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Biochemistry

1,2-Azaborines के संश्लेषण और टी -4 Lysozyme म्यूटेंट के साथ उनके प्रोटीन परिसरों की तैयारी

Published: March 25, 2017 doi: 10.3791/55154
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Boston College

Introduction

बोरान-नाइट्रोजन heterocycles (यानी 1,2-azaborines) युक्त हाल ही में ARENES की isosteres के रूप में महत्वपूर्ण ध्यान आकृष्ट किया है। इस isosterism मौजूदा संरचनात्मक रूपांकनों के विविधीकरण के लिए नेतृत्व रासायनिक अंतरिक्ष 2, 3, 4 विस्तार करने के लिए कर सकते हैं। Azaborines विशेष रूप से औषधीय रसायन विज्ञान के क्षेत्र में जो दवा की दुकानों संरचनात्मक रूप से पुस्तकालयों और कार्यात्मक प्रासंगिक अणुओं के संश्लेषण के लिए बाहर ले जाने में, जैव चिकित्सा अनुसंधान 5, 6, 7, 8 में आवेदन के लिए संभावित उपयोगिता है। गौरतलब है कि हालांकि, जबकि वहाँ उपलब्ध arene युक्त अणुओं के लिए कई अच्छी तरह से विकसित सिंथेटिक मार्गों कर रहे हैं, केवल azaborines के संश्लेषण के लिए तरीकों की एक सीमित संख्या में सूचित किया गया है 9, 10, 11, 12, 13 अप। इस बोरान स्रोत और हवा और सिंथेटिक अनुक्रम के प्रारंभिक चरण में अणु की moisture- संवेदनशील प्रकृति के लिए विकल्पों में से एक सीमित संख्या के कारण मुख्य रूप से है।

इस लेख के पहले भाग में, हम एन -TBS- बी -Cl-1,2-azaborine (3) का उपयोग कर मानक एयर मुक्त तकनीकों का एक बहु-ग्राम पैमाने संश्लेषण का वर्णन करेंगे। इस परिसर में एक बहुमुखी मध्यवर्ती कि आगे संरचनात्मक रूप से और अधिक जटिल अणुओं 14, 15 को क्रियाशील किया जा सकता है के रूप में कार्य करता है। 3 से शुरू, संश्लेषण और प्रोटीन बाध्यकारी पढ़ाई में उपयोग के लिए एन बी -H- -ethyl-1,2-azaborine (5) की शुद्धि वर्णित किया जाएगा। 5 की अस्थिरता के कारण, अपने कुशल अलगाव प्रतिक्रिया तापमान, समय, और जिले के सटीक नियंत्रण की आवश्यकता हैनतीजा शर्तों।

दूसरे भाग में, प्रोटीन अभिव्यक्ति और टी -4 लाइसोजाइम म्यूटेंट (L99A और L99A / M102Q) 17, 18, 19 के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल, 20 से प्रस्तुत किया जाएगा, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण और प्रोटीन ligand क्रिस्टल परिसरों की तैयारी द्वारा पीछा किया। टी -4 लाइसोजाइम म्यूटेंट L99A और L99A / M102Q राष्ट्रीय राजमार्ग azaborine अणुओं 17 युक्त हाइड्रोजन संबंध क्षमता की जांच के लिए जैविक मॉडल प्रणाली के रूप में चुने गए हैं। एक मानक आणविक जीव विज्ञान प्रोटोकॉल का प्रयोग, प्रोटीन कोलाई RR1 तनाव में व्यक्त किया और isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) के साथ प्रेरित है। प्रोटीन शुद्धि आयन एक्सचेंज स्तंभ क्रोमैटोग्राफी का उपयोग किया जाता है। प्रोटीन क्रिस्टलीकरण अत्यधिक ध्यान केंद्रित शुद्ध प्रोटीन समाधान (> 95% शुद्धता जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा) के साथ किया जाता है फांसी का उपयोग करवाष्प प्रसार विधि ड्रॉप। ऑक्सीजन के लिए इस अध्ययन के ligands की संवेदनशीलता की वजह से, प्रोटीन ligand परिसरों हवा मुक्त परिस्थितियों में तैयार किया जाता है।

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Protocol

नोट: सभी ऑक्सीजन और नमी के प्रति संवेदनशील जोड़तोड़ माहौल निष्क्रिय (एन 2) या तो मानक एयर मुक्त तकनीक या एक दस्ताना बॉक्स का उपयोग कर के तहत बाहर किया गया था। THF (tetrahydrofuran), एट 2 ओ (Diethyl ईथर), सीएच 2 सीएल 2 (क्लोराइड), टोल्यूनि, और पैंटेन आर्गन के तहत एक तटस्थ एल्यूमिना कॉलम के माध्यम से गुजर द्वारा शुद्ध किया गया। Acetonitrile CAH 2 (कैल्शियम हाइड्राइड) पर सूखे और नाइट्रोजन वातावरण का उपयोग करने से पहले के तहत आसुत किया गया था। पीडी / सी (कार्बन पर पैलेडियम) 12 घंटे पहले का उपयोग करने के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर उच्च वैक्यूम के तहत गर्म था। सिलिका जेल (230-400 जाल) उच्च वैक्यूम के तहत 180 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए सूख गया था। फ्लैश क्रोमैटोग्राफी माहौल निष्क्रिय तहत इस सिलिका जेल के साथ प्रदर्शन किया गया था। अन्य सभी रसायनों और विलायकों खरीदा है और के रूप में प्राप्त किया जाता था।

नोट: सावधानी, उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श लें। संश्लेषण एक में प्रयुक्त रसायनों के कईतीव्रता से विषाक्त और कासीनजन रहे हैं।

1. 1,2-Azaborines की तैयारी

नोट: इस अध्ययन में सभी यौगिकों की विशेषता डेटा पहले, 16 12 सूचित किया गया है, 13।

आकृति 1
चित्र 1: 1,2-azaborines की सिंथेटिक योजना। प्रत्येक यौगिक (1-5) के संश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल खंड में वर्णित हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. एन की तैयारी -allyl- एन -TBS- बी -allyl क्लोराइड अभिवर्तन (1)
    1. एक दस्ताना बॉक्स में, बाहर 6.70 ग्राम (50.0 mmol) triallylbora को मापनेne 22 एक ओवन में सुखा 24/40 1 एल दौर नीचे कुप्पी में एक हलचल पट्टी से लैस है और 250 एमएल क्लोराइड जोड़ें। एक रबर पट साथ कुप्पी सील। बॉक्स के बाहर, समाधान शांत करने के लिए -78 डिग्री सेल्सियस एक वैक्यूम गैस कई गुना पर एक नाइट्रोजन वातावरण के तहत।
    2. प्रवेशनी हस्तांतरण के माध्यम से -78 डिग्री सेल्सियस पर triallylborane समाधान के लिए हेक्सेन में 1.00 मीटर बोरान trichloride समाधान (100 mmol) की 100 एमएल जोड़ें। 4 घंटे के लिए इस तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण हलचल करते हैं।
      नोट: सावधानी, बोरान trichloride पानी के साथ उच्च प्रतिक्रियाशील है।
    3. (टी -butyldimethylsilyl) - - एक अलग 100 मिलीलीटर फ्लास्क में, 25.7 ग्राम एन बाहर उपाय एन -allylamine (150 mmol) और 20.0 एमएल क्लोराइड जोड़ें। 1 एल प्रतिक्रिया फ्लास्क, प्रवेशनी -78 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया तापमान को बनाए रखने के हस्तांतरण के माध्यम से इस समाधान जोड़ें।
    4. 21.0 एमएल triethylamine (150 mmol) प्रतिक्रिया में जोड़े। नाइट्रोजन का एक सकारात्मक प्रवाह के तहत सरगर्मी बनाए रखने और यह धीरे-धीरे गर्म आरओ के लिए करने की अनुमतिओम तापमान रात भर।
    5. सरगर्मी के 18 घंटे के बाद, एक तरल नाइट्रोजन जाल के साथ उच्च निर्वात (300-500 mTorr) का उपयोग कर एक वैक्यूम गैस कई गुना के माध्यम से विलायक के लगभग एक से डेढ़ को हटा दें।
    6. एक दस्ताना बॉक्स में प्रतिक्रिया कुप्पी ले लो और एक ओवन में सुखा मध्यम porosity एक हलचल के साथ एक 24/40 वैक्यूम एडाप्टर के साथ सुसज्जित मिलाना और एक 24/40 500 एमएल दौर नीचे कुप्पी के माध्यम से सफेद नमक प्रतिक्रिया मिश्रण में गठित ऑफ फिल्टर बार। सभी शेष सामग्री के हस्तांतरण के लिए क्लोराइड का प्रयोग करें।
    7. उच्च वैक्यूम के साथ एक वैक्यूम गैस का उपयोग कर कई गुना बॉक्स के बाहर छानना से सभी शेष वाष्पशील निकालें।
    8. एक दस्ताना बॉक्स में, केंद्रित प्रतिक्रिया मिश्रण एक ओवन में सुखा 14/20 100 एमएल में दौर नीचे कुप्पी हलचल पट्टी के साथ आसवन के लिए तैयार करने के लिए स्थानांतरण। एक पट साथ कुप्पी कैप।
    9. नाइट्रोजन का एक प्रवाह के तहत, जल्दी से पट खोलने के लिए और एक सुखाने एजेंट के रूप में 200 मिलीग्राम कैल्शियम हाइड्राइड जोड़ें।
    10. एक oven- फिटिंग द्वारा आसवन उपकरण सेट अपसूखे 14/20 आसवन सिर एक थर्मामीटर के साथ जुड़ा है, एक प्राप्त 14/20 50 एमएल हवा मुक्त भंडारण कुप्पी के साथ एक तरफ और कच्चे तेल उत्पाद युक्त 100 एमएल कुप्पी के साथ दूसरे पक्ष। ठंडा पानी के साथ आसवन सिर से लैस। (आसवन तंत्र के सभी जोड़ों के लिए तेल का प्रयोग करें।)
      नोट: उत्पाद गढ़ने के लिए जब वाष्प तापमान 300 mTorr में 60 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है शुरू होता है।
    11. तेल स्नान का तापमान बढ़ाने तक आसवन सिर थर्मामीटर 75 डिग्री सेल्सियस पढ़ता द्वारा उत्पाद एकत्रित जारी रखें।
      नोट: उत्पाद एक स्पष्ट बेरंग तरल है।
    12. गर्मी स्रोत को हटाने के द्वारा आसवन बंद करो और भंडारण करने से पहले कमरे के तापमान को शांत तंत्र। ठंडा होने पर, नाइट्रोजन के साथ तंत्र repressurize और कसकर हवा मुक्त भंडारण कुप्पी पर प्लग वाल्व बंद कर दें। एक दस्ताना बॉक्स फ्रीजर में पृथक उत्पाद की दुकान।
      ध्यान दें: उपज 65% से 84% करने के लिए भिन्न हो सकते हैं।
  2. एन की तैयारी बी -Cl अंगूठी बंद उत्पाद (2)
    1. एक दस्ताना बॉक्स में, बाहर 56.0 हलचल पट्टी के साथ एक ओवन में सुखा 24/40 1 एल दौर नीचे फ्लास्क में जी एन एन -allyl- -TBS- बी -allyl क्लोराइड अभिवर्तन (1) (217 mmol) को मापने और 500 जोड़ने एमएल टोल्यूनि।
    2. बाहर उपाय 1.79 छ Grubbs 1 सेंट पीढ़ी उत्प्रेरक (2.17 mmol)।
    3. उत्प्रेरक भाग-वार सरगर्मी एक दस्ताना बॉक्स में कमरे के तापमान पर 1 के समाधान के लिए जोड़ें। इसके अलावा दौरान बॉक्स शुद्ध एथिलीन गैस प्रतिक्रिया से गठित हटा दें।
      ध्यान दें: प्रतिक्रिया आम तौर पर गैस विकास की समाप्ति के 30 मिनट के भीतर पूरा हो गया है। पूरा होने का एक और संकेत के रूप में, प्रतिक्रिया रंग पूरी तरह से भूरे रंग के लिए अपनी प्रारंभिक बैंगनी से बदल दिया जाएगा। इस बिंदु पर, उत्पाद निर्वात आसवन का उपयोग कर अलग किया जा सकता है; जानकारी के लिए संदर्भ 12 देखें। इस प्रोटोकॉल में, एक एक बर्तन, दो कदम 3 के प्रत्यक्ष संश्लेषण के लिए प्रक्रिया में वर्णित है।
    4. एन बी -TBS- -Cl-1,2-azaborine की तैयारी (3)
      1. टोल्यूनि में रिंग बंद उत्पाद (2) की प्रतिक्रिया समाधान करने के लिए, कार्बन (10% wt पी.डी., 13.2 mmol) पर 14.0 छ पैलेडियम जोड़ें।
      2. बॉक्स के एक कुप्पी निकालें और एक ओवन में सुखा 24/40 भाटा कंडेनसर कि नाइट्रोजन के साथ पर्ज किया गया है और ठंडा पानी के साथ सुसज्जित के साथ यह फिट बैठते हैं।
      3. प्रतिक्रिया गर्मी 135 डिग्री सेल्सियस पर एक जोरदार भाटा के लिए एक तेल स्नान का उपयोग करते समय क्रियाशीलता।
      4. 16 घंटे के लिए भाटा पर बनाए रखने के बाद, तेल स्नान से फ्लास्क को हटाने के द्वारा प्रतिक्रिया शांत। कमरे के तापमान को ठंडा करने पर, एक ओवन में सुखा Luer ताला सुई से लैस एक सिरिंज का उपयोग प्रतिक्रिया मिश्रण से एक 0.5 एमएल विभाज्य वापस ले लें। एक पेंच शीर्ष एनएमआर ट्यूब के लिए 0.5 एमएल विभाज्य स्थानांतरण 11 बी एनएमआर 12 के माध्यम से विश्लेषण करने के लिए।
        ध्यान दें: वांछित उत्पाद चोटी सीए में प्रकट होता है 35.5 पीपीएम 12 है, जबकि शुरू मेटरial चोटी CA पर प्रकट होता है। 42.9 पीपीएम 12। इस बिंदु पर आम तौर पर 11 बी एनएमआर इंगित करता प्रतिक्रिया अधूरा है, एक छोटी सी प्रारंभिक सामग्री चोटी के शेष के साथ।
      5. तो प्रतिक्रिया अधूरा है, एक दस्ताना बॉक्स में प्रतिक्रिया कुप्पी लाने और कार्बन (10% wt पी.डी., 2.82 mmol) पर एक अतिरिक्त 3.00 छ पैलेडियम जोड़ें।
      6. प्रतिक्रिया 1.3.2 और 1.3.3 के रूप में वर्णित शर्तों भाटा के Resubject।
      7. भाटा पर एक अतिरिक्त 24 घंटे के बाद, 11 बी एनएमआर द्वारा प्रतिक्रिया का एक और विभाज्य का विश्लेषण। इस बिंदु पर, प्रतिक्रिया पूरा किया जाना चाहिए।
      8. दस्ताना बॉक्स की प्रतिक्रिया कुप्पी स्थानांतरण और एक डिस्पोजेबल फ्लैश क्रोमैटोग्राफी स्तंभ कागज पोंछे के साथ पैक के माध्यम से प्रतिक्रिया मिश्रण से गुजरती हैं। टोल्यूनि की 50.0 एमएल के साथ धोने से छानना लीजिए।
      9. एक वैक्यूम गैस उच्च वैक्यूम के साथ सुसज्जित कई गुना पर बॉक्स के बाहर छानना से सभी वाष्पशील निकालें।
        नोट: वाष्पशील के हटाने 40 मिनट टी ले जा सकते हैंओ 90 मिनट वैक्यूम दबाव पर निर्भर करता है। वैक्यूम गेज अधिकतम दबाव लेगा, तो वह यह संकेत करता है विलायक को हटाने के पूरा हो गया है कि। जबकि विलायक को दूर करने, सुनिश्चित करें कि जल स्नान कुप्पी के नीचे गर्मी अपव्यय के लिए कमरे के तापमान पर रहता है बनाते हैं।
      10. एक दस्ताना बॉक्स में, हलचल पट्टी के साथ राउंड पेंदी वाले फ्लास्क एक ओवन में सूखे 24/40 250 एमएल में केंद्रित प्रतिक्रिया मिश्रण हस्तांतरण। एक पट के साथ कुप्पी कैप।
      11. जल्दी पट को हटाने और एक सुखाने एजेंट के रूप में 200 मिलीग्राम कैल्शियम हाइड्राइड जोड़ें।
      12. एक ओवन में सूखे 24/40 आसवन सिर एक थर्मामीटर के साथ संलग्न, एक प्राप्त 24/40 100 एमएल एयर नि: शुल्क संग्रहण कुप्पी और कच्चे उत्पाद युक्त 100 एमएल कुप्पी के साथ दूसरे पक्ष के साथ एक तरफ फिटिंग द्वारा आसवन उपकरण सेट करें। ठंडा पानी के साथ आसवन सिर से लैस। आसवन तंत्र के सभी जोड़ों के लिए तेल का प्रयोग करें।
        नोट: उत्पाद जब वाष्प तापमान एक तेल के साथ 1000 mTorr पर 65 करने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है चुलाना शुरू होता है90-100 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान स्नान। उत्पाद एक स्पष्ट बेरंग तरल है।
      13. गर्मी स्रोत को हटाने के द्वारा आसवन बंद करो और भंडारण करने से पहले कमरे के तापमान को शांत तंत्र। ठंडा होने पर, नाइट्रोजन के साथ तंत्र repressurize और कसकर हवा मुक्त भंडारण कुप्पी पर प्लग वाल्व बंद कर दें। -30 डिग्री सेल्सियस पर एक दस्ताना बॉक्स फ्रीजर में पृथक उत्पाद की दुकान।
        नोट: एक बर्तन, दो कदम प्रक्रिया के लिए उपज 52% है।

    चित्र 2
    चित्रा 2: एन -TBS- बी -Cl-1,2-azaborine की निगरानी गठन के लिए 11 बी एनएमआर स्पेक्ट्रा (3)। ए) एन एन -Allyl- -TBS-B-एलिल क्लोराइड अभिवर्तन (1), अंगूठी बंद करने metathesis के लिए सामग्री शुरू। बी) के 16 घंटे के बाद ऑक्सीकरण। (Unreacted एन -TBS- बी -Cl अंगूठी बंद उत्पाद (2) और isomerized बी -vinyl अंगूठी बंद उत्पाद (2) एन टीबीएस-बी-CL-1,2-azaborine के साथ (3) दिखाए जाते हैं।) सी) अतिरिक्त 24 घंटे के बाद ऑक्सीकरण। डी) पृथक उत्पाद (3) निर्वात आसवन द्वारा शुद्धि के बाद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    1. एन बी -H- -OBu-1,2-azaborine की तैयारी (4)
      1. एक दस्ताना बॉक्स में, को मापने के बाहर 4.00 जी एन टीबीएस -B- सीएल-1,2-azaborine (3) (17.6 mmol) एक ओवन में सुखा 100 एमएल दौर नीचे हलचल पट्टी के साथ फ्लास्क में और 35 एमएल acetonitrile जोड़ें। बाहर 1.14 छ acetamide (19.3 mmol) उपाय और प्रतिक्रिया कुप्पी के लिए स्थानांतरण। एक रबर पट साथ कुप्पी सील।
      2. बॉक्स से प्रतिक्रिया कुप्पी निकालें और एक ओ के साथ फिटVen-सूखे 24/40 भाटा कंडेनसर कि नाइट्रोजन के साथ पर्ज किया गया है और ठंडा पानी के साथ सुसज्जित है।
      3. प्रतिक्रिया गर्मी सरगर्मी के साथ एक तेल स्नान में 85 डिग्री सेल्सियस पर भाटा के लिए।
      4. भाटा पर 3 घंटे के बाद, तेल स्नान से फ्लास्क को हटाने के द्वारा प्रतिक्रिया शांत। कमरे के तापमान को ठंडा करने पर, एक वैक्यूम गैस उच्च वैक्यूम के साथ सुसज्जित कई गुना पर विलायक हटा दें।
      5. वैक्यूम के अंतर्गत वाष्पशील हटाने के बाद, 15.0 एमएल THF में प्रतिक्रिया अवशेषों redissolve। इस समाधान के लिए n -butanol (35.1 mmol) की 3.21 एमएल जोड़ने।
      6. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया हिलाओ।
      7. एक वैक्यूम गैस उच्च वैक्यूम कच्चे तेल उत्पाद प्राप्त करने के साथ सुसज्जित कई गुना पर विलायक निकालें।
      8. एक दस्ताना बॉक्स में, सिलिका जेल कॉलम क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से उत्पाद को अलग-थलग, पैंटेन और Diethyl ईथर के मिश्रण का प्रयोग (5: 1) eluent के रूप में। के रूप में शुद्ध उत्पाद प्राप्त करने के लिए एक वैक्यूम गैस उच्च वैक्यूम के साथ सुसज्जित कई गुना का उपयोग कर उत्पाद युक्त अंशों से वाष्पशील हटायेएक सफेद ठोस।
        ध्यान दें: उपज 82% से 87% करने के लिए भिन्न हो सकते हैं।
    2. एन बी -H- -ethyl-1,2-azaborine की तैयारी (5)
      1. एक दस्ताना बॉक्स में, कोई हलचल पट्टी के साथ 1.00 जी एन एच -B- एक ओवन में सुखा 100 एमएल दौर नीचे फ्लास्क में Obu-1,2-azaborine (4) (6.62 mmol) बाहर मापने के लिए और जोड़ने के 25 एमएल एट 2 ओ सील एक वैक्यूम गैस कई गुना पर एक रबर पट और एन 2 के तहत जगह के साथ कुप्पी।
      2. एक अलग ओवन में सुखा 100 एमएल दौर नीचे कुप्पी में, नाइट्रोजन वातावरण के तहत ethyllithium समाधान (बेंजीन / cyclohexane में 0.5 एम, 13.2 mmol) की 26.5 एमएल जोड़ने। ethyllithium अभिकर्मक से विलायक (बेंजीन / cyclohexane) का मिश्रण निकालें वांछित azaborine उत्पाद को अलग-थलग साथ मुद्दों से बचने के लिए। 13.0 एमएल एट 2 ओ में ठोस ethyllithium redissolve
        नोट: सावधानी: फिनाइललिथियम pyrophoric (हवा या पानी के साथ संपर्क पर ignitable) कर रहे हैं। वांछित उत्पाद (5
      3. प्रतिक्रिया एक ठंडा स्नान के साथ 4 -30 डिग्री सेल्सियस से युक्त कुप्पी कूल।
      4. -30 डिग्री सेल्सियस पर प्रवेशनी हस्तांतरण के माध्यम से प्रतिक्रिया फ्लास्क ethyllithium समाधान जोड़ें। 1 घंटे के लिए इस तापमान पर सरगर्मी रखें और इसे करने के लिए धीरे-धीरे कमरे के तापमान को गर्म अनुमति देते हैं।
      5. 11 बी एनएमआर द्वारा प्रतिक्रिया की निगरानी। (वांछित मध्यवर्ती चोटी सीए 39.8 पीपीएम पर प्रकट होता है।)
      6. प्रतिक्रिया पूरा होने पर, -30 डिग्री सेल्सियस की प्रतिक्रिया शांत और 6.62 एमएल एचसीएल समाधान (ईटी 2 ओ में 2.0 एम, 13.2 mmol) जोड़ें। 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया हिलाओ यह करने के लिए धीरे-धीरे कमरे के तापमान को गर्म की इजाजत दी है।
      7. एक वैक्यूम गैस कच्चे तेल उत्पाद मिश्रण प्राप्त करने के लिए कम निर्वात (20-25 Torr) के साथ सुसज्जित कई गुना पर विलायक निकालें।
      8. एक दस्ताना बॉक्स में,सिलिका जेल कॉलम क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से उत्पाद को अलग-थलग, eluent के रूप में 2-methylbutane का उपयोग कर। एक वैक्यूम गैस एक रंगहीन तरल के रूप में शुद्ध उत्पाद प्राप्त करने के लिए एक तनु वैक्यूम से लैस कई गुना पर अस्थिर निकालें।
        ध्यान दें: उपज 56% है।

    2. प्रोटीन तैयारी और टी -4 Lysozyme म्यूटेंट के क्रिस्टलीकरण

    1. प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि
      1. ई कोलाई RR1 कोशिकाओं subcloned plasmids (L99A या L99A / M102Q) 17, 20 200 एमएल लेग में (Lysogeny शोरबा) मीडिया 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 40.0 मिलीग्राम एम्पीसिलीन के साथ पूरक के साथ बदल बढ़ें।
        नोट: लेग मीडिया की रचना 12 ग्राम tryptone, 5 ग्राम खमीर निकालने, 10 ग्राम सोडियम क्लोराइड, और प्रति 1 एलएच 2 ओ 1 ग्राम ग्लूकोज है
      2. रातोंरात संस्कृति के 160 एमएल के साथ टीका लगाना 4.00 एल लेग मीडिया (800 मिलीग्राम एम्पीसिलीन के साथ पूरक) और एक filtere के साथ 240 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेतेघ हवा की आपूर्ति।
      3. जब ऑप्टिकल घनत्व 600 एनएम पर 0.7 पहुंचता है, इनक्यूबेटर से हटाने से कमरे के तापमान को जीवाणु संस्कृति शांत।
      4. एक शंक्वाकार centrifugation ट्यूब में बाहर उपाय isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (0.7 मिमी के अंतिम एकाग्रता) के 695 मिलीग्राम और भंग करने के लिए 4 एमएल लेग मीडिया जोड़ें।
      5. प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए संस्कृति IPTG समाधान जोड़ें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 21 घंटे के लिए 110 rpm पर संस्कृतियों सेते हैं।
      6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 4412 XG पर संस्कृति अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 0.1 एम सोडियम फास्फेट (6.6 पीएच), 0.2 एम NaCl के 300 एमएल में गोली resuspend और 0.5 एम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (पीएच 8.0) के 30.0 एमएल जोड़ने। 4 डिग्री सेल्सियस पर 17 घंटे के लिए निलंबन हिलाओ।
      7. निलंबन के लिए deoxyribonuclease के 1.0 एम 2 MgCl और 0.500 एमएल मैं (DNase मैं) की 30.0 एमएल जोड़ें और 8 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हलचल।
      8. 4 पर 30 मिनट के लिए 30,913 XG पर lysed सेल निलंबन अपकेंद्रित्र 76, सी। व्यक्त प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला लीजिए और गोली त्यागें।
      9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिमी सोडियम फॉस्फेट (पीएच 6.5 L99A के लिए और L99A / M102Q के लिए पीएच 6.3) के खिलाफ lysate Dialyze रात भर।
      10. धो लें और एक कॉलम में संतुलन बफर (50 मिमी Tris, 1 मिमी EDTA (पीएच 7.3)) के साथ carboxymethyl आयन एक्सचेंज मोती का 20.0 एमएल संतुलित करना। मोती पर समाधान युक्त प्रोटीन लोड और संतुलन बफर के 100 एमएल के साथ स्तंभ धो। संतुलन बफर के भीतर 300 मिमी NaCl के 600 एमएल रैखिक ढाल के साथ स्तंभ Elute।
      11. स्तंभ शुद्धि के लिए एक कम दबाव क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का प्रयोग करें। 1 एमएल / मिनट की दर पंप का प्रयोग करें और 10 एमएल के भिन्न इकट्ठा। शुद्ध प्रोटीन युक्त अंशों इकट्ठा।
        नोट: क्षालन के दौरान प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के 280 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) की निगरानी। एसडीएस पृष्ठ से प्रत्येक अंश की शुद्धता निर्धारित और केवल शुद्ध अंशों इकट्ठा।
    "Fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> आकृति 1
    चित्रा 3: टी -4 लाइसोजाइम उत्परिवर्ती L99A / M102Q की शुद्धि के लिए प्रोटीन प्रतिनिधि परिणाम है। ए) chromatogram 280 एनएम (नीली रेखा) और एमएस / सेमी (लाल रेखा में चालकता पर ए.यू. में मापा यूवी absorbance दिखा)। भिन्न 20-23 संयुक्त थे और पवित्रता एसडीएस पृष्ठ द्वारा निर्धारित किया गया था। बी) 15% एसडीएस पृष्ठ 18.6 केडीए पर अंशों 20-23 का शुद्ध प्रोटीन की उपस्थिति दिखा जेल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    1. प्रोटीन क्रिस्टलीकरण
      1. एक डायलिसिस झिल्ली ट्यूबिंग (12,000 14,000 MWCO) को शुद्ध प्रोटीन समाधान स्थानांतरण। डायलिसिस ट्यूबिंग एक बीकर 100 मिमी सोडियम फास्फेट, 550 मिमी NaCl, 0.02% NaN 3 (L99A के लिए पीएच 6.5 और एल के लिए पीएच 6.3 से 4.00 एल युक्त में रखें99A / M102)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 एल समाधान रात भर हिलाओ।
      2. 2-मर्केप्टोइथेनाल (5 मिमी के अंतिम एकाग्रता) dialyzed नमूना में जोड़ें और ~ 40.0 मिलीग्राम / एमएल एक केन्द्रापसारक concentrator (10,000 MWCO) का उपयोग ध्यान केंद्रित। 280 एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण। क्रिस्टलीकरण से पहले कताई द्वारा किसी भी वेग निकालें।
      3. प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए वाष्प-प्रसार फांसी ड्रॉप विधि का प्रयोग करें। एक siliconized गिलास को कवर स्लाइड पर जलाशय समाधान (2.0-2.2 एम सोडियम / पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 6.7-7.1, 50 मिमी 2-मर्केप्टोइथेनाल, 50 मिमी 2-hydroxyethyl डाइसल्फ़ाइड) के 5.00 μL के साथ केंद्रित प्रोटीन समाधान के मिश्रण 5.00 μL।
      4. कवर स्लाइड प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त जलाशय समाधान के शीर्ष पर उल्टा रखकर जलाशय समाधान के 1.00 एमएल के खिलाफ मिश्रण बूंद संतुलित करना। तेल का उपयोग कसकर स्लाइड के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक सील करने के लिए। 2.2.3 में उल्लेख जलाशय समाधान के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर विभिन्न परिस्थितियों सेट करें।क्रिस्टल विकास के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली स्टोर।
        नोट: क्रिस्टल सामान्य रूप से कवर स्लाइड पर equilibrated बफर में 1-2 सप्ताह के भीतर हो जाना। कदम 2.2.3 में जलाशय समाधान के साथ प्रोटीन समाधान मिश्रण के दौरान तत्काल वर्षा क्रिस्टलीकरण की विफलता को इंगित करता है।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: टी -4 लाइसोजाइम उत्परिवर्ती L99A के क्रिस्टल ligands के साथ Complexation से पहले के प्रतिनिधि तस्वीर। क्रिस्टल मां शराब में हैं (2.1 एम सोडियम / पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 6.9, 50 मिमी 2-मर्केप्टोइथेनाल, 50 मिमी 2-hydroxyethyl डाइसल्फ़ाइड)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    1. जटिल तैयारी
      1. एक क्रायोजेनिक ट्यूबिंग एक पाश में आकार का उपयोग करते हुए क्रिस्टल उठाओ (देखें माल की सूची) औरउन्हें एक 0.6 एमएल microcentrifuge ट्यूब में जगह है। मां शराब की 50.0 μL ट्यूब को जोड़ने सूखापन से बचने और क्रिस्टल संरक्षित करने के लिए।
        नोट: एकल क्रिस्टल चयन एक माइक्रोस्कोप का उपयोग द्वारा सहायता प्राप्त है।
      2. एक दस्ताना बॉक्स में क्रिस्टल युक्त ट्यूब स्थानांतरण। ट्यूब के स्नैप-टोपी के अंदर azaborine ligand (5) और जगह के 5.00 μL ले लो। कैप और एक रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) वाष्प प्रसार द्वारा संतुलन के लिए 2-7 दिनों के लिए दस्ताने बॉक्स के अंदर में ट्यूब की दुकान।
        नोट: azaborine ligand (5) के भौतिक गुणों (उच्च अस्थिरता और जलीय घोल में घुलनशीलता) वाष्प प्रसार विधि के माध्यम से preformed प्रोटीन क्रिस्टल के साथ complexation सक्षम बनाता है।
      3. एक क्रायोजेनिक ट्यूबिंग एक गिलास तरल नाइट्रोजन में फ्लैश ठंड से पहले एन paratone की एक छोटी बूंद युक्त स्लाइड के लिए एक पाश में आकार का उपयोग करते हुए क्रिस्टल स्थानांतरण। पर क्रिस्टल डूबनेवाला द्वारा क्रिस्टल एन paratone और तेजी से फ्लैश फ्रीज के साथ रक्षा चुनेंएक देवर तरल नाइट्रोजन युक्त में पाश। एक क्रायोजेनिक टोंग का उपयोग करके पाश पर क्रिस्टल माउंट।
      4. एक क्रिस्टल सिंक्रोटॉन विकिरण का उपयोग करने का डेटा सेट ले लीजिए। प्रकाशित संरचनाओं 20, 24 का उपयोग कर आणविक प्रतिस्थापन प्रदर्शन; इलेक्ट्रॉन घनत्व की एक संयुक्त राष्ट्र मॉडलिंग की बूँद से प्रोटीन बाध्यकारी साइट के अंदर ligand के अस्तित्व की पुष्टि।

    चित्रा 5
    चित्रा 5: टी -4 लाइसोजाइम उत्परिवर्ती L99A के परमाणु मॉडल इलेक्ट्रॉन घनत्व के साथ बाध्यकारी जेब। ए) बाध्यकारी साइट में एक संयुक्त राष्ट्र मॉडलिंग की इलेक्ट्रॉन घनत्व बूँद के साथ L99A गुहा। ख) दो विकल्प conformers में मॉडलिंग azaborine ligand 5 के साथ L99A गुहा। सीएल कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां Ick।

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Representative Results

1,2-azaborines के लिए योजनाबद्ध सिंथेटिक मार्ग चित्र 1 में दिखाया गया है। इस प्रोटोकॉल पाँच अलग अलग अणुओं बोरान नाइट्रोजन युक्त के संश्लेषण के लिए लागू होता है। चित्रा 2 11 बी एनएमआर स्पेक्ट्रा 1.3 चरण के दौरान मापा वांछित उत्पाद (3) के गठन की निगरानी के लिए प्रतिनिधित्व करता है। प्रोटीन शुद्धि कम दबाव क्रोमैटोग्राफी प्रणाली और एक प्रतिनिधि वर्णलेख 3 चित्र में दिखाया गया है का उपयोग करके किया गया था। एकत्र भिन्न की पवित्रता एसडीएस पृष्ठ द्वारा निर्धारित किया गया था। टी -4 लाइसोजाइम उत्परिवर्ती L99A के कण चित्रा 4 में चित्रित कर रहे हैं। चित्रा 5 संयुक्त राष्ट्र के मॉडलिंग की इलेक्ट्रॉन घनत्व और ligand 5 बाध्य साथ शोधन के बाद बाध्यकारी गुहा के साथ L99A बाध्यकारी जेब से पता चलता है।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के पहले भाग में, हम 1,2-azaborines पहले से सूचना दी तरीकों 12, 13 के आधार पर संशोधित संश्लेषण का वर्णन किया। Triallylborane 22 allyltriphenyl टिन या पोटेशियम allyltrifluoroborate का उपयोग कर तैयार करने के लिए मार्गों के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया गया था एन एन -allyl- -TBS- बी -allyl क्लोराइड अभिवर्तन (1)। इस विधि में एक और अधिक परमाणु किफायती और पर्यावरण के अनुकूल दृष्टिकोण के लिए अनुमति देता है। एन बी -TBS- -Cl-1,2-azaborine (3) के संश्लेषण के लिए, एक एक बर्तन, दो कदम अनुक्रम (रिंग ऑक्सीकरण द्वारा पीछा किया metathesis बंद करने) नियुक्त किया गया था, जो पिछले की तुलना में अधिक अलग-थलग उपज में हुई मध्यवर्ती (2) (52% बनाम दो चरणों में 29%) के अलगाव से जुड़े विधि। (हालांकि, अभिवर्तन (1) की शुद्धता पर निर्भर करता है, रिंग बंद कर दिया उत्पाद के अलगाव से पहले ऑक्सीकरण कदमनिर्वात आसवन का उपयोग आवश्यक हो सकता है। इस मामले में, टोल्यूनि के स्थान के रूप में विलायक क्लोराइड का उपयोग कर समय) वाष्पशील को हटाने के आसवन से पहले। मॉनिटरिंग 11 बी एनएमआर (चित्रा 2) के लिए ऑक्सीकरण चरण के दौरान इस में इस्तेमाल पीडी / सी की कुल मात्रा में कमी में भी लाभ कम कर देता है प्रतिक्रिया (7 मोल% बनाम 15 मोल%)।

एन बी -H- -ethyl-1,2-azaborine (5) के संश्लेषण पहले की रिपोर्ट multistep अनुक्रम 16 है कि एक क्रोमियम परिसर के उपयोग की आवश्यकता के स्थान पर ethyllithium का उपयोग कर 4 से दो चरणों में पूरा किया गया। अलगाव उत्पाद की अस्थिरता के कारण आवश्यक सटीक तापमान नियंत्रण और तनु-वैक्यूम हेरफेर। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत तकनीक भी अन्य अस्थिर यौगिकों की शुद्धि के लिए लागू किया जा सकता है।

दूसरे भाग में, हम प्रोटीन शुद्धि और क्रिस्टल complexation प्रदर्शनटी -4 लाइसोजाइम म्यूटेंट L99A और L99A / M102Q की। ई कोलाई RR1 तनाव और प्रेरण IPTG का उपयोग करने में एक मानक प्रोटीन अभिव्यक्ति, वांछित प्रोटीन की रासायनिक सेल afforded अलगाव द्वारा पीछा किया। यह हर कदम की सफलता की पुष्टि या असफल प्रक्रिया की पहचान के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति और सेल के बाद एसडीएस पृष्ठ को चलाने की सलाह दी है। L99A टी -4 लाइसोजाइम के लिए, व्यक्त प्रोटीन अपनी गतिविधि के कारण दोनों सतह पर तैरनेवाला और गोली में पाया जा सकता है बैक्टीरियल कोशिकाओं lyse करने के लिए। इस मामले में, सतह पर तैरनेवाला में प्रोटीन 20 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर के खिलाफ dialyzed और स्तंभ शुद्धि के लिए सेल से lysate के साथ जोड़ा जा सकता है। प्रेरण की स्थिति (37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए 21 घंटे से 25 डिग्री सेल्सियस पर) उच्च तापमान और कम समय के लिए समायोजित किया जा सकता है। सेल भी एक बर्फ स्नान के साथ sonication का उपयोग overheating रोकने के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। Carboxymethyl एक 300 मिमी NaCl रैखिक ढाल के साथ आयन एक्सचेंज स्तंभ प्रोटीन शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया गया था। केवल> 95% शुद्ध (एस के आधार परडी एस पृष्ठ) प्रोटीन भिन्न एकत्र की है और प्रोटीन क्रिस्टलीकरण में इस्तेमाल किया गया।

प्रोटीन समाधान ध्यान केंद्रित करने से पहले, dialyzed प्रोटीन के लिए 2-मर्केप्टोइथेनाल (5 मिमी के अंतिम एकाग्रता) (कदम 2.2.2) के अलावा, इसकी सहज वर्षा को रोकने के लिए जरूरी हो गया था विशेष रूप से L99A / M102Q प्रोटीन है जो उच्च वेग में आसानी से करने के लिए जाता लिए एकाग्रता। 5 के साथ प्रोटीन complexation आवश्यकता के रूप में एक एयर-मुक्त वातावरण, प्रोटीन ligand परिसर में एक दस्ताना बॉक्स में तैयार किया गया था। गुहा-bearingT4 लाइसोजाइम म्यूटेंट: इस प्रोटोकॉल में तैयार माल एक जैविक मॉडल प्रणाली में 1,2-azaborines के अध्ययन के बंधन में इस्तेमाल किया गया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% Sigma Aldrich 34865
Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free Sigma Aldrich 309966
Methylene chloride  (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) Fisher D37-20
Toluene Fisher T290-4
Pentane, HPLC Fisher P399-4
Acetonitrile Fisher A21-4
Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% Sigma Aldrich 208027 Pyrophoric
Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd Strem 46-1900
1.0 M Boron trichloride solution in hexane Sigma Aldrich 211249 Highly toxic/Pyrophoric
Triethylamine, ≥99.5% Sigma Aldrich 471283
Grubbs 1st generation catalyst  materia C823
Acetamide Sigma Aldrich A0500
n-Butanol, anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 281549
Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane Sigma Aldrich 561452 Highly toxic/ Pyrophoric
HCl solution, 2.0 M in Et2O Sigma Aldrich 455180
2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% Sigma Aldrich 277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) ATCC 31343
T4 lysozyme WT* (L99A) Addgene 18476
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) Addgene 18477
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A0166
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Invitrogen AM9464
Sodium phosphate monobasic anhydrous Fisher BP329
Sodium Phosphate dibasic anhydrous Fisher BP332
Sodium chloride Fisher S642212 
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BP118
Magnesium chloride Sigma Aldrich M4880 Corrosive
Thermo scientific pierce DNaseI Fisher PI-90083
GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media Fisher 45-002-931
Tris-base Fisher BP152-500 
Sodium azide TCI S0489 Highly toxic
2-Mercaptoethanol Fisher ICN806443 
Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators Fisher 14-558-501
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
2-Hydroxyethyl disulfide Sigma Aldrich 380474
N-paratone  Hampton Research HR2-643
4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO  Fisher 08-667E
 CryoLoop Hampton Research cryogenic tubing shaped into a loop
CryoTong Thermo Fisher cryogenic tong
Coot Electron density images are generated from the software

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References

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1,2-Azaborines के संश्लेषण और टी -4 Lysozyme म्यूटेंट के साथ उनके प्रोटीन परिसरों की तैयारी
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Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of… More

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants. J. Vis. Exp. (121), e55154, doi:10.3791/55154 (2017).

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