Summary
Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.
Abstract
Het zenuwstelsel bestaat uit een breed assortiment van verschillende neuronale types. Deze neuronale subpopulaties worden gekenmerkt door, onder andere functies, hun verschillende dendritische morfologie, hun specifieke patronen van axonale connectiviteit, en hun selectieve stoken reacties. De moleculaire en cellulaire mechanismen die aan deze aspecten van differentiatie tijdens de ontwikkeling nog steeds slecht begrepen.
Hier beschrijven we gecombineerde protocollen voor etikettering en karakteriseren van de structurele connectiviteit en prikkelbaarheid van corticale neuronen. Wijziging van de in de baarmoeder elektroporatie (IUE) protocol maakt de etikettering van een geringe bevolkingsdichtheid van neuronen. Dit op zijn beurt maakt de identificatie en het volgen van de dendrieten en axonen van individuele neuronen, de precieze karakterisering van de laminaire locatie van axonale uitsteeksels en morfometrische analyse. IUE kan ook worden gebruikt om veranderingen in de prikkelbaarheid van onderzoekenwild-type (WT) of genetisch gemodificeerde neuronen door het te combineren met whole-cell opname van acute plakjes geëlektroporeerd hersenen. Deze twee technieken bijdragen tot een beter begrip van de koppeling van structurele en functionele connectiviteit en de moleculaire mechanismen die neuronale diversiteit tijdens de ontwikkeling. Deze ontwikkelingsprocessen hebben belangrijke gevolgen voor de axonen bedrading, de functionele diversiteit van neuronen, en de biologie van cognitieve stoornissen.
Introduction
De ontwikkeling van de dendritische en axonale structuren is een belangrijk facet van het circuit regelgeving in het zenuwstelsel, met inbegrip van in de cerebrale cortex. Het speelt een belangrijke rol tijdens de selectieve bedrading van de verschillende neuronale subpopulaties. Een aantal recente rapporten aangetoond dat, naast verbinding, wordt de moleculaire diversiteit van neuronen gereflecteerd door het verkrijgen van zeer specifieke wijze van bakken. De mechanismen die de exciteerbaarheid en connectiviteit van de afzonderlijke neuronale subtypes tijdens de ontwikkeling, en de mate van coördinatie, zijn nog slecht begrepen 1, 2.
In vivo verlies- en gain-of-function analyses oog op het onderzoek naar de relatie tussen de expressie van specifieke genen en hun invloed op de ontwikkeling van de schakeling. In utero elektroporatie (IUE) is een techniek veel gebruikt studerende functie van een gen van belang in specifieke neuronale populaties en de algemene patronen van de verbindingen te bestuderen. Echter, de morfologische kenmerken van axonen en dendrieten in corticale lagen in levende muizen te bepalen, is het essentieel om neuronen dun label. Een Cre recombinatie systeem gecombineerd met IUE kan worden gebruikt om een schaarse populatie van neuronen te markeren op een voldoende lage dichtheid dat uitstekende uitgezonden door individuele cellen van de geïdentificeerde corticale laminas lossen. Deze methode etiketten voldoende aantal neuronen per cortex kwantitatieve gegevens te verkrijgen na de analyse van redelijke hoeveelheden geëlektroporeerd hersenen (figuur 1). Het manuscript geeft een werkwijze voor zulke fijne analyse van connectiviteit. Het bevat ook een soortgelijke strategie te analyseren, in afzonderlijke experimenten, de elektrische eigenschappen van neuronen door het uitvoeren stroom-clamp op groene fluorescentie eiwit (GFP) -geëlektroporeerde cellen acute corticale schijfjes. deze proprotocollen zijn veelzijdig en kan worden toegepast op de studie van de prikkelbaarheid van neuronen en connectiviteit van WT en transgene dieren, alsmede van neuronen waarbij verliezen en winsten functie van aanvullende plasmiden worden geïntroduceerd tijdens IUE.
Hoewel dit protocol beschrijft de elektroporatie van muizen op embryonale dag (E) 15,5 Deze techniek kan worden uitgevoerd op elke leeftijd tussen E9.5 en postnatale dag 3 (P) 2 4. Terwijl elektroporatie in een vroeg stadium is gericht op neuronen en voorlopers van de thalamus en de diepe lagen van de cortex, later stadium elektroporatie merken meer oppervlakkige lagen (bv E15.5 IUE targets laag II-III neuronen). Samengevat, de combinatie van IUE met eencellige morfologische analyse en elektrofysiologie is een nuttig hulpmiddel om de moleculaire mechanismen waardoor enorme structurele en functionele diversiteit van neuronen in het zenuwstelsel helderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Gemeenschap van Madrid Animal Care en gebruik Comite, in overeenstemming met de nationale en Europese wetgeving (PROEX 118/14; PROEX 331/15). Handhaaf steriele omstandigheden tijdens de procedure.
1. In Utero Elektroporatie
Opmerking: Dit protocol voor IUE wordt aangepast van anderen die eerder zijn gepubliceerd 5, 6, 7. Dit manuscript beschrijft een protocol voor de IUE van E15.5 embryo, met modificaties in de reporter strategie die het mogelijk maken voor de studie van de morfologie van afzonderlijke neuronen 8 en de elektrofysiologische eigenschappen in een afzonderlijk experiment met standaard GFP reporter plasmiden.
- De voorbereiding van de DNA
- Bereid DNA plasmiden met een endotoxine isolatiemedium kit volgens instructies van de fabrikant en verdun ze in 1x pHosphate-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voor eencellige labeling, bereid 10 pl DNA mengsel per operatie (1 pl per embryo) met de volgende constructen en eindconcentraties: plasmide dat codeert voor een fluorescerend eiwit reporter (bijvoorbeeld CAG-DsRed2 9), 1 ug / ul als controle voor elektroporatie efficiëntie; experimentele plasmide te testen, kenmerkend bij 1 ug / ul; LoxP-stop-LoxP-fluorescerend eiwit plasmide (CALNL GFP-10), 1 ug / ul; en de bouw-coderend Cre 10, 1-4 ng / ul. Voeg 1 pl 0,1% Fast Green in water (gewicht / volume), hetgeen de geïnjecteerde DNA te visualiseren.
OPMERKING: Cre recombinatie van het GFP-construct komt slechts in enkele neuronen, die de visualisatie en reconstructie van individuele axonale uitsteeksels (Figuur 1A) toelaat. - Voor standaard patch-clamp studies, voor te bereiden 10 ul van DNA-mengsel per chirurgie (1 pl per embryo) van de volgende plasmide dat codeert voor een fluorescent eiwit (bijvoorbeeld GFP CAG-11), 1 ug / ul als reporter controle; experimentele plasmide, meestal 1 ug / ul; en 1 pi van 0,1% Fast Green in water (gewicht / volume).
Opmerking: Dit zijn de standaard elektroporatie omstandigheden die acute plakjes met een groot aantal gelabelde exciterende neuronen in de gewenste lamina analyseren. Om patch-clamp studies uit te voeren in enkele cellen, de voorbereiding van de DNA zoals beschreven in stap 1.1.1.1.
- Voor eencellige labeling, bereid 10 pl DNA mengsel per operatie (1 pl per embryo) met de volgende constructen en eindconcentraties: plasmide dat codeert voor een fluorescerend eiwit reporter (bijvoorbeeld CAG-DsRed2 9), 1 ug / ul als controle voor elektroporatie efficiëntie; experimentele plasmide te testen, kenmerkend bij 1 ug / ul; LoxP-stop-LoxP-fluorescerend eiwit plasmide (CALNL GFP-10), 1 ug / ul; en de bouw-coderend Cre 10, 1-4 ng / ul. Voeg 1 pl 0,1% Fast Green in water (gewicht / volume), hetgeen de geïnjecteerde DNA te visualiseren.
- Bereid DNA plasmiden met een endotoxine isolatiemedium kit volgens instructies van de fabrikant en verdun ze in 1x pHosphate-gebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Voorbereiding voor Heelkunde
- Voer een survival operatie door gebruik te maken van aseptische procedures. Zorgen voor steriele omstandigheden, met inbegrip van maskers, handschoenen, instrumenten en chirurgische veld. Steriliseren chirurgische instrumenten (scalpel, Adson tang, gehard fijne schaar, gebogen schaar, Dumont tang, en naaldhouder).
- Kies borosilicaatglas haarvaten van 1 / 0,58-mm buiten- / binnendiameter. pull capillaries 3. Doel voor een optimale tip lengte van 1 cm na het trekken. Snijd de naald op ongeveer een hoek van 30 ° met behulp van fijne pincet (Figuur 1B).
- Bereid 500 ml steriele isotone oplossing (1x PBS of Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)). Add penicilline-streptomycine 1: 100 en warm deze oplossing tot 37 ° C. Het kan worden opgeslagen bij 4 ° C na de operatie.
- Subcutaan injecteren van een dosis preoperatieve analgetica (bv, carprofen, 5 mg / kg lichaamsgewicht).
- Houd de dieren warm chirurgie door ze op een verwarmingselement. Warm een schone kooi 37 ° C voor postoperatief herstel.
3. Chirurgie
- Verdoven een C57BL / 6 E15.5 zwangere muis met isofluraan. Eerst trekken een gesloten kamer met 3% isofluraan in 0,8 l / min zuurstof en laat de muis binnen totdat deze slaapt. Breng de muis om een verwarmingselement en plaats de neus en mond in een masker voor te levereny van isofluraan. Geleidelijk verdoving afnemen in de loop van de operatie tot 1,5% isofluraan via masker. Bevestig de juiste verdoving door het observeren van een verlies van het pedaal reflex (teen knijpen). De optimale procedure duurt ongeveer 20 minuten en niet meer dan 45 min.
- Toepassen oogzalf te voorkomen dat de ogen uitdrogen tijdens de procedure.
- Verwijder het haar van een ~ 3 cm gebied van de buik (met behulp van een elektrisch scheerapparaat of ontharingscrème). Was de chirurgische gebied met wattenstaafjes doordrenkt met 70% ethanol, gevolgd door een jodium doordrenkt wattenstaafje. Herhaal dit drie keer.
- Bedek het chirurgische gebied met steriel gaas om infecties te voorkomen.
- Gebruik de scalpel om een verticale opening door de huid 2 cm lang en evenwijdig aan de middellijn te maken. Scheid de huid en spieren van de buik met behulp van stompe gebogen schaar. Houd de spier met de tang en snijd het door de linea alba aan de buikholte bloot te leggen.
- Zoek de embryo's met de hulp of de tang. Bevochtig twee natte wattenstaafjes met de steriele zoutoplossing bereid in stap 2.3 en gebruik ze om een toegankelijke embryo manipuleren uit de opening. Plaats de wattenstaafjes rond het embryo en verwijder daarna voorzichtig beide uterine hoorns van de buikholte. Houd de embryo en de geopende buikholte gehydrateerd met warme zoutoplossing gedurende de procedure te voorkomen uitdrogen.
4. Injectie van DNA en elektroporatie
- Manipuleren van de embryo zachtjes met de vingers om de telencephalon lokaliseren (duidelijk worden gevisualiseerd door het oog als de twee voorste vesicles van de hersenen). Plaats een voorbereide borosilicate capillaire in een mond pipet. Voorbij de punt van de naald door de baarmoeder, het vermijden van bloedvaten, totdat één laterale ventrikel bereikt. Injecteer langzaam ongeveer 1 pi van Fast Green-gekleurde DNA-oplossing tot een grote blauwe plek wordt waargenomen.
- Plaats de 7 mm platina-elektroden lateraal op The hoofd van het embryo (figuur 1C).
LET OP: DNA is negatief geladen; Daarom beweegt naar de positieve elektrode wanneer spanning wordt aangebracht tussen de platina elektroden. Door het variëren van de locatie van de elektroden kunnen verschillende hersengebieden worden gericht. - Solliciteer spanning via de platina-elektroden (voor E15.5 embryo's:. 5 pulsen, 38 V, 50-ms interval cyclus lengte, 950 ms interval pauze Deze voorwaarden zijn afhankelijk van het ontwikkelingsstadium) 12.
OPMERKING: Zie tabel 1 voor het voltage en de elektroden voor de verschillende embryo fasen. - Herhaal stap 4,1-4,3 per embryo.
5. Einde van de Chirurgie en Postoperation
- Gebruik wattenstaafjes om de baarmoeder terug te manipuleren om de moeder. Vul de buikholte met verwarmde zoutoplossing (voeg ongeveer 2 mL).
- Hecht de spier met eenvoudige onderbroken steken of een continue steek. Gebruik # 6-0 hechtdraads.
- Gebruik nietjes de externe wond sluiten. Wees voorzichtig op de huid van de spier te scheiden voordat u nieten. Verwijder de neus masker.
- Laat de muis om te herstellen gedurende 30 minuten in het verwarmde, schone kooi voordat u hem in het dier faciliteit kamer. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan in het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet plaatsen.
- Toezicht te houden op het dier tijdens de dagen na de operatie. Toepassen analgetica subcutaan (carprofen, 5 mg / kg lichaamsgewicht) per 12 uur gedurende 2 dagen of volgens regelgeving dier. Geen extra nabehandeling nodig voor de pups.
6. Voorbereiding en analyse van de monsters
- Optioneel: On P2, controleer voor de expressie van fluorescentie in de geëlektroporeerd pups met behulp van een fluorescentiemicroscoop; wanneer de IUE succesvol is, fluorescentie is duidelijk te zien in de kop 13. Merk of scheiden van de muizen die positief geëlektroporeerd voor gebruik in de volgende stappen. Houd de dam en pups in standaard dier faciliteit omstandigheden.
- Aan de gewenste fase van de studie, perfuseren de muizen transcardially. Typisch, de actieve fase van dendritische en axonale groei overeenkomt met de eerste drie weken postnataal 2, 14, 15.
- Bereid 30 ml van 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS per muis en chill het op ijs.
LET OP: PFA is een bekend allergeen en kankerverwekkende stof. Het giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
OPMERKING: De hoeveelheid PFA nodig afhankelijk van de leeftijd van de muis (bijvoorbeeld voor P16, 20 ml voor de perfusie en 10 ml voor postfixatie nodig). - Bereid een ketamine-xylazine mengsel aan het dier verdoven met een 1: 1: 8 volumetrische verhouding van 100 ug / ml ketamine: 100 ug / ml xylazine: PBS (bereiden ongeveer 0,2 ml per muis).
- Verdoven de muis door intraperitoneaal injecteren van 0,2 ml van het mengsel bereid in stap 6.2.2.
- Plaats de verdoofde muis op zijn rug. Maak een horizontale snede boven de thorax met een scalpel. Snijd de spieren en het membraan met fijne schaar tot het hart kan worden waargenomen.
- Maak een incisie in het rechter atrium met de fijne schaar. Injecteer langzaam 20 ml PBS in de linker hartkamer met een 25-gauge naald om het bloed te verwijderen. Injecteer 20 ml PFA (stap 6.2.1) totdat de muis is stijf en de organen worden wit.
- Verwijder onmiddellijk de kop en maak een middellijn incisie in de huid van de hals aan de schedel. Voorzichtig afpellen de schedel met behulp van gebogen pincet en pak de hersenen. Wees extra voorzichtig niet te doorboren of beschadiging van de hersenen tijdens het verwijderen van de schedel. Zet de hersenen in 10 ml 4% PFA bij 4 ° C gedurende de nacht te postfix.
- Bereid 30 ml van 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS per muis en chill het op ijs.
- Cryoprotect vaste hersenen in 10 ml 30% sucrose in PBS bij 4 ° C gedurende 1-2 dagen, totdat ze zinken. Bereid 1-cm 3 aluminiumfolie blokjes. Vul het blokjes 2/3 van de weg met oktober Doe de hersenen binnen en vries ze door de invoering van de kubussen op droog ijs. Bewaar de hersenen bevroren bij -80 ° C.
- Plaats druppel oktober op het oppervlak van het objectplaatje, schil de aluminiumfolie van de histologie kubus en plaats de kubus in de gewenste oriëntatie aan het monster schijf boven op de vloeistof oktober Oefen een stevige druk totdat het is opgelost. Plaats het monster schijf in het monster hoofd van de cryostaat. Instelling van het preparaat (beweeg het in een gunstige positie ten opzichte van het mes / lemmet).
- Sectie de hersenen op de cryostaat. Selecteer 50-100 urn dikke drijvende vriescoupes 16 met behulp van een fijn penseel en plaats ze in PBS.
- Vlek indien gewenst.
LET OP: Voor de studie van axonale morfologie, kleuring met een GFP antilichaam wordt ten zeerste aanbevolen- Blokkeer de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 5% foetaal runderserum in PBS bevattende 0,5% Triton-X 100 (blokkeeroplossing). Incubeer overnacht bij 4 ° C met 1: 500 primair antilichaam (bijvoorbeeld konijn anti-GFP) verdund in blokkeeroplossing.
- Was de secties driemaal in PBS. Voeg 1: 500 secundair antilichaam (bijvoorbeeld, geit anti-konijn Alexa Fluor 488) verdund in blokkeeroplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was de secties driemaal in PBS.
- Tegenkleuring met DAPI (1: 10.000) in PBS met 0,5% Triton X-100 gedurende 10 min. Spoel de secties met PBS. Monteer de onderdelen in een waterig montage medium 16.
7. Imaging and Analysis
- Fluorescentie of confocale microscopie
- Om volledige neuronen reconstrueren de beelden te verkrijgen met een hoge vergroting (tenminste 40x) en hoge resolutie (minimum 1024 x 1024). Selecteer de "Tegel scan "of gelijkwaardig optie in de acquisitie software om het interessegebied, verspreid over alle dendrieten en axonale processen omvatten. Verwerven voldoende stapels op de z-as om verlies van informatie te voorkomen.
Opmerking: In het algemeen de microscoop software heeft een optie "geoptimaliseerde stack", maar als dit niet het geval, proef handmatig te bepalen hoeveel stappen nodig zijn om de beelden te overlappen om de individuele uitsteeksels definiëren. Twee cruciale parameters zijn pinhole en de doelstelling; rekening te houden met 'hogere vergroting, hogere resolutie en meer nodig z-stappen. "
- Om volledige neuronen reconstrueren de beelden te verkrijgen met een hoge vergroting (tenminste 40x) en hoge resolutie (minimum 1024 x 1024). Selecteer de "Tegel scan "of gelijkwaardig optie in de acquisitie software om het interessegebied, verspreid over alle dendrieten en axonale processen omvatten. Verwerven voldoende stapels op de z-as om verlies van informatie te voorkomen.
- Analyse
LET OP: Hoewel verschillende parameters kunnen worden geanalyseerd, stap 7.2.1 richt zich op twee: dendriet morfologie en axon vertakking. Download Fiji ( http://fiji.sc/ ).- Open de afbeelding, selecteert u de optie 'gesegmenteerde lijn "in het menu. Trek een lijn (op en neer bewegen langs the z-as door te scrollen de muis) volgens de structuur van het neuron. Ga naar "analyseren, gereedschap, ROI Manager, toevoegen" (U kunt ook op "t") om de lijn op te slaan. Herhaal dit proces voor elke axon of dendriet van de geanalyseerde neuron 2.
- In de ROI Manager Menu druk op de "Measure" knop om de lengte (of extra parameters) te krijgen. Exporteer de metingen naar een tekstbestand of een spreadsheet om ze te analyseren.
8. Electrofysiologie
Opmerking: Het doel van dit protocol is het gehele celstroom-clamp II / III piramidecellen neuronen visueel geïdentificeerd door GFP-expressie in GFP geëlektroporeerd muizenhersenen (of elk ander fluorescerend eiwit eerder geëlektroporeerd) ontvangt van laag. Het is een bewerking van eerder gepubliceerde werkwijzen 17, 18. Met dit protocol is het mogelijk om het effect van genetische modif bestuderenicatie ingevoerd bij IUE op de elektrische eigenschappen van het neuron. De overname van specifieke vuren modes is een geleidelijk proces van differentiatie dat de dynamische uitdrukking van een breed repertoire van ion kanalen werkt en dat resulteert in de expressie van voorbijgaande vuren modes voor late postnatale fase. Zo worden volwassen elektrische responsen niet waargenomen in laag II / III van de muis somatosensorische cortex voor P16 2, 19.
- Vereisten voor de acute plakjes
- Bereid steriele operatie-instrumenten om de hersenen van de muizen te verwijderen: een guillotine, om het hoofd te verwijderen; kleine schaar, door de schedel te snijden; tang, om de schedel uit weefsel te scheiden; een spatel, om delicaat hersenweefsel te verwijderen van de behuizing; een metalen snijmachine, de cortex in twee gelijke helften ontleden; en een Pasteur pipet, plakjes verplaatsen van de vibratome (plaats ze in een oplossing met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) voor inspectie, en vervolgens over de segmenten van ACSF om een incubatietijd wachtruimte).
- Bereid 1 liter ACSF indien water van hoge zuiverheid (tweemaal gedestilleerd water) met 119 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 11 mM glucose, 2,5 mM KCI, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2 en 1 mM NaH 2 PO 4. Titreer de pH op 7,3-7,4 met HCl of NaOH. Pas de osmolariteit tot 290 mOsm.
- Bubble ACSF met carbogeen (95% O2 / 5% CO 2) gedurende 15 - 20 min middels Teflon buizen (~ 1 mm), om de pH op 7,3 te stabiliseren - 7,4.
- Freeze 200 ml ACSF oplossing verzadigd met carbogeen bij -80 ° C gedurende 10 - 15 min een oplossing modderige ontleding genereren. Plaats een 100- x 20-mm weefselkweek schotel op ijs voor het snijden van de hersenen.
- Bereid 100 ml 1% laagsmeltende agarose oplossing net voor de start van het experiment. Koel de oplossing af, snijd een vierkant stuk agarose (afmetingen: 1 x 1 x 0,5 mm) en superlijm aan deachterkant van het platform, vlak achter waar de hersenen wordt gesneden (agarosegel biedt ondersteuning voor de hersenen tijdens het snijden). Maak de voorzijde zo vlak mogelijk.
- Het verkrijgen van acute plakjes
- Immobiliseren de muis en verdoven met isofluraan 2%. Plaats de kop in de guillotine opening en onthoofden het snel. Verwijder de schedel zo snel mogelijk met het gebruik van bot rangers of fijne tang. Doe de hersenen in het gekoelde ACSF.
NB: Het is belangrijk om deze stap snel uit te voeren. - Plaats de hersenen in de gekoelde cultuur schotel. Snijd de kleine hersenen met een klein schaartje.
- Pak de hersenen met een spatel en dep ze droog op keukenpapier.
- Lijm de ventrocaudale vlak van de hersenen op een vibratome houder. Plaats de houder op een vibratome gevuld met ijskoude ACSF.
- Verkrijgen van acute plakjes door het snijden van 300-um coronale secties (zorgen voor de voortdurende carbogenation gedurende de procedure, bijvoorbeeld, plaats een bubbler (1-mmpolytetrafluorethyleen buis) in de vibratome kamer) met de volgende vibratome instellingen: 0,06 mm amplitude en 0,08-0,10 mm / s snelheid. Stel het voorschot op de laagste mogelijke snelheid (~ 22 s per pas). Wijzig deze optimale instellingen en optimale omstandigheden voor elke machine empirisch indien nodig te verkrijgen.
- Incubeer de acute plakjes gedurende ten minste 60 min in ACSF aangevuld met 3 mM myo-inositol, 0,4 mM ascorbinezuur en 2 mM natriumpyruvaat, terwijl doorborrelen met 95% O2 / 5% CO2 gas. Handhaaf de temperatuur op 25 ° C.
- Voer het snijden procedure in minder dan 15 minuten. Desgewenst kan de plakjes worden bewaard 1-7 uur alvorens te worden overgebracht naar de opname kamer gebruikt.
- Immobiliseren de muis en verdoven met isofluraan 2%. Plaats de kop in de guillotine opening en onthoofden het snel. Verwijder de schedel zo snel mogelijk met het gebruik van bot rangers of fijne tang. Doe de hersenen in het gekoelde ACSF.
- Voorwaarden voor de whole-cell opname
- Zorg ervoor dat de elektrofysiologie station is uitgerust met een opname kamer, een perfusie-systeem, een microscoop, elektroden (opname, stimulerend, en gemalen), macro- en MICRomanipulators een stijve trillingsbestendige tafelblad en Faraday kooi, een stimulator, een versterker en analoog-naar-digitaal (A / D) omzetter, een computer met acquisitie software, en een GFP (of een andere fluorochroom) filter voor het analyseren genetisch gemodificeerde neuronen 18 (Figuur 2A).
- Bereid de intracellulaire oplossing bevattende 115 mM kaliumgluconaat, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 20 mM KCl, 4 mM Na 2 ATP en 0,3 mM Na 3 GTP, pH 7,2 met KOH en 290 mOsm door KCl.
- Maak patch pipetten door te trekken borosilicaatglas haarvaten. Bereid patch elektroden met behulp van een micropipet trekker. Met borosilicaat capillairen (1,5 mm uitwendige diameter, 0,86 mm inwendige diameter, 10 cm lengte). Maak patch elektroden toont weerstanden van 3-10 MQ wanneer gevuld met intracellulaire oplossing.
- Perfuseren de opname kamer met ACSF met een snelheid van 2 ml / min. Houd de temperatuur van de kamer bij approximlijk 33 ° C.
- Whole-cell opname
- Breng de plakjes in de opname kamer met behulp van een Pasteur pipet (afgesneden van de lange tip) of een klein borsteltje. Houd het schijfje met een harp. Perfuseren de plakjes constant met ACSF met een snelheid van 2 ml / min.
- Patch een GFP-positieve neuron.
- Doe het sneetje in de opname kamer en vind het gebied van belang door de microscoop bij een lage vergroting (10x). Dan, vind een GFP-positieve cel op te lappen met behulp van de 60x doelstelling.
- Vul het registratie-elektrode met intracellulaire oplossing. Gebruik de spuit gekoppeld aan het filter (4-mm filter) en micro-loader tip om de registratie-elektrode met intracellulaire oplossing te vullen.
- Plaats de glazen pipet in de pipet houder. Plaats de pipetpunt in het bad en focus op de tip. Zodra de pipet in het bad toepassen positieve druk door de rug drukregelsysteem.
- Patch een neuron dat fluorescerend is (Figure 2B).
- Benader de cel van belang onder visuele begeleiding tijdje terug het handhaven van de druk in de pipet. Bij het verschijnen van een kleine uitholling op het celoppervlak, laat de druk. Op dit punt kan een afdichting (weerstand groter dan 1 GQ) worden gevormd. Zo niet, breng dan een lichte negatieve druk (zuiging) om deze te versoepelen.
- Terwijl de afdichting wordt gevormd, brengt het bedrijf spanning klem tot -60 mV. Zodra de GQ afdichting wordt gevormd, breng dan een puls van zuiging aan het celmembraan onder de pipet scheuren en gaan in whole-cell modus. Zie referentie 20 voor meer informatie.
- Noteer de activiteit met de huidige-clamp voorwaarden 21. Eenmaal in whole-cell-modus, schakelen van voltage-clamp om de huidige-clamp-modus en start de opname. Bijvoorbeeld naar cel exciteerbaarheid nemen, gelden 500 ms durende depolariserende stroom injecties (100-400 pA).
- Bereken het afvuren tarieven by het uitzetten van het aantal actiepotentialen langs de trein voor het verhogen ingang stromingen.
LET OP: Rustend membraan potentieel, input weerstand, en het membraan capaciteit kan ook worden berekend op basis van de opnames 21.
- Bereken het afvuren tarieven by het uitzetten van het aantal actiepotentialen langs de trein voor het verhogen ingang stromingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De morfologische veranderingen van neuronen in detail en in ontwikkeling karakteriseren, is het essentieel om neuronen dun label. A Cre-recombinase verdund systeem maakt de expressie van een gen van belang in een schaarse populatie van neuronen, zodat alleen de neuronen die dit enzym bevatten GFP expressie (Figuur 1A). Met behulp van deze strategie, is laag II-III gerichte en gelabeld door IUE op E15.5. CAG-DsRed2 bij 1 ug / ul, gelijktijdig wordt geëlektroporeerd als controle en positieve geëlektroporeerd hersenen te identificeren in levende dieren. Belangrijker, na kleuring met anti-GFP-antilichaam, het signaal sterk genoeg om de duidelijke visualisatie van hun dendrietmorfologieën en axonen (figuur 1D en E).
Na IUE en elektrofysiologie, zijn de analyse van de parameters verkregen whole-cell opnames gebruikt samenMpare het afvuren reacties en prikkelbaarheid van geëlektroporeerde cellen onder verschillende omstandigheden. Verscheidene parameters kunnen worden verkregen. De parameters worden aangepast aan de specifieke studie met specifieke patch-clamp analysesoftware. Figuur 2C geeft een voorbeeld van de plot van de actiepotentialen tegen de ingangsstroom verkregen opnamen van een WT laag II-III neuron dat werd geëlektroporeerd in E15.5.
Figuur 1. Een Cre-recombinase Verwaterde strategie Hiermee Sparse Etikettering van corticale neuronen. A. Schematisch overzicht van de strategie. In neuronen die zowel CALNL-GFP en CRE, wordt de LoxP-STOP-LoxP cassette uitgesneden uit CALNL-GFP en GFP wordt tot expressie gebracht door de sterke CAG promotor. B. Schematische tekening van een boorsilicaat capillair getrokken met behulp van een micropipet trekker. De tip wordt doorsneden door forceps, het creëren van een hoek van 30 °. Meet 1 cm van de punt aan het begin van het smallere gedeelte van het capillair. C. Positie van de elektroden te richten op de somatosensorische cortex. De platina-elektroden zijn ongeveer over de oren van het embryo geplaatst. Door zijn negatieve lading, DNA gaat naar de positieve elektrode wanneer de spanning wordt aangelegd. Variatie in de positie van de elektroden toestaat gericht is op verschillende hersengebieden. D. afbeeldingen verkregen na vectoren werden op laag II-III neuronen uit met in utero elektroporatie in embryonale dag 15,5; coronale secties werden op postnatale dag 16. De CAG-DsRed2 vector werd samen getransfecteerd als controle (links). GFP (midden) wordt alleen tot expressie gebracht in die neuronen die ook Cre opgenomen, waardoor de recombinatie van de loxP plaatsen in de CALNL-GFP vector. De spaarzame etikettering maakt individuele neuronen te onderscheiden worden (pijlpunten). E. High-vergroting confocale beeld van thij Dendritische cilinders van een ander dun gelabeld GFP neuron. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Electrofysiologie Instellingen en Voorbeeld van een Firing Response. A. De foto toont de elektrofysiologie setup gebruikt voor patch clamp experimenten in acute plakjes. De opstelling is opgenomen in een kooi van Faraday te elimineren, en de apparatuur bovenop een antivibratietafel. Controllers van de gemotoriseerde micromanipulators de elektroden waargenomen aan de linkerkant. B. Piramidaal neuron van een muis geëlektroporeerd met GFP, waargenomen onder helder veld en groene fluorescentie omstandigheden. De opname pipet bevestigd aan een GFP + cellen merkbaar. Schaal bar = 10 & #181; m. C. Firing patronen van een CAG-GFP geëlektroporeerd control layer II-III neuron met de typische reguliere stekelige reactie. De verdeling van actiepotentialen benadert regelmatig langsheen de duur van ingangsstroom (X-as). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Stadium | Spanning | elektroden | Referenties |
| E9.5 | 7 V, 100 ms, 3 pulsen | Stok platina-elektroden | Matsui et al. 2011 3 |
| E12.5 | 30 V, 50 ms, 3-5 pulsen | Tang-elektroden 3 mm | Saito, T., 2006 12 | </ Tr>
| E15.5 | 35-48 V, 50 ms, 5 pulsen | Tang-type elektroden 5-7 mm | Rodriguez-Tornos et al. 2016 2, Saito, T., 2006 12 |
| P2 | 100 V, 50 ms, 5 pulsen | Tang-type elektroden 5-7 mm | Sonego et al. 2013 4 |
Tabel 1: Spanning Voorwaarden en Elektroden voor de elektroporatie van embryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft in detail hoe neuronen van de somatosensorische cortex van C75BL / 6 muizen label om hun connectiviteit en hun prikkelbaarheid analyseren. Bij de bestaande methoden, visualiseren uw onderscheidende aspecten van connectiviteit, zoals het aantal van axonale vertakkingen per neuron, de precieze topografie en de anatomische locatie. Door het veranderen van de positie van de elektroden, is het mogelijk te richten andere neuronenpopulaties, zoals de cingulate cortex (behoud van dezelfde hoek tussen de elektroden en de hersenen, maar verandert de oriëntatie van de polen) of hippocampus 5, en zal presteren experimenten labelen individuele neuronen of bredere populatie, afhankelijk van de gewenste strategie. Er zijn echter beperkingen aan deze, omdat niet alle bevolkingsgroepen gelijkelijk toegankelijk of even selectief gelabeld. Bijvoorbeeld, in de hippocampus, is het mogelijk om selectief richten late-geboren neuronen van de CA1-gebied, maar early elektroporatie markeert heterogene populaties van innerlijke en uiterlijke piramidale cellen. In de cerebrale cortex, neuronen zijn geboren in een sequentiële wijze, zodat de dag tijdens de dracht IUE bepaalt welke corticale laag wordt beïnvloed. Het uitvoeren van eerder IUE doelen dieper neuronen (bv, IUE op E14 etiketten laag IV neuronen) 22.
Voor een succesvolle IUE, verdient het aanbeveling om rekening te houden met bepaalde overwegingen. Ten eerste is het belangrijk om de operatie in minder dan 30 minuten om de spanning op de moeder te verminderen en de overlevingskansen van de pups verhogen. Ten tweede, het moeilijkste deel van de procedure is de injectie van het DNA-uitvoeren van de injectie via de boorsilicaat haarvaten zo voorzichtig mogelijk. Wanneer de embryo's te hard worden ingedrukt, kan deze worden beschadigd. In termen van het oplossen van de dood van de embryo's tijdens de DNA-injecties, afschuinen de tip met een hoek van 30 ° kan de werkzaamheid van dit pro verhogenproces. Als beveller niet beschikbaar is en de capillairen alleen gesneden met een pincet, kan de juiste hoek worden bevestigd in de stereomicroscoop. Gooi onvoldoende haarvaten. Tenslotte aanpassen van de elektroporatie omstandigheden tot het stadium van het embryo is belangrijk om de overleving te verhogen (zie tabel 1).
Enkele overwegingen nodig, wat tot de reconstructie van axonen en dendrieten. Om individuele neuronen labelen de juiste concentratie van het Cre plasmide zijn essentieel voor een goede, dun expressie te verkrijgen en om de verwarrende overlapping van neuronale uitsteeksels die tot verschillende neuronen voorkomen. Hoewel dit protocol stelt het gebruik van 4 ng / pl, kan het nodig zijn de plasmideconcentratie passen voor elk experiment, afhankelijk van de gebruikte promotor, de kwaliteit van het DNA preparaat en de werkwijze voor DNA kwantificering (bijvoorbeeld reduceren tot 2 ng / ul indien voor de etikettering te veel neuronen). in additiop voor axonale volgen, is het belangrijk om een geschikte hoek te snijden om de gehele neuron in hetzelfde vlak zijn.
Kritische stappen voor succesvolle patch-clamp de gezondheid van het weefsel van de acute plakjes en de locatie en de grootte van geëlektroporeerd GFP-positieve neuronen. Als het patchen stappen niet of afwijkende antwoorden worden gevonden tijdens de opnames, het verminderen van de tijd voor het verwerken van de acute plakjes. Als GFP neuronen zijn moeilijk te identificeren en te lokaliseren door hun geringere aantallen in de acute segment, dat voldoende CAG-GFP plasmide wordt opgenomen in de elektroporatie mix. Wat de belangrijkste beperkingen van de hierin beschreven methoden, de patch-clamp techniek kan de opname van verschillende parameters die de prikkelbaarheid van het neuron, maar niet aspecten die afhangen van het hele circuit te evalueren. Ook, en als hiervoor bedoeld, niet alle neuronale subpopulaties zijn toegankelijk via IUE. Samengevat, in the toekomst kunnen deze technieken bijdragen aan de verdere analyse van de structurele en functionele connectiviteit van de verschillende neuronale subpopulaties in de hersenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor R. Gutiérrez en A. Morales voor hun uitstekende technische bijstand en naar LA Weiss om te bewerken. CGB wordt gefinancierd door het Spaanse Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van BBVA Foundation en SAF2014-58598-JIN (MINECO) naar M. Navarrete en door een subsidie van de Ramón Areces Foundation en subsidies SAF2014-52119-R en BFU2014-55738-Redt (van MINECO) naar M. Nieto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP | |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP | |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP | |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP | |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 | |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Scalpel Handle # 3 - 12 cm | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades # 10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Adson Forceps-Serrated - Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Hardened Fine Scissors - Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14.5 cm | Teleflex | PO143281 | |
| Thin curved tips - Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Mathieu Needle Holder - Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 | |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL | |
| 9 mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 | |
| Sutures - Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 | |
| Borosilicate glass capillaries (100 mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 | |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | - | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 | |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 | |
| OCT Compound | Sakura | 4583 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 | |
| Microscope for Fluorescent Imaging - MZ10F | Leica | - | |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | - | |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | - | |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | - | |
| Cryostat - CM 1950 | Leica | - | |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | - | |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A | |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 | |
| Air Table | Newport | - | |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | - |
References
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
