBS | sim | Combine 27,2 g de Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibico hepta-hidratado), 80 g de NaCl e 2 g de KCl com 10 L DIH 2 O; agitar até se dissolver; ajustar o pH para 7,4; filtro esterilizado |
Tabela 1: soluções necessárias para Decelularização Tissue. Faça as soluções acima para o processo de descelularização. Armazenar a 4 ° C. Cerca de 2,5 L será necessário para um pulmão de porco.
1. Formação Hidrogel
- Porcina Lung Decelularização (adaptado a partir de referências 9,10)
- Obter, um en bloc pulmão de porco normal, de um matadouro, com coração e vasculature intacta.
- Use tesouras de tecidos ou um bisturi para dissecar afastado do coração, vasculatura tão próximo quanto possível do coração de corte, mantendo-se a vasculatura irá ser usado em passos posteriores para perfusão.
- Dissecar cuidadosamente afastado o tecido conjuntivo em torno da traqueia, brônquios e vasculatura utilizando um bisturi ou tesoura.
NOTA: Determinar o melhor pulmão para usar para o resto do procedimento, escolhendo um pulmão sem grandes cortes ou perfurações através da pleura e grandes quantidades de atelectasia ou oclusão vascular que podem impedir a eficácia do processo de descelularização. - Cortar o pulmão subóptima deixando tanto brônquio ligados à traqueia quanto possível (coração, o tecido conjuntivo e os lóbulos dos pulmões removidos podem ser eliminados). Deve haver um pulmão que continuem ligadas ao traqueia e vasculatura.
NOTA: Manter seções para histologia, se desejar. 9 - Feche brônquios desconectados com grampos ou suturas para prevent excesso de refluxo.
- Preparar as soluções de decelularização e refrigerar a 4 ° C até serem necessárias (Tabela 1).
- Usando uma bomba manual canulada para se ajustar a artéria pulmonar, a perfusão do tecido pulmonar 3 vezes com água desionizada, tanto através da artéria pulmonar e traqueia. Perfundir vasculatura primeiro de cada vez. Comece com cerca de 1 L para a vasculatura e 1,5 L em cada traqueia para perfusão, mas como os detritos celulares são removidos mais líquido pode ser perfundido através do sistema.
- Perfundir tanto vasculatura e traquéia com Triton solução X-100.
- Submerge tecido pulmonar em solução de Triton X-100 durante 24 h a 4 ° C.
- Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar.
- Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de desoxicolato.
- Submergir as secções de tecido em desoxicolato durante 24 h a 4 ° C.
- Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar.
- Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de NaCl.
- Submergir o tecido em solução de NaCl filtrada durante 1 hora a 4 ° C.
- Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar.
- Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de DNase.
- Submergir o tecido em solução de ADNase filtrada durante 1 hora a 4 ° C.
- Perfundir tanto vasculatura e traqueia 5 vezes com PBS.
- Dissecar o tecido cartilaginoso perceptível, traqueia e todos os túbulos de 2 mm ou maior em diâmetro (encontrado principalmente em torno do hilo e porções mediais dos pulmões) de condução das vias aéreas, deixando apenas a zona respiratória (principalmente nas áreas periféricas).
- Dissecar tecido em 1 seções polegadas ou menores. Orientação do tecido não interessa para este passo.
- Deitar fora o excesso de tecido líquido e coloque em tubos de 50 ml cônico. Congelar o tecido a -80 ° C.
NOTA: Manter seções para histologia para assegurar a remoção de células e debri celulars, se desejado. Usamos H & E, α-galactosidase, PicoGreen, hidroxiprolina, ninidrina, azul de alcian, SDS-PAGE e espectrometria de massa para caracterizar. 9
- Lung Processing
- Retirar as tampas de tubos congelados contendo tecido pulmonar decelularizado.
- Coloque papel de filtro sobre a abertura do tubo e prenda com elástico.
NOTA: Tubo e conteúdo ainda deve ser congelado qualquer outro modo, em -80 ° C até congelados. - Liofilizar o tecido até que todo o excesso de líquido está desaparecido, usando um secador de gelo de acordo com as instruções do fabricante. Armazenar a -80 ° C até estar pronto para moinho.
- Antes de iniciar adicionar nitrogênio líquido para fábrica de freezer para esfriar isolamento e componentes internos às condições de trabalho.
- Retirar bar mill magnético do tubo moinho e adicionar o tecido para cobrir parte inferior.
- Substitua bar moinho e adicionar o tecido ligeiramente comprimido. O bar moinho ainda deve mover-se livremente.
- Fechar o tubo moinho e place no moinho congelador.
- Preencha nitrogênio líquido para linha de preenchimento máximo.
- Moinho congelador todo o tecido em pó fino (aproximadamente 5 min, taxa de compactação de ~ 600 min-1), em um cilindro de policarbonato com um pêndulo de aço inoxidável, bem como tampões de extremidade de aço inoxidável usando o moinho de congelador de acordo com as instruções do fabricante. Armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para uso.
- A formação do gel micro-porosa (8 mg / ml) (adaptado a partir de referências 9,11)
- Adicionar 1% (w / v) do pó descelularizado e 0,1% (w / v) de pepsina a HCl 0,01 M, sob agitação constante (deve ser capaz de ver o fluxo no nível superior do líquido), à temperatura ambiente, durante 48 hr.
NOTA: O pó é estaticamente carregada, então a adição do HCl, depois do pó proporciona a oportunidade para lavar o excesso de fora das paredes do tubo. - Após a digestão durante 48 h, e colocar a solução de reagentes em gelo durante 5 min.
- Usando refrigerado 10% (v / v) de NaOH 0,1 M, umad 11,11% (v / v) de PBS 10X (para trazer toda a solução de concentração 1x), levar a solução de proteína digerida a pH fisiológico de 7,4.
NOTA: A solução pode agora ser armazenada a 4 ° C durante até uma semana. Execute cinética de gelificação utilizando reometria 9 se desejar.
- Adicionar 1% (w / v) do pó descelularizado e 0,1% (w / v) de pepsina a HCl 0,01 M, sob agitação constante (deve ser capaz de ver o fluxo no nível superior do líquido), à temperatura ambiente, durante 48 hr.
2. Cross-ligando hidrogéis para melhorar a força mecânica
- Soluções de 1%, 0,1%, e 0,01% w / v solução de genipina de reticulação foram preparadas por dissolução da quantidade necessária de pó de genipina em 10% de DMSO.
- Vortex a solução cada 15 minutos durante 1 hr.
- Adicionar solução genipina para cobrir hidrogéis ECM (100 uL para cada poço de uma placa de 96 poços) que foram previamente montados na parte 1.3.4.
- Deixar cada hidrogel ECM para reticular durante 24 h a 37 ° C.
- Lavar o hidrogel ECM 3 vezes com PBS até a solução de lavagem não é mais azul. Os hidrogéis reticulados então estará pronta para posterior caracterização e ceEstudos de cultura II.
3. Cultura de Células com microporosa Gel
- Revestimento Bidimensional
- Usando a solução de 1.3.3, adicionar 20 ul de solução Pregel a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços não tratados.
- refrigere durante a noite a 4 ° C para permitir a adsorção de proteína à placa.
- solução Aspirar Pregel e enxaguar com PBS.
- Células de passagem 9.
- Adicionar células 10.000 / cm 2 a poços.
- Aumentar a mídia para 100 jil por poço e incubar a 37 ° C.
- Três de cultura de células tridimensional 9
- Utilizando uma solução a partir de 1.3.3, ressuspender as células peletizadas a uma concentração de 1.000.000 células / ml de solução Pregel.
- dispensar rapidamente 16 ul de suspensão de células Pregel em cada poço de uma placa de 96 poços, de modo a formar um hidrogel de espessura ~ 500 um para a cultura de células em 3D.
- Incubar a 37 ° C durante 30min para o gel para formar.
- Adicionar 100 ul de meios de comunicação para o topo de hidrogeles formados e incubar a 37 ° C.
- Três de cultura de células tridimensional em geles de rigidez variável
- Utilizando uma solução a partir de 1.3.3, pipeta 100 uL de solução Pregel em cada poço de uma placa de 96 poços.
- Incubar a 37 ° C durante 30 minutos para formar gel.
Nota: Cross-ligando passos da parte 2 podem ser usados aqui. - Células de passagem 9.
- Adicionar células 10.000 / cm 2 a poços.
- Aumentar a mídia para 100 jil por poço e incubar a 37 ° C.
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Representative Results
Usando este método, temos produzido a partir de hidrogéis de porco normal, rato, e pulmões de ratinho (Figura 1). pulmões transformados fornecer um valor estimado de 5 mg, 40 mg, e 10 g de ECM em pó respectivamente. Uma visão geral do processo é mostrado na Figura 2. visualizações chave durante o processo incluem: aparência branca dos pulmões após a lavagem desoxicolato; após a formação Pregel, a solução deve ser opaco e a solução deve aparecer homogénea durante meses se armazenada a 4 ° C. Nós incluímos uma tabela básica solução de problemas para ajudar a identificar fontes de erro durante o processo (Tabela 2). Após gelificação, hidrogéis pode ser usado imediatamente ou armazenado para uso futuro. Ensaio reológico confirma que mais de 90% de a gelificação ocorre nos primeiros minutos depois de atingir 37 ° C (Figura 3). hidrogéis formados são estáveis por longos períodos em PBS, mas a fixação das células e proliferation pode alterar (Figura 4).
Embora este protocolo é escrito para pulmão de porco, limitações de espaço nos limita a usar apenas um pulmão quando descelularizante pulmões de suínos. Temos usado o mesmo procedimento com pequena modificação para decellularize ambos os pulmões para outras espécies. Para os ratos e ratinhos, os pulmões pode ser deixado intacto e o coração em anexo, mas o tecido conectivo ainda deve ser removido com um bisturi ou tesouras. Nós manter o coração intacto e em anexo para ratos e camundongos e perfundir as soluções através do ventrículo direito em vez da artéria pulmonar. Perfusão da traqueia é ainda o mesmo; No entanto, a cânula pode ser suturado na traqueia para facilitar o acesso de espécies menores.
Temos adicionados vários tipos de células, as células estaminais mesenquimais humanas, 9 de ratinho células estaminais mesenquimais, as linhas celulares epiteliais humanas (A549s), endo humano microvascular primáriacélulas Thelial (HpuVECs), e células da veia umbilical humana (HUVECs) epiteliais dentro e na superfície dos hidrogéis ECM pulmão. Nós não encontrou problemas em relação a natureza xenogenética dos géis formados. O nosso trabalho anterior demonstrou uma redução significativa em α-galactosidase nos hidrogéis suína. 9 A solução de pré-gel pode também ser usado como um revestimento a 4 ° C, para melhorar a fixação celular. A solução Pregel melhora a adesão e proliferação HpuVEC quando adicionado a placas de cultura de tecido revestido de pulmão ECM. Poços revestidos demonstram melhorou significativamente a adesão celular em comparação com os poços não tratados (Figura 5).
Adicionando genipina aumenta hidrogel de ligação cruzada. Este aumento da reticulação pode proporcionar uma rigidez mais fisiologicamente relevante, ao diminuir a degradação do ECM. A diminuição da degradação, embora menor, in vitro, pode ocorrer devido a um aumento da ligação entreproteínas e, portanto, maior resistência à remodelação de ECM por células. Utilizou-se varrimentos de frequência num reómetro para medir as propriedades mecânicas do hidrogel reticulado. Hidrogel rigidez foi encontrado para ser directamente correlacionada com a concentração de genipina com a mediana e a concentração ser de 0,01% a mais relevante (Figura 6, o tecido nativo não mostrado). Um ensaio de MTT foi utilizado para quantificar a proliferação celular e sobrevivência no hidrogel reticulado. A proliferação celular é mais elevada no hidrogel reticulado (Figura 7). Isto suporta a proliferação celular aumentada em aumento da rigidez dos outros. 12 Variando genipina tempo ou temperatura de reticulação pode resultar em diferentes graus de reticulação.
Figura 1: Imagens dos pulmões Nós já decelularizado. Imagens de (A) Rato pulmão após decellularização e o coração removido, (B) de rato depois de Triton X-100 lavado, (C) do porco, antes de enxaguamento inicial; eles produzem ~ 5 mg, 40 mg, e 10 g de ECM pulmonar, respectivamente. (D) mouse pulmão e coração intacto, depois de descelularização, com a cânula ainda suturada no lugar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral dos métodos. Esta é uma visão geral do método para produzir hidrogéis de pulmões. Começando com en bloc decellularization de pulmão de porco ocorre deixando o tecido branco ou translúcido única opaco que é composta de proteínas da MEC. Em seguida, depois de remover qualquer água remanescente, e aumentando a área de superfície para optimizar a digestão ácida no tecido é solubilizada. Neutralização da ACid e aumentando o sal para níveis fisiológicos cria a solução Pregel pronto para gelificação. Uma vez que a solução forma um hidrogel, a 37 ° C, a caracterização tem lugar com um reómetro de microscopia electrónica de varrimento de gel e. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representante reológico de dados para gelificação sob rampa de temperatura. Depois de uma amplitude de varrimento inicial para determinar a gama viscoelástica linear, uma rampa de temperatura foi utilizada para determinar a cinética de gelificação. Os dados são apresentados como média +/- desvio padrão. n = 4.
Figura 4: estabilidade a longo prazo. um imidade de um hidrogel de pulmão de porco ECM armazenadas em PBS durante mais de 6 meses à temperatura ambiente.
Figura 5: Ensaio de HpuVECs metabólica. dados de proliferação MTT a partir de células endoteliais microvasculares humanas primárias (HpuVECs) cultivadas em placas de não-tratados de cultura de tecidos. Pregel solução de 1.3.3 foi adicionada às placas, refrigerado durante a noite e lavadas para formar placas revestidas de gel pré-ECM pulmão. HpuVECs mostrou maior atividade MTT em placas revestidas de ECM em comparação com não-revestido. * P <0,05 em relação ao controle. Os dados são ± desvio padrão n = 3 por grupo.
Figura 6: reológico de dados para reticulação melhorada. dados de reometria de reticulação genipina. A rigidez aumenta com o aumento das concentrações de genipin para um patamar de 1% genipina. Os dados são normalizados para mostrar um aumento de vezes na reticulação com genipina.
Figura 7; A proliferação celular em genipina reticulados Gel. dados MTT normalizados para A549s em hidrogéis reticulados genipina. O aumento da proliferação celular observada com o aumento da rigidez. p <0,05 em relação ao controle. Os dados são ± desvio padrão. n = 3 por grupo.
| Problema | Questão | Resolução |
| / Cor-de-rosa vermelha mantidas após a descelularização | decellularization ineficaz | Começar de novo com novos pulmões |
| Remover áreas de descelularização incompleta </ Td> | ||
| A oclusão vascular | Começar de novo com novos pulmões | |
| Remover áreas de descelularização incompleta | ||
| detritos celulares significativa retida | decellularization ineficaz | Começar de novo com novos pulmões |
| Remover áreas de descelularização incompleta | ||
| A oclusão vascular | Começar de novo com novos pulmões | |
| Remover áreas de descelularização incompleta | ||
| atelectasia | Começar de novo com novos pulmões | |
| Remover áreas de descelularização incompleta | ||
| Destruição das membranas encontrados em amostras histológicas | Excesso de pressurização de navios durante a perfusão | Reduzir a pressão de perfusãode detergentes |
| Grande partículas permanece após a moagem | Muito material liofilizado em tubo | Reduzir o material no cilindro de moagem |
| Não moída por tempo suficiente | aumentar o tempo de moagem | |
| solução Pregel não gelificação | Solução de pH demasiado elevado | Adicione pH 7,4 |
| Comece solução Pregel com pó fresco | ||
| Solução pH muito baixo | Adicione pH 7,4 | |
| Comece solução Pregel com pó fresco | ||
| ECM ao longo digerido | Comece solução Pregel com pó fresco | |
| As células não sobrevivem | Micróbios introduzidos após HCl digestão | Comece novamente com pó fresco e usar soluções filtradas estéreis |
| pH off | Comece solução Pregel novamente | |
| Adicione pH 7,4 | ||
| células explodiu | Fix teor de sal em solução Pregel |
Tabela 2: Resolução de problemas para identificar fontes de erro potencial.
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Discussion
Um dos aspectos integrais da biologia é a auto-organização das moléculas em estruturas hierárquicas que executam uma tarefa específica. 13 No laboratório, a auto-montagem depende de numerosos factores tais como a concentração de sal, pH, e a duração de digestão. Como mostrado, uma auto-organização de formas de hidrogel quando as proteínas solubilizadas retornar a uma temperatura fisiológica. O hidrogel formado é capaz de promover a adesão celular e a proliferação in vitro.
resposta celular aos sinais biofísicos de ECM não pode ser pesquisado usando polímeros. Tissue resposta celular específica para sinais biofísicos não pode ser pesquisada usando outros tecidos. pesquisadores de regeneração e clínicos acreditam que o uso andaimes descelularizados melhora a regeneração de tecidos e cicatrização de feridas. portadores de doenças pulmonares crônicas necessitam de melhorias terapêuticas para aumentar a disponibilidade de órgãos e diminuir a imunogenicidade. Órgão, interações célula-ECM específicos deve serpesquisado para mais biologia órgão.
Usando o ECM como um andaime para as células do pulmão de células mostrou resultados consistentes. 14,15 Usando fatias de pulmão a partir de modelos doentes incentiva a renovação doença 16-tronco ou progenitoras células, encontradas nos pulmões distais, 17,18 e exige nichos especiais para evitar a formação de teratomas. Utilizando tecido específico ECM como um veículo de entrega, os efeitos regenerativos de células progenitoras pode ser melhorada. O hidrogel ECM estabelece um ambiente mais aplicável para avaliar as reacções celulares a matriz extra-celular.
Um grande corpo de pesquisa existe olhando rigidez no que se refere à sinalização celular. Nosso método de reticulação genipina permitir a célula-rigidez sinalização, bem como célula-ECM interações de componentes. Enquanto rigidez hidrogel pode ser manipulado por ECM quantidade e proporção de proteínas, a utilização de genipina permite mudanças de rigidez de hidrogel tanto independente do teor de ECM. ajustar genconcentração EPIN pode permitir uma sintonização precisa das propriedades mecânicas para assemelhar-se mais estreitamente tecido natural pulmonar 6. A partir de dados obtidos usando genipina hidrogéis de pulmão periférica no presente estudo, um aumento de 15 vezes (de 5 Pa a 75 Pa) foi anotado. Com base em dados reológicos de tecido de pulmão normal de rato biopsiado que foi descelularizados utilizando os mesmos métodos, podemos conseguir aproximada da rigidez do tecido pulmonar periférica (dados não mostrados) através da adição de 1% de genipina de hidrogéis pulmonares periféricas ou a adição de 0,01% de hidrogéis pulmão inteiro (avaliado ). Usando o ECM pulmonar periférica que consiste de parênquima pulmonar feito um gel consideravelmente mais macio em comparação com os nossos resultados pulmão inteiro ECM hidrogel anteriormente publicados 7. Portanto, além de genipina, selecção de regiões específicas de tecido pulmonar para decellularize pode impactar significativamente a rigidez.
Existem oportunidades para melhorar este método, o que pode incluir passos adicionais habitualmente utilizados em perfusina descelularização do tecido pulmonar todo. Este método tem sido utilizado em tecido pulmonar normal e podem necessitar de modificação para descelularização de pulmões doentes. Nós ainda não analisou este processo em estados de doenças específicas. Obtemos nossos pulmões remetidos em gelo durante a noite de um matadouro. Este método poderia limitar a eficácia do nosso processo devido à atelectasia ou oclusão vascular; no entanto, raramente temos para remover áreas de pulmão que não foram completamente descelularizados. Ao obter o tecido pulmonar fresco, nós recomendamos fazer todas as soluções necessárias antes de começar os pulmões para evitar qualquer pausa no processamento de tecidos. Pesquisas anteriores descobriram que o uso de ácido peracético como uma fase de esterilização final a matriz produtiva provoca uma regenerativa fenótipo de macrófagos M1 na infiltração de células do sistema imunológico, 19 potencialmente melhorando efeitos proregenerative de tecido decelularizado. Outra pesquisa tem ido para o uso de outros detergentes para concluir o processo, mas aqueles appear ser preferências específicas de laboratório com finalmente o mesmo impacto sobre a descelularização. O procedimento e digestão passos decelularização possa ser otimizado, dependendo da aplicação específica do pesquisador. Por exemplo, alterar o tempo de neutralização ou métodos de digestão de gel pode alterar a composição de proteína, propriedades mecânicas, ou cinética de gelificação.
Alternativas para o método discutido aqui pode variar no nível de complexidade de acordo com os resultados experimentais desejados. Por exemplo, se o objectivo era manter a membrana basal intacta, tanto quanto possível, uma bomba de perfusão com um controlo limitado pressão pode diminuir danos na barreira. Além disso, se um tinha uma configuração de laboratório disponível para manter ambos os pulmões intactos para as espécies maiores, o processo de descelularização pode melhorar a eficácia. Por outro lado, uma mão de moagem técnica com um almofariz e pilão pode ser aplicada ao tecido liofilizado para laboratórios que não têm um CryoMill. Seria de esperar que grindin mãog para produzir fragmentos maiores, o que limita a área da superfície disponível para a digestão com ácido de modo que os tempos de digestão pode precisar de ser alterada neste caso.
Alternativas não estão limitados aos passos descelularização e à formação de hidrogéis. Gluteraldeído tem sido utilizado como um agente de reticulação para hidrogeles, proporcionando uma alternativa possível para o aumento da resistência mecânica dos hidrogeles biológicos utilizados para sistemas modelo. Outros sistemas modelo incluem pulmões descelularizados intactas como um in vitro sistema de cultura 3D, ou mais comumente olhando fatias pulmonares como um modelo 3D in vitro andaime. 20 Já mencionamos as limitações que vêm de trabalhar com andaimes de polímeros, bem como andaimes de componentes individuais, mas aqueles permanecer como possíveis alternativas para o procedimento apresentado aqui. Além disso, existem métodos alternativos para determinação da eficácia descelularização (tais como o isolamento do ADN), a gelificação (pode usar ensaios de turbidez), e uma ligação de célulasproliferação nd (como o uso de CCK8). Descobrimos que os métodos descritos aqui são mais que suficientes para caracterizar hidrogéis para uso como andaimes modelo 3D.
Os hidrogéis ECM pulmonares que descrevemos aqui fornecer uma plataforma eficaz para estudar as interações célula-ECM. A solução Pregel tem potencial como um revestimento para transportadores de droga de polímero, ajudar na distribuição de células estaminais mesenquimais, ou como plataforma de administração de fármaco por si só. O protocolo aqui apresentado fornece os passos para a criação de uma base de hidrogel versátil derivado de ECM pulmão.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Nós gostaríamos de agradecer fazendas Smithfield pela doação do tecido pulmonar porcina intacta. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang e do Departamento de Cirurgia Plástica VCU por nos permitir usar o seu equipamento. amostras de hidrogel e de tecido foram preparados para MEV no Departamento de Anatomia e Neurobiologia Microscopia Facility VCU apoiado, em parte, pelo financiamento do NIH-NINDS Centro Núcleo Grant 5 P30 NS047463 e, em parte, pela forma de financiamento NIH-NCI Cancer Center Support Grant CA016059 P30. SEM imagem de amostras no VCU Nanotechnology Núcleo Caracterização Facility (NCC). Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation, CMMI 1.351.162.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
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